一种利用恢复基因连锁标记同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的方法

技术领域

本发明属于育种技术领域，具体涉及一种利用恢复基因连锁标记同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的方法。

背景技术

辣椒属于茄科辣椒属植物，因其含有丰富的辣椒红色素、辣椒素等物质，深受人们喜爱。目前，对于辣椒红素的需求越来越大，并广泛应用于饲料添加剂、化妆品、医药行业。色素辣椒是提取辣椒红色素的主要原料，并已经在新疆、甘肃、内蒙古等地得到广泛的推广。但在生产上，专用色素辣椒品种少，而且品质参差不齐，因此选育辣椒红素含量高的优良一代杂种对于辣椒产业的发展至关重要。

辣椒属于常异花授粉作物，具有明显的杂种优势，利用雄性不育三系配套育种技术可简化制种程序、降低繁种成本、提高杂交种纯度等优点。在雄性不育三系配套育种体系中，不育系和恢复系的选育都至关重要。关于辣椒母本不育系的选育，除了保证其100％雄性不育性外，还需要选择结果性好、果数多、辣椒红素含量高、抗性强等多种优良性状聚合的材料。在色素辣椒中品质优良的恢复系材料也较少，选育具有纯合恢复基因的恢复性强的材料可降低一代杂种的推广风险。因此，丰富辣椒育种资源储备，选育具有多种优良性状的不育系和具有纯合恢复基因的且品质优良的恢复系已成为辣椒雄性不育三系配套育种工作中的重中之重。

目前，辣椒育种中关于三系配套杂交育种中不育系的选育，主要是通过多代回交、自交或通过特殊标记性状来筛选材料来完成。一种选育程序是：通过雄性不育源与多份辣椒材料测交，回交的方法，选育不育系，但这种方法选育周期长，一般需要6代以上，而且易导致种质资源的退化。另一种选育程序是：以叶黄和芽黄为标记性状，通过与保持系进行回交，选育不育系，这种方法需要特殊的材料，不适合育种中的大部分材料。

选育辣椒恢复系的方法主要有常规育种法及分子标记辅助筛选。一种方法是：通过多代回交或者多代自交的方法，进行优良性状的聚合。但这种方法不仅需要大量的人力物力、还极易导致植株的退化，失去其商品价值。另一种方法是：利用芽黄辣椒胞质雄性不育系与自交系辣椒父本进行杂交，根据叶色标记来筛选恢复系；这种方法需要芽黄的材料，不适于所有育种单位。还有，通过辣椒花药培养，加倍后培育恢复系，此方法操作难度大，对技术体系和实验条件要求严格。随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种已经在水稻、甘蓝、辣椒中已得到广泛的应用。在辣椒中，可利用恢复基因连锁标记辅助筛选辣椒恢复系。这种方法筛选效率高，但这些研究只是筛选到了可以用于恢复系辅助筛选的分子标记，而鉴定是否为具有纯合恢复基因的单株未做阐述。本发明从符合育种目标的杂种一代为基础材料，不仅可以选育具有纯合恢复基因的株系，还可同时选育雄性不育系，拓宽育种者材料储备。

发明内容

本发明的发明目的是提供了一种利用恢复基因连锁标记同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的方法。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的恢复基因连锁标记Capsicum-R-82CAPS，所述连锁标记Capsicum-R-82CAPS的序列为：

F：

R：

本发明还提供了利用所述的恢复基因连锁标记Capsicum-R-82CAPS同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的方法，所述选育方法包括以下步骤：

(1)构建辣椒F2世代群体；

(2)辣椒F2世代单株的田间育性鉴定；

(3)利用恢复基因连锁标记进行辣椒F2群体中具有纯合恢复基因单株的鉴定；

(4)选育具有纯合恢复基因株系的同时，创制新的辣椒不育系。

进一步的：所述步骤(1)的构建过程包括以下步骤：

选择符合育种者选育目标的辣椒细胞质雄性不育三系配套杂交种；杂交种 F1进行育苗，隔离网室内定植杂交种F1；在花期进行自交，并做好隔离，果实成熟后采收种子，即为F2代种子；将F2代种子进行育苗，隔离进行单株定植，并标记单株号；建立辣椒F2世代群体。

进一步的：所述步骤(2)的田间育性鉴定过程包括以下步骤：

1)F2单株种植

F2单株在日光温室内基质穴盘育苗，6叶期在隔离室内进行单株定植；

2)F2群体育性田间调查

在开花期，对F2群体进行育性调查，记录每株的育性，并进行田间单株挂牌标记；其中根据花期花粉量的多少进行育性鉴定；分为可育和不育。

进一步的：所述育性鉴定为：花药表面花粉粒浓密，育性为可育；反之花药上没有花粉粒为不育。

进一步的：所述步骤(3)的鉴定过程包括以下步骤：

1)F2群体开花期，根据田间育性的鉴定结果，随机取10个可育单株的DNA 建立可育池、10个不育单株的DNA建立不育池；并对F2单株、可育池、不育池通过CTAB法进行DNA提取；

2)利用所述连锁标记Capsicum-R-82CAPS在可育池和不育池中进行多态性筛选；若只有一条分子量为82bp的条带，为具有纯合恢复基因的单株，入选；而其他带型的单株则淘汰；

3)利用连锁标记鉴定的结果，在花期拔除恢复基因位点杂合的单株，并对已开放花进行去除，自交，建立具有纯合恢复基因的株系。

进一步的：所述F2群体单株数量在100-150株范围内。

进一步的：所述步骤(4)的创制过程包括以下步骤：

1)在F2群体单株中，花期调查为雄性不育和分子标记鉴定也是只具有一条分子量为108bp条带的单株为细胞质雄性不育单株，挂牌编号，并在花期与育种者已有的同类型辣椒保持系进行测交；

2)将测交后的种子进行育苗和定植，在盛花期进行育性的鉴定；

3)若杂交后代花期100％雄性不育，则为创制的不育系；

若不育率为51％～99％，则需连续回交，直至后代达到不育率100％，则为新创制的不育系；

若不育率低于50％，则相应株系淘汰。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：

1、本发明建立了一种快速且可同时选育色素类型辣椒恢复基因位点纯合的恢复株系和创制雄性不育系的方法，可减少由于多代回交和多代自交而造成的退化和选育中杂交工作量大的问题。

2、本发明开发了1个可以用于色素椒快速鉴定是否具有纯合恢复基因株系的连锁标记：(1)Capsicum-R-82CAPS(5′-3′，F： TTCTCATCATAGCATTGCTGTGCAAACT，R：CATCAGGCTTCGGTTAGTCA)。

3、本发明提供了在F2世代群体中，通过构建不育池和可育池的方法，进行鉴定具有纯合恢复基因单株的方法。当连锁分子标记在不育池和可育池中的电泳带型为，在可育池中具有两个条带，一个分子量不同于不育池中的条带，一个与不育池中分子量大小相同的条带，即为可进行鉴定是否具有纯合恢复基因的标记。然后再可育池中单株进行鉴定，只有一条分子量为82bp的条带，为具有纯合恢复基因的单株。

4、利用本发明方法筛选的标记，不但能够区分辣椒是否具有纯合恢复基因株系，还可以在DNA水平鉴定雄性不育系单株，减少环境因素影响。

5、本发明所需的原始辣椒选育材料易获得，可以减少自交代数、缩短育种时间，快速丰富育种者的辣椒三系配套育种材料贮备。

附图说明

图1是恢复基因连锁标记多态性筛选结果；F表示可育池，S表示不育池；

图2是利用连锁分子标记Capsicum-R-82CAPS在F2群体中的电泳结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

本发明以辣椒雄性不育三系杂交种为基础材料，在40目的隔离网室内构建 F2世代分离群体。根据花期田间育性调查的结果，构建不育池和可育池，利用辣椒恢复基因连锁标记进行多态性筛选。可育池中电泳结果，当带型为在分子量 82bp处具有两条条带，一条分子量与不育池中的大小不同，而另外一条相同，则利用该恢复基因连锁标记，可在F2群体中进行恢复基因位点纯合单株的鉴定。然后在F2群体中针对所有可育单株，利用分子标记进行筛选，入选只有一个条带且和不育池中分子量不同的单株，即为辣椒恢复基因位点纯合的单株。最后入选单株自交，其后代为具有纯合恢复基因的辣椒恢复株系。同时，利用分子标记和花期表型双重鉴定筛选不育单株，以育种者自有的同类型辣椒性状优良的保持系为父本，采用测交和回交的方法，选育辣椒新不育系。为辣椒雄性不育三系配套杂交育种储备的具有纯合恢复基因株系和新雄性不育系。

本实施例具体包括以下步骤：

1、构建为选育辣椒不育系和具有纯合恢复基因株系所需的辣椒F2世代群体

(1)选择符合育种目标，如产量、果形、辣椒红素含量等，的辣椒雄性不育三系配套杂交种。

(2)杂交种在育苗棚里进行育苗，在40目隔离网室内定植杂交种F1。在花期进行自交，并做好隔离，果实成熟后采收种子，即为F2代种子。

(3)将F2世代种子，在育苗棚里进行育苗，在40目隔离网室内进行单株定植，并挂牌标记单株号。

(4)做好记录，准备在开花期进行育性鉴定。

2、辣椒F2世代单株的田间育性鉴定

2.1F2单株种植

育苗棚内基质穴盘育苗，6叶期在40目隔离网室内进行单株定植。其中F2 群体单株数量在100-150范围内即可，下述应用实例为123个F2世代单株。

2.2F2群体育性田间调查

在开花期，对F2群体进行育性调查，记录每株的育性，并进行田间单株挂牌标记。其中根据花期花粉量的多少进行育性鉴定。花药表面花粉粒浓密，育性为可育；反之花药上没有花粉粒为不育。

表1辣椒F2世代群体单株育性调查表

3.利用分子标记进行辣椒F2群体中具有纯合恢复基因的单株鉴定

3.1根据单株的田间育性调查结果构建F2群体的不育池和可育池并提取DNA

F2群体开花期，根据田间育性调查，根据育性鉴定结果，随机取10个可育单株的DNA建立可育池、10个不育单株的DNA建立不育池。并对F2单株、可育池、不育池通过CTAB法进行DNA提取。

3.2恢复基因连锁标记在可育池和不育池中适应性检测

通过恢复基因连锁标记在可育池和不育池中进行多态性筛选，结果发现发现，Capsicum-R-82CAPS标记具有多态性(图1)，可以用于恢复系的辅助筛选之中，而且这两个标记属于共显性标记，可以区分恢复基因位点是否纯合，能够更加有效的辅助筛选恢复基因位点纯合的恢复系，减少因区分恢复位点是否纯合的工作量。

表2恢复基因连锁标记信息

标记在辣椒F2群体中建立的可育池和不育池只有具有共显性多态性方可使用，进行下一步骤的单株纯合恢复基因鉴定筛选，即：如果在标记筛选中，像标记AFRF3CAPS(图1-1)可在不育池和可育池中均具有分子量相同的条带，则带型在材料间无多态性，不适合在待鉴定辣椒材料群体中应用。像标记 AFRF1CAPS(图1-2)都不能扩增出条带的的标记，也不能够应用。像标记 3336-last2-SCAR(图1-3)中只在可育池中存在一条带，而不育池中无目的条带出现，这样虽在两个池间具有多态性，但无法鉴定出是否为具有纯合恢复基因，这样的标记也是不能够使用的。而标记Capsicum-R-82CAPS(图1-4)，则能够在 F2群体的可育池中具有两条条带，一条分子量不同于不育池中的条带，一条与不育池中分子量大小相同的条带，从构建可育池的单株中可区分出是否为具有纯合恢复基因的单株，这样带型的标记为鉴定具有纯合恢复基因的标记。

3.3利用标记在辣椒F2代单株中筛选鉴定具有纯合恢复基因的单株

利用所述标记Capsicum-R-82CAPS在F2代群体中检测的结果如图2及表3。与育性鉴定结果综合分析发现，该标记可以进行辅助恢复系的筛选。这样只具有 82bp条带的单株，为具有纯合恢复基因的单株，入选。其中在F2代群体中编号为3、16、27、30、31、32、36、37、39、49、60、64、67、70、72、81、88、 97、105、110、112、113、116、119、120、123共26个具有恢复基因位点纯合的单株，而其他带型的单株则淘汰。

若在利用其他辣椒材料构建的群体中，需重新检验该标记适用性，即确定具有图1-4带型后，再进行恢复基因位点纯合单株的鉴定，已减少鉴定工作量。

表3利用所述标记Capsicum-R-82CAPS在辣椒F2群体中的单株鉴定结果

注：RR代表该材料具有纯合恢复基因；rr代表细胞质雄性不育株材料；

Rr代表该材料具有杂合恢复基因；-代表该材料中未扩增出条带

3.4自交建立具有纯合恢复基因的株系

在隔离网室内，通过利用分子标记鉴定的结果，在花期拔除恢复基因位点杂合的单株，并对已开放花进行去除，自交，建立具有纯合恢复基因的株系。后根据育种目标，品比经济性状，选育出具有纯合恢复基因的优良恢复株系。

4.选育具有纯合恢复基因株系的同时创制新的辣椒雄性不育系

4.1在F2群体单株中，花期调查表型为无花粉和分子标记鉴定显示只具有一条分子量为108bp条带的单株为细胞质雄性不育的单株，通过结合分子标记鉴定结果和田间鉴定结果，可以更加准确的鉴定在F2群体中的不育株，防止因环境变化导致植株不育而田间育性鉴定不准确的现象。其中在F2群体中的单株标号为8、9、14、17、20、23、24、33、44、48、52、61、62、68、69、76、82、 83、86、89、92、98、99、102、103、104、108、111、121，为雄性不育单株。挂牌编号，并在花期与育种者已有的同类型辣椒保持系进行测交，并做好记录。

4.2将杂交后的种子进行育苗和定植，在盛花期进行育性的鉴定。

4.2.1若杂交后代花期100％雄性不育，则为新创制的不育系；

4.2.2若雄性不育率为51％～99％，则需连续回交，直至后代达到不育率100％，则为新创制的不育系；

4.2.3若雄性不育率低于50％，则相应株系淘汰。

4.3以新创制的辣椒雄性不育系为母本，已有的同类型辣椒的恢复系为父本，配制杂交组合，比较评价母本不育系的配合力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种利用恢复基因连锁标记同时选育辣椒雄性不育系和纯合恢复基因株系的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttctcatcat agcattgctg tgcaaact 28

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatcaggct tcggttagtc a 21