公开/公告号CN110577938A
专利类型发明专利
公开/公告日2019-12-17
原文格式PDF
申请/专利权人 中国农业科学院生物技术研究所;
申请/专利号CN201911092915.9
发明设计人 张艳;
申请日2019-11-11
分类号
代理机构北京成实知识产权代理有限公司;
代理人叶立涛
地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号
入库时间 2024-02-19 15:12:07
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-03-10
授权
授权
2020-01-10
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/02 申请日:20191111
实质审查的生效
2019-12-17
公开
公开
技术领域
本发明涉及植物基因工程与遗传改良,具体涉及ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。
背景技术
植物作为光合自养生物,对光环境是非常敏感和灵巧的。光形态建成和暗形态建成是植物采用的两套截然不同的发育程序以应对环境光线(Trends in plant science,Xu et al. 2015)。中国西南部地区的四川和贵州等地几乎全年都处于弱光环境下(中国油料作物学报,范元芳等,2016)。黄淮海等地区持续或频繁的阴雨寡照天气对水稻、玉米等作物生产带来非常不利的影响。现代农业生产上采取的密植或间作套种会加剧作物群体对光的竞争。随着我国城市化进程的加快,很多土地因处于建筑包围之中而形成荫蔽的环境。总之,弱光照或遮荫条件影响非耐荫植物光形态建成,往往出现避荫反应(过度伸长生长,茎秆纤细,易倒伏等),影响植物生长、抗逆能力和最终品质和产量。因此开发提高植物耐荫性的方法具有巨大的应用价值。植物耐荫性是指植物在弱光照条件下的生活能力,是植物为适应低光量子密度,维持自身正常生长发育而产生的一系列变化(热带农业科学,安锋和林位夫,2005;安徽农业科学,代慧等,2015),是植物的一项重要性状。植物面对弱光和遮荫会采取两种应对策略:避荫反应和耐荫反应(分子植物育种,温冰消等,2019)。伸长反应是避荫反应的主要表现之一(Current Opinion in Plant Biology,Fraser et al. 2016)。相比耐荫能力弱的植物,耐荫性强的植物伸长反应相对不明显。PIF(phytochrome-interacting factor)蛋白促进伸长反应的机制之一是其介导了YUCCA基因上调表达(Genes>ABI5(ABA>)转录的直接激活子。BBX21通过干扰HY5与ABI5启动子的结合,负调控ABI5表达。ABA分解是调控植物体内ABA浓度的重要途径之一。ABA8’-羟化酶是ABA分解途径的关键酶,在水稻中由OsABA8ox1,>和OsABA8ox3编码(Plant>
随着世界气候变暖,极端天气条件越来越频繁出现,干旱是其中之一。干旱胁迫(水缺乏)会严重限制农业生产。水分可获取性对植物生存和充足生长起决定作用。根伸长生长到达更深土壤层以吸收足够的水分和营养对大部分植物的生存和生长至关重要。因此根系结构对植物生存至关重要。干旱耐受强的植物可以通过适当优化根系结构去适应缺水土壤环境。因此挖掘和应用重要的根系结构形成基因来增强作物干旱耐受,在极端天气越发频繁的趋势下,具有重要的价值。当光照不足时,植物变得细弱,叶片变长、变窄、变薄,向下输送的光合产物减少,影响根部生长,根系变浅(热带农业科学,安锋和林位夫,2005)。并在一定范围内,随着遮荫程度的加剧,根在全株总重中占比减少,而叶增加。因此正向调控弱光下的光形态建成,提高植物耐荫性,对植物根的生长和发育、根系结构优化是非常有益的。ABA处理24小时后显著增加了主根伸长率和根毛密度,而FLU(fluridone,氟啶草酮,ABA合成抑制剂)处理则是显著抑制(New Phytologist, Xu et al. 2013)。拟南芥ABA合成突变体aba3-1的主根伸长率和根毛密度与野生型相比是严重下降的,指出ABA对适度水胁迫下根尖响应的作用(New>OsABA8ox3>RNA干扰(RNAi)转基因系在干旱胁迫耐受方面有很大提高(PLoS>OsABA8ox2-RNAi转基因水稻鉴定及ABA相关基因表达分析,《中国优秀硕士学位论文全文数据库》基础科学辑,A006-307,20150115)指出对三叶期>OsABA8ox2-RNAi>
综上,目前还没有OsABA8ox家族基因参与植物光形态建成和根发育的相关报道。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用。
本发明提供的技术方案是:通过失活植物体内ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2功能缓解植物避荫反应,提高耐荫性,优化干旱胁迫下根系结构。
从OsABA8ox2编码序列(SEQ>OsABA8ox2。通过农杆菌介导的转化获得了靶序列插入1个碱基和缺失2个碱基的水稻株系。突变的靶序列如SEQ>OsABA8ox2编码序列(codingsequence,>OsABA8ox2敲除株系与野生型水稻相比,均表现为株高降低,叶片变短,耐荫性增强和根系优化。所述OsABA8ox2蛋白具有SEQ>
将完整的OsABA8ox2编码序列(SEQ>BamHⅠ>SacⅠ>Ubi-1启动子驱动。利用农杆菌介导的转化获得Kitaake为背景的OsABA8ox2过表达转基因水稻株系。与野生型相比,过表达株系叶伸长和株高显著增加,避荫反应加强;根伸长受到严重抑制,根系总长显著变短。
将OsABA8ox家族3个启动子(SEQ>PROOsABA8ox:GUS载体,利用农杆菌介导的转化获得Kitaake为背景的转基因水稻株系。通过GUS染色分析了OsABA8ox家族3个启动子活性,特别是OsABA8ox2的启动子活性。OsABA8ox2在苗期根分生组织区有强表达。在颖花和灌浆期种子中有较强表达。
本发明的有益效果是:
1. 本发明通过基因编辑技术获得的OsABA8ox2敲除水稻株系,在一定弱光条件下,避荫反应不明显,耐荫性显著提高,水稻植株光形态建成良好。
2. 本发明通过基因编辑技术获得的OsABA8ox2敲除水稻株系,在一定时间内的土壤干旱胁迫条件下,与野生型水稻相比,发展出更适合缺水环境的根系结构,因此具有更高的生存能力。
3.>OsABA8ox2既是新发现的避荫基因,又是一个新的根系结构形成相关基因,因此OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的科学合理应用对水稻等禾本科作物及其他植物的遗传改良具有很大价值,应用前景广阔。
4.>OsABA8ox2在苗期根分生组织区强表达,在颖花和灌浆期种子中较强表达。OsABA8ox2的启动子具有在根分生组织、颖花和灌浆期种子强启动活性。
附图说明
图1 —>OsABA8ox2敲除(knockout,>
图2 —>OsABA8ox2过表达(overexpression,>
图3 —>OsABA8ox2敲除(KO)和过表达(OE)水稻株系在弱光照下光形态建成表型,叶长和株高统计结果。** 指出KO(或OE)苗和野生型之间的显著性差异(Student’s>ttest,**>P>
图4 — 自然弱光条件下OsABA8ox2敲除(KO)水稻株系呈现高耐荫性,过表达(OE)株系呈现强避荫反应。
图5 — 叶中ABA和IAA含量。星号指出KO(或OE)苗和野生型之间的显著性差异(Student’s>t test,*>P < 0.05,**>P>
图6 — 根的表型观察。
图7 —>OsABA8ox2敲除(KO)和过表达(OE)水稻株系耐旱性分析。** 指出KO(或OE)苗和野生型之间的显著性差异(Student’s>t test,**>P>
图8 —>OsABA8ox启动子与β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase,GUS)融合表达转基因水稻株系的GUS染色分析。
图9 —>OsABA8ox2启动子与GUS融合表达转基因水稻株系的GUS染色分析。
序列列表说明
SEQ ID No:1 —>OsABA8ox2蛋白产物氨基酸序列,
SEQ ID No:2 —>OsABA8ox2突变蛋白产物氨基酸序列,
SEQ ID No:3 —>OsABA8ox2突变蛋白产物氨基酸序列,
SEQ ID No:4 —>OsABA8ox2编码DNA序列,
SEQ ID No:5 —>OsABA8ox2启动子序列,
SEQ ID No:6 — 19bp编辑靶序列,
SEQ ID No:7 — 突变的靶序列,
SEQ ID No:8 — 突变的靶序列,
SEQ ID No:9 —>OsABA8ox1启动子序列,
SEQ ID No:10 —>OsABA8ox3启动子序列。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例来对本发明进行详细说明,但并不是对本发明的限制,仅仅作示例说明。
实施例1
OsABA8ox2敲除载体的构建和基因编辑植物(OsABA8ox2敲除水稻株系)的获得
一、OsABA8ox2敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2的构建
利用E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)选定了一条19 bp的特异靶序列用于产生sgRNA(single-guide RNA)。该序列(SEQ ID No:6)位于OsABA8ox2全长1533>OsABA8ox2-CRIS>
OsABA8ox2-CRISF>(10 mM) 1μl
OsABA8ox2-CRISR>(10 mM) 1μl,
10x T4 DNA Ligase Buffer (with 10 mM ATP) 2μl,
T4 polynucleotide kinase (3’ phosphatase plus;NEB) 1μl,
H2O>
37℃ 40 min, 65℃ 20 min(酶热失活),94℃ 5 min, 50℃ 2 min.
质粒pHUN4c12(In Vitro Mutagenesis,Xu et al. 2017)经BsaⅠ(NEB)酶切,体系如下:
pHUN4c12 3μl (0.3μg/μl),
10x CutSmart Buffer 2μl,
BsaⅠ>
H2O>
共3管。37℃ 5 h,65℃ 20 min(酶热失活)。3管酶切液60μl补足至200μl,加2.5倍无水乙醇,混匀后放-80℃ 1 h。12000 rpm 12 min 离心沉淀,晾干后加20μl H2O溶解。
然后将加磷酸基团后的OsABA8ox2-CRIS序列通过T4>
二、基因编辑植物(OsABA8ox2敲除水稻株系)的获得
将构建好的敲除载体pHUN4c12-OsABA8ox2按照产品说明书操作方法(热击法)转入农杆菌EHA105>nd>OsABA8ox2的农杆菌EHA105>0代)经3天炼苗后即可移栽至土中。收到种子再种下去,得到T1代。
三、OsABA8ox2敲除水稻株系的鉴定
首先鉴定T0代敲除水稻株系是否整合进了含有OsABA8ox2-CRIS的T-DNA片段。以野生型和T0代苗叶片基因组DNA为模板,用U3bF/UbiR(表1)进行PCR>OsABA8ox2-target(表1),进行PCR扩增(图1B),再通过测序检测T0代靶序列信息。得到8个杂合突变体和4个纯合突变体,图1C示其中2个纯合突变体KO1和KO2,突变的靶序列分别如SEQ>OsABA8ox2>1代用同样方法再次检测。
表1 实施例所用引物
实施例2
OsABA8ox2过表达水稻株系的获得和鉴定
为构建OsABA8ox2过表达载体,完整的OsABA8ox2编码序列(SEQ>OsABA8ox2-OE(表1)进行RT-PCR(reverse>BamHⅠ>SacⅠ(NEB)双酶切后的pCAMBIA1303载体,使其处于Ubi-1启动子之3’端,受该启动子驱动。同源重组选用GBclonart>OsABA8ox2-C(表1)通过PCR扩增出外源的OsABA8ox2>OsABA8ox2转录水平远远高于野生型(WT),引物对为OsABA8ox2-RT(表1),内对照为Actin1(引物见表1)。
实施例3
OsABA8ox2敲除水稻株系光形态建成表型,叶长和株高测定和耐荫性分析
植株在较弱(2100 lux)光照条件下生长。与野生型(WT)相比,OsABA8ox2过表达(OE)株系第三片叶片和叶鞘细长柔弱(图3A),特别是叶鞘长度显著高于野生型(图3B),敲除株系KO1和KO2第三片叶片显著变短(图3A,>OsABA8ox2参与了叶的发育。25天大的WT苗处于3叶期,而OE苗第4片叶已伸出(图3A),过表达苗生长速率快于野生型。由于OsABA8ox2>OsABA8ox2过表达抑制了水稻苗期的光形态建成,呈现避荫反应。株高统计结果表明OsABA8ox2过表达株系OE1和OE2均显著高于野生型,而OsABA8ox2敲除水稻株系KO1和KO2均显著矮于野生型(图3B)。叶片伸长和株高是判断植物避荫反应和耐荫性的重要指标性状。据此判断OsABA8ox2敲除水稻株系具有较野生型更强的耐荫能力。此外,采用引物对COP1(表1)进行半定量RT-PCR分析,发现拟南芥COP1在水稻中的同源基因(编号LOC_Os02g53140)在OsABA8ox2敲除水稻株系中转录水平下降(图3C)。拟南芥中COP1编码光形态建成的抑制因子(Cell,>OsABA8ox2敲除水稻株系中转录水平下降暗示了OsABA8ox2敲除水稻株系中光形态建成分子网络的正向调控。
自然弱光条件下OsABA8ox2敲除(KO)水稻株系呈现高耐荫性,维持挺直生长(图4)。而过表达(OE)株系和野生型呈现不同程度的避荫反应,不能维持挺直生长(图4)。这里自然弱光条件为:室内,其东边和北边有玻璃引进光照。上午10:00,13000>OsABA8ox2为避荫基因。OsABA8ox2功能失活后,植株在一定程度弱光下的光形态建成较好,提高了植物耐荫性(图3A,>
实施例4
叶片中ABA和3-吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)含量测定
叶片ABA和IAA含量测定委托杭州景杰生物科技有限公司完成,采用超高效液相色谱/串联四极杆质谱分析系统(ultra-performance liquid chromatography/tandemquadrupole mass spectrometer equipped with an electrospray interface; UPLC-ESI-qMS/MS)。与野生型相比,5叶期OsABA8ox2>OsABA8ox2过表达株系叶片中较高水平IAA促进伸长反应,是叶片伸长和株高表现突出的原因之一。
实施例5
根表型观察和根参量测定
利用ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)测量不定根直径。根系暴露室温24 h之后称重。不管是对照条件还是干旱处理,OsABA8ox2>OsABA8ox2过表达抑制了水稻根系的伸长生长和发育,而敲除能优化水稻根系结构以加强干旱耐受。
表2 对照组和干旱组根参量
同一列数值后面的不同的小写字母指出通过Duncan’s multiple range test得出的显著性差异(P>
实施例6
OsABA8ox2敲除和过表达水稻株系土壤干旱胁迫处理和耐旱性分析
对5叶期水稻植株停止浇水来进行土壤干旱耐受分析。停止浇水4天后,OsABA8ox2过表达转基因系OE1和OE2开始展现卷叶表型,而WT和敲除株系KO1和KO2叶子仍然平展(图7B)。停止浇水5天后,OE1>OsABA8ox2>
实施例7
OsABA8ox启动子与GUS融合表达载体pCAMBIA1303-PROOsABA8ox:GUS的构建和转基因株系的GUS染色分析
为进行OsABA8ox2启动子分析,ATG起始密码子上游1619>OsABA8ox2-Pro(表1),以Kitaake基因组DNA为模板,进行PCR扩增。为进行OsABA8ox1启动子分析,ATG起始密码子上游894>OsABA8ox1-Pro(表1)进行PCR扩增。为进行OsABA8ox3启动子分析,ATG起始密码子上游1417>OsABA8ox3-Pro(表1)进行PCR扩增。将经测序验证的扩增片段通过同源重组方法整合进经HindⅢ>Nco>OsABA8ox1,OsABA8ox2和OsABA8ox3的启动子驱动。同源重组选用GBclonart>PROOsABA8ox:GUS转基因系。
GUS染色选用GUS染色试剂盒(Coolaber,北京)。PROOsABA8ox:GUS转基因水稻株系GUS染色显示在营养生长期OsABA8ox2主要在根中表达(图8B)并且在胚根分生组织区有很强的表达(图9A)。OsABA8ox3主要在叶中表达(图8A)。而OsABA8ox1在苗期表达很弱,几乎无表达(图8)。表明这3个基因的表达模式具有时空特异性,暗示它们的启动子具有一些不同的顺式作用元件。OsABA8ox2在颖花和灌浆期种子都可见较强表达(图8C,>
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> ABA 8’-羟化酶基因OsABA8ox2在植物光形态建成和根发育中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa)
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gccagcacct tccacgccat gaagaagctc tcgttcgacg tcggcgtcgt gaccatcttc 600
ggcggccggc tcggccgccg gcacagggag gagctgagga cgaactactc cgtcgtggag 660
agaggctaca actgcttccc caaccgcttc ccggggacgc tctaccacaa ggcgatccag 720
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gtgtccaagt gatccttaat tctccagggt catttgg 1417
机译: 聚核苷酸分离的启动子,构建体,脂肽,植物,木本植物和转基因后代,植物细胞,生产转基因植物的方法。赋予生殖不育性,通过消融生殖结构去除,改变生育力通过消灭植物生殖发育来清除花粉。获得木材和木浆,诱导火炬松中茎的形成。测试在雌蕊的候选生殖组织中的启动子活性,并构建控制开花腐烂的植物
机译: 控制该基因的根和根毛发育和生长的新基因以及通过该基因转化的植物
机译: 增加植物中木质素和纤维素含量的siringuilo以将基因组cald5h基因(松柏醛醛5羟化酶),Aldomt(邻甲基转移酶)和sad(sinapil醇脱氢酶)4cl(4-cumarato ca ligase)和CAD整合到植物中(松柏醇脱氢酶)。