基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉及基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置。

背景技术

功能性便秘(Functional constipation，简称便秘)是临床上常见的胃肠道功能性疾病。临床症状主要表现为排便次数减少(<3次/周)/粪便干硬及排便困难，其中慢性便秘的病程≥6个月。在我国，成人慢性便秘的患病率约为4％-6％，而60岁以上老年人便秘患病率高达22％。便秘诊断及等级划分标准主要依据罗马Ⅲ便秘诊断标准，主要采用的是问询沟通式，影像学检查，尚未有分子生物学水平的精准便秘评估方法。

肠道细菌约占粪便体积的50％。不同疾病类型患者，其肠道微生物竞争生长环境条件存在差异，故而可以粪便中各类细菌含量来反应肠道菌群分布情况。研究发现，与健康人比较，便秘患者肠道细菌在菌群丰度明显降低、菌落稳态急剧改变；便秘患者中有益菌含量降低，而有害菌和致病菌含量显著升高。因此，以便秘相关肠道细菌作为便秘诊断的新型标志物，更加客观直接反应肠道状态，且可为粪菌移植治疗方案的选择提供科学的临床指标。

因此，本领域迫切需要开发一种适用于临床的基于肠道菌评估便秘的方法及装置。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置。

在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括选自下组两种或多种的生物标志物：拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物集合用于评估便秘风险及便秘程度，或用于制备一试剂盒或试剂，所述的试剂盒或试剂用于评估待测对象的便秘风险(易感性)或诊断(包括早期诊断和/或辅助诊断)待测对象便秘程度。

在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于评估便秘风险及便秘程度的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物集合为用于评估便秘风险及便秘程度的生物标志物集合，还包括选自下组的生物标志物：厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。

在另一优选例中，所述的集合包括选自表A的生物标志物：

表A

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b10。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1-b5和选自子集Y的生物标志物，其中子集Y由生物标志物b6-b10构成。

在另一优选例中，所述的集合还包括生物标志物：厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。

在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源于粪便。

在另一优选例中，通过PCR对各个生物标志物进行检测。

在另一优选例中，所述PCR包括QPCR、或RT-QPCR。

在另一优选例中，所述的集合用于评估便秘风险及便秘程度。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘患病风险包括便秘的早期筛查。

在本发明的第二方面，提供了一种用于评估便秘风险及便秘程度的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测如本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括如本发明第一方面所述的集合和/或如本发明第二方面所述的试剂组合。

在另一优选例中，如本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载：当待测对象粪便样本中生物标志物的评估值>-1.5时标记为基本正常；当评估值在-4～-1.5范围内时，标记为轻度失衡；当评估值在-6.5～-4范围内时，标记为中度失衡，当评估值<-6.5时，标记为重度失衡。

在本发明的第四方面，提供了一种生物标志物集合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的便秘风险或待测对象的便秘程度，其中，所述生物标志物集合包括选自下组的两种或多种生物标志物：拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。

在另一优选例中，当用于评估待测对象的便秘风险或待测对象的便秘程度时，所述生物标志物集合还包括选自下组的生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的评估包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，用PCR方法对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)根据评价体系对步骤(1)测得的水平进行评价；

在另一优选例中，所述PCR方法对肠道细菌进行的检测包括生物标志物b1-b10及作为内参的广谱细菌的16SrDNA。

在另一优选例中，所述的评价体系包含有无便秘病史、便秘相关肠道细菌在人群中所占位置的综合评价指标。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：肠杆菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、哈撒魏氏梭菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物降低，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，生物标志物在人群中所占比例高于75％的正常人群范围标记为偏高，低于25％的正常人群标记为偏低，在25％-75％之间标记为正常。

在另一优选例中，所述的样品选自粪便。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。

在本发明的第五方面，提供了一种评估待测对象的便秘风险及便秘程度的方法，包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，用PCR方法对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)根据评价体系对步骤(1)测得的水平进行评价；

在另一优选例中，所述PCR方法对肠道细菌进行的检测包括生物标志物b1-b10及作为内参的广谱细菌的16SrDNA。

在另一优选例中，所述的评价体系包含有无便秘病史、便秘相关肠道细菌在人群中所占位置的综合评价指标。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：肠杆菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、哈撒魏氏梭菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物降低，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，生物标志物在人群中所占比例高于75％的正常人群范围标记为偏高，低于25％的正常人群标记为偏低，在25％-75％之间标记为正常。

在另一优选例中，所述的样品选自粪便。

在本发明的第六方面，提供了一种筛选评估便秘风险及便秘程度的候选化合物的方法，包括步骤：

(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中集合中各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述集合中各个生物标记物的水平V2；

(2)对上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗便秘的候选化合物，其中所述集合包括两种或多种选自下组的生物标志物：b1-b5。

在另一优选例中，所述还包括：b6-b10。

在另一优选例中，所述还包括：厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。

在另一优选例中，所述的待测对象患有便秘。

在另一优选例中，如果一个或多个选自子集H的生物标志物的水平V1显著低于水平V2，表明测试化合物为治疗便秘的候选化合物，

其中子集H包括生物标志物：肠杆菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、哈撒魏氏梭菌。

在另一优选例中，所述“显著低于”指水平V1/水平V2的比值≤0.8，较佳地≤0.6，更佳地，≤0.4。

在另一优选例中，如果一个或多个选自子集H的生物标志物的水平V1显著高于水平V2，表明测试化合物为治疗便秘的候选化合物，

其中子集H包括生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌。

在另一优选例中，所述“显著高于”指水平V1/水平V2的比值≥2，较佳地≥3，更佳地，≥4。

在本发明的第七方面，提供了一种生物标志物集合的用途，用于筛选评估便秘风险及便秘程度的候选化合物和/或用于评估候选化合物对便秘的治疗效果，其中，所述生物标志物集合选自下组的两种或多种的生物标志物：拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、或其组合。

在另一优选例中，所述生物标志物还包括：厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。

在本发明的第八方面，提供了一种便秘早期辅助筛查系统，所述系统包括：

(a)便秘相关疾病特征输入模块，所述便秘相关疾病特征输入模块用于输入某一对象的便秘相关疾病特征；

其中所述的便秘相关疾病特征包括选自下组A的2种或多种：拟杆菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌、肠杆菌属、哈撒魏氏梭菌、或其组合。

(b)便秘相关疾病判别处理模块，所述处理模块对于输入的便秘相关疾病特征，按预定的判断标准进行评分处理，从而获得风险度评分；并且将所述风险度评分与便秘相关疾病的风险度阈值进行比较，从而得出辅助筛查结果，其中，当所述风险度评分高于所述风险度阈值时，则提示该对象患便秘相关疾病的风险高于正常人群；当所述风险度评分低于所述风险度阈值时，则提示该对象患便秘相关疾病的风险高于正常人群；和

(c)辅助筛查结果输出模块，所述输出模块用于输出所述的辅助筛查结果。

在另一优选例中，所述的便秘相关疾病特征还包括选自下组B：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、普雷沃菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的便秘相关疾病特征还包括选自下组C：厚壁菌门、大肠杆菌、粪肠球菌属、丁酸梭菌、史氏甲烷短杆菌、罗氏弧菌、另枝菌。

在另一优选例中，所述的对象是人。

在另一优选例中，所述的对象包括婴幼儿、青少年或成年人。

在另一优选例中，在所述处理模块中，如下进行风险度评分处理：

在另一优选例中，所述的评分包括(a)单个特征的评分；和/或(b)多个特征的评分之和。

在另一优选例中，所述的特征输入模块选自下组：粪便采集仪、细菌基因组核酸提取装置、QPCR定量检测装置。

在另一优选例中，所述的便秘相关疾病的判别处理模块包括一处理器，以及一储存器，其中所述的储存器中存储有基于便秘相关疾病特征的便秘相关疾病的风险度阈值数据。

在另一优选例中，所述的输出模块包括报告系统。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法。利用便秘相关细菌失衡程度与便秘严重程度的相关性，使得肠道中便秘相关细菌含量可作为便秘评估的标志物，通过检测粪便中便秘相关细菌包括益生菌(双歧杆菌属、乳酸杆菌属)、便秘负相关菌(拟杆菌属、普雷沃菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌)、便秘正相关菌(肠杆菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、哈撒魏氏梭菌)的含量，用于便秘相关肠道细菌失衡程度评估。在此基础上完成了本发明。

评估值

对便秘相关肠道细菌异常程度进行评估的数值。其中，肠道细菌变化不利于肠道健康的为负分，肠道细菌变化有利于肠道健康的为正分。每种细菌根据其与便秘的相关性强度占据不同的评估系数。全部细菌的分值之和及临床诊断是否为便秘之和总分值即评估值。

评估方法

在另一优选例中，本发明方法可通过公式S＝W1S1+W2S2+W3S3+……W11S11计算加权综合评分；

其中，W1、W2……W11为权重；

S1、S2……S11为每个待分析因子的评分。

易感人群的S_subject'＝W1'S1'+W2'S2'+W3'S3'+……W11'S11'。

当某一标志物(便秘正相关)的Fold change＞预定阈值(如，该菌相对含量在健康人群中所处水平高于75％)时，则该标志物的相应评分记为-1(异常)，否则记为0(正常)；当某一标志物(便秘负相关及益生菌)的Fold change＞预定阈值(如，该菌相对含量在健康人群中所处水平高于75％)时，则该标志物的相应评分记为1(正常，有益)；Fold change<预定阈值(如，该菌相对含量在健康人群中所处水平低于25％)时，则该标志物的相应评分记为-1(异常)；否则记为0(正常)

当S_subject'≧-1.5时，则表明该对象肠道菌群基本正常，便秘风险较低；

当-4≦S_subject'＜-1.5时，则表明该对象肠道菌群轻度失衡，有轻度便秘风险；

当-6.5≦S_subject'＜-4时，则表明该对象肠道菌群中度失衡，有一定程度便秘风险或中度便秘；

当S_subject'≦-6.5时，则表明该对象肠道菌群重度失衡，便秘风险较高或重度便秘；

本发明的实验结果表明，本发明的标志物可显著提高便秘相关疾病诊断的准确性。

评估待测对象的便秘风险及便秘程度的方法

(1)提供一来源于待测对象的样品，用PCR方法对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)根据评价体系对步骤(1)测得的水平进行评价；

在另一优选例中，所述PCR方法对肠道细菌进行的检测包括生物标志物b1-b10及作为内参的广谱细菌的16SrDNA。

在另一优选例中，所述的评价体系包含有无便秘病史、便秘相关肠道细菌在人群中所占位置的综合评价指标。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：肠杆菌属、直肠真杆菌、韦荣氏菌、哈撒魏氏梭菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，两个或多个选自子集H的生物标志物降低，表明待测对象具有便秘风险。

其中子集H包括生物标志物：双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属、普拉梭菌、阿克曼氏菌。

在另一优选例中，通过PCR法对各个生物标志物进行鉴定，优选QPCR。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的便秘风险的早期筛查。

在另一优选例中，生物标志物在人群中所占比例高于75％的正常人群范围标记为偏高，低于25％的正常人群标记为偏低，在25％-75％之间标记为正常。

在另一优选例中，所述的样品选自粪便。

本发明的主要优点包括：

1)本发明首次以肠道微生物做为便秘评估的标志物，实现了从微生物水平对便秘进行评估；

2)本发明以肠道中便秘相关的细菌为靶点，采用荧光PCR技术快速高效检测细菌相对含量，在便秘临床诊断中具备客观、及时、快速准确等优势，可辅助临床医生有针对性的选择制定最佳治疗方案，大幅度缩短患者治疗周期，早日恢复肠道健康；

3)依据本发明提供的便秘评估分值进行便秘相关肠道细菌失衡程度等级划分，可为现阶段粪菌移植方法治疗便秘提供有力的科学依据，对弥补便秘治疗方案选择依据的空白具有划时代意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.

提供了一种QPCR检测健康人和便秘患者肠道菌评估便秘的方法，具体测定方法如下所述：

1.1试剂或材料

1)PBS缓冲液或生理盐水。

2)细菌基因组DNA提取试剂(天隆，Ex-DNA细菌基因组提取试剂盒，型号：ZTLYX)。

3)RNA-free水。

4)2×Glodstar(康维世纪)。

5)SYBR GreenⅠ(天根生物)。

6)待测细菌引物及内参引物(表1)。

表1

1.2提供粪便样品

粪便样本(45例健康志愿者、15例便秘患者)的收集：收集约300-500mg粪便放入粪便样本采集管，加入核酸保护液，颠倒数次以便充分混匀。样本采集管-80℃保存，待用。

1.3提取粪便中细菌基因组DNA

1.3.1富集粪便中细菌：

将粪便采集管中的样本置于生物安全柜/超净工作台中室温解冻后，颠倒混匀，使粪便采集管中的DNA保护液充分混匀；

由取集管下端黄色帽子，将混匀后的粪便样本取月约200mg置于1.5ml离心管中；

加入1ml PBS，剧烈震荡均匀后500rpm离心5min，收集上清至2ml离心管中；重复此步骤2次(注：此步骤去上清时应避免取到沉淀，离心不能完全沉淀，可采用静置方法自然沉降；另若上清液浊度较高说明取样量过大，需先进行样本稀释再取适量进行离心)；将收集的全部上清液5000rpm离心10min；

沉淀中加入180ul溶菌酶溶液和20ul蛋白酶K溶液，充分涡旋混匀后50℃水浴30min以上(30-50min)，水浴结束后瞬时离心，向离心管中加入200ul菌体消化液，充分混匀后待用。

1.3.2提取核酸：

参考天隆Ex-DNA细菌基因组—核酸提取或纯化试剂使用说明书。实验结束后将提取的核酸转移至1.5ml离心管中-20℃保存。

1.3.3核酸浓度检测：

提取后的核酸采用NanoDrop对核酸浓度进行定量，加RNAfree水将核酸浓度稀释至5-50ng/ul之间，-20℃保存。

1.4细菌相对含量检测

1.4.1实验设计：

每个样本检测10种细菌，另含1个内参16sDNA；每个96孔板加一个水对照样本；可在96孔板的格式纸上填写实验的样品和引物，以便对照加样。

1.4.2加样：

PCR反应体系：

表2

根据PCR反应体系及实验设计表格进行加样。

1.4.3PCR扩增：

将96孔板放入Real-Time PCR仪的托盘上，关上托盘。打开7500Software v2.0.5软件，按照96孔板格式纸上的内容，一一对应，设置每孔的样品和引物，其中target为引物，sample为样品。

反应程序为：

备注：★表示在此步要采集荧光信号；溶解曲线中从60℃到95℃的升温过程中每0.3℃采集一次荧光信号。

运行开始。(注意：等PCR仪的托盘上移，仪器开始运行时，才可以离开-----此时可根据仪器上显示的总程序时间初步判断反应程序有没有设置错误。)

1.5结果判断

1.5.1样品溶解曲线峰型单一，溶解温度与验证时相近，复孔CT值标准差不超过0.2。

1.5.2阴性对照没有起峰；或溶解曲线峰型比较杂乱或TM值与样本TM值有明显差异，CT值超过30.

1.5.3符合上述条件即认为样品检测成功，否则重做。(肠杆菌属中有系统误差，不再此范围内)

1.6数据分析

1.6.1原理：

每版取同一个阈值，确定整版的CT值，采用2^-△Ct法(CT值比较法)来计算样本目的基因的表达差异。

△Ct＝目的基因Ct值—16srDNA Ct值

细菌相对含量为2^-△Ct。

1.6.2评价方法：

便秘相关肠道细菌在人群中所占位置高于75％的正常人群范围标记为偏高，低于25％的正常人群标记为偏低，在25％-75％之间标记为正常。

评价体系评估系数及参考范围如下：

益生菌及便秘负相关细菌如表3所示：

表3

便秘正相关细菌及便秘病史如表4所示：

表4

根据评价方法对健康人及便秘患者粪便中便秘相关细菌进行综合评分如表5所示：

表5

综合评分评价的参考范围如表6所示：

表6

用本发明中综合评估体系对入组的健康人、便秘患者样本进行回顾分析，发现，本方法中便秘患者均表现为便秘相关细菌中度(6例)或重度(9例)失衡；健康人表现为便秘相关细菌基本正常(27例)或轻度失衡(18例)如下表7所示。

表7

表8

表8显示了如何从18种菌种筛选出了本发明的10种菌。根据健康组与便秘组样本细菌相对含量的差异显著性及细菌与便秘的相关性高低来确定入组细菌及权重系数

故本发明通过禅道菌评估便秘方法可行，且有准确性较高，同时能够对健康人中便秘相关肠道菌轻度失衡人群进行预警提示。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海宝藤生物医药科技股份有限公司

上海宝藤医学检验所有限公司

<120> 基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置

<130> P2018-2296

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcgcgtcctg gtgtgaaag 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccacatccag cagtccac 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcagtaggg aatcttcca 19

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccgctaca catggag 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgaaccagc caagtagcg 19

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgcaaactt tcacaactga ctta 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagccaagt agcgtgca 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggaccttcc gtattaccgc 20

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cccttcagtg ccgcagt 17

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgcaggat gtcaagac 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cagcacgtga aggtggggac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttgcggtt ggcttcagat 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcagatgtg cccagatgg 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgtgtctca gttccagtg 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

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<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

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<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcaccrtcaa atacaggtgt agc 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

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<400> 19

gggctgcgga agcaactta 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatgacctcg ccctgatcat 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cgtcagctcg tgycgtgag 19

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgtcrtcccc rccttcc 17