采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法

技术领域

本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体地说，是采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法，用于观察眼眶受体分布和表达。

背景技术

临床上进行¹³¹I治疗GD甲亢过程中如发生甲减，极有可能存在TAO恶化的危险性，部分患者可能诱发Graves眼病（GO）的发生，其发病机制尚不十分清楚，预防和治疗都比较棘手，目前尚无比较合适的动物模型用以观察这类眼眶组织的病理改变。 

长期以来一直寻找¹³¹I治疗GD后甲减诱发GO的原因，并通过动物模型观察眼眶组织学变化了解其发病机制，目前已有多种方法制作了甲亢或甲减及其相关眼病的动物模型。

一、首先实验动物的选择上，主要是大鼠，因大鼠的甲状腺功能以及下丘脑-垂体-甲状腺轴与人类基本相似，且其价格低廉、分布广、繁殖快、体积小、易于饲养管理。

二、常用甲减模型：

1、低碘甲减模型：房辉等制作动物模型的方法为: Wistar 鼠食用重度缺碘地区粮食配制的饲料加去离子水，3月后即可成模。

2、化学诱导甲减模型：已成功证实以下化学物质能诱发甲减：丙基硫氧嘧啶( PTU) / 碘番酸( IOP) 、PTU、甲基硫氧嘧啶(MTU) 、他巴唑(MZ) 、甲状腺激素(TH) 、¹³¹I、过氯酸钠(NaClO₄) 。

Rebagliati 等取240～280g Wistar 雄鼠，腹腔注射¹³¹ I 1月，造模成功。¹³¹ I 法是通过¹³¹ I物理作用，其机理主要为发射β射线杀伤甲状腺细胞，使甲状腺素（TH）分泌减少。

3、先天性甲减模型：既可以用低碘饲料，也可以用化学诱导剂来诱发，不同的是所选动物为怀孕雌鼠。

4、转基因甲减模型。

5、甲状腺切除甲减模型：甲状腺切除甲减模型是经典的甲减模型, 切除绝大部分甲状腺必定造成甲减。

以上甲减模型用于甲亢经¹³¹ I仍不理想，没有良好地模拟疾病发展的自然状态。同时由于甲减病因复杂，目前的甲减动物模型还没有囊括所有病因的甲减，大多限于原发性甲减和TH 抵抗综合症的研究，对于继发性甲减和TSH 抵抗综合症则研究甚少。

三、方法对比总结。

低碘甲减模型(包括低碘先天性甲低模型)存在耗时、耗费等缺点。

化学诱导甲减模型(包括化学诱导甲减模型)存在耗时、耗资、不能较好模拟自然病程等缺点。

转基因甲减模型存在操作过程复杂、技术性强、成功率低等缺点。

虽然切除甲减模型简单易操作、造模成功率高可达100 %，但不是甲亢治疗后的自然甲减。

以上的模型均与实际的甲亢经内照射致甲减的眼病比较，其诱因和发展过程有较大区别。另外，各模型间造模成功的标准也不同。应该根据研究目的不同，制造不同的甲减动物模型。同时具备耗时耗费少、操作简单、成功率高、模拟疾病发展的自然状态的条件是才是理想的甲减动物模型。目前直接采用内照射甲亢动物的方法致甲减的眼眶模型，国内外尚未查到文献报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法，所述的方法包括以下步骤：a、通过放射性¹³¹ I内照射Wistar大鼠；b、使用人类促甲状腺激素腹腔注射Wistar大鼠。

所述的步骤a中通过放射性¹³¹ I内照射Wistar大鼠的方法是腹腔注射¹³¹I碘化钠。

所述的¹³¹I碘化钠的腹腔注射剂量为300μci或500μci/每只。

所述的人类促甲状腺激素腹腔注射的时间是第6周。

所述的方法包括以下步骤：a、腹腔注射¹³¹I碘化钠注射液，注射剂量为300μci或500μci/每只；b、第6周，人类促甲状腺激素用0.9%生理盐水稀释到83.2μg/mL，大鼠腹腔注射，注射剂量为100μL/每只； c、用于观察眼眶生长抑素受体的分布。

本发明优点在于：

1、该动物模型制作简单，费用低，易重复；

2、成功率高，85%发生甲减，甲状腺组织且有甲减的普遍特征；

3、其中100%有甲状腺相关眼病的特征；

4、发现眼眶生长抑素受体分布异常；

5、试验中，动物死亡率低。

附图说明

图1. 眼眶组织眼外肌病理改变，D. 正常组×100;  B. 中剂量组×100,箭头所指,黏液变性、水肿、脂肪化;  C. 高剂量组×100,箭头所指,肌纤维透明、变性断裂。

图2. 眼眶眼外肌生长抑素受体（SSTR2、5）免疫组化（箭头所指为阳性细胞），                                                正常组SSTR2 ×400；高剂量组SSTR2 ×400；正常组SSTR5 ×400；高剂量组SSTR5 ×400。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例

本发明的目的是通过模拟甲状腺功能亢进（甲亢）在行放射性碘-131（¹³¹I）内照射的方法，建立一种简易有效的甲状腺功能减低（甲减）眼眶动物模型，病理表现相似于甲状腺相关眼病（TAO），以供观察和探讨TAO发病机制需要。本发明通过¹³¹I腹腔注射Wistar大鼠，然后采用纯度较高的人类促甲状腺激素（hTSH）刺激Wistar大鼠，Wistar大鼠发生甲减，观察动物甲状腺、眼眶组织，判断模型的是否成功。

一、材料与方法

1材料

1.1动物  20只Wister大鼠（雌雄各半，平均体重220g），由复旦大学放射医学研究所动物实验中心提供和饲养。

1.2 主要试剂  ¹³¹I-碘化钠注射液（上海欣科医药有限公司）；FT₃、FT₄试剂盒（ROCHE诊断产品上海有限公司）；Wister大鼠促甲状腺激素（TSH）酶联试剂盒与鼠抗人生长抑素受体多克隆抗体(简称生长抑素抗体)2和5购自美国ADL公司；SP组化试剂盒与DAB显色试剂盒购自上海长岛公司。

1.3 仪器  COBAS E601电化学发光法免疫测定仪（ROCHE诊断产品上海有限公司），Multskan MS酶标仪（德国）。

2  方法

2.1  试验动物分组与处置  将20只Wister大鼠用完全随机设计的方法分为正常组(D组)6只，实验组14只，大鼠尾静脉取血0.5mL，测定FT₃。实验组腹腔注射¹³¹I-碘化钠注射液，根据不同剂量（每只使用100μci、300μci、500μci）将实验组分为三组：低剂量组（A组）4只、中剂量组（B组）和高剂量组(C组) 各5只。第6周，hTSH用0.9%生理盐水稀释到83.2μg/mL，取100μL（含0.0832μg）大鼠腹腔注射。于注射¹³¹I后第8周处死所有大鼠，心脏取血2mL，离心取上清液放置-40℃冰箱待测。用剪刀和镊子小心剥离眼眶组织，立即放入10%中性福尔马林液固定。

2.2  血清FT₃、FT₄、TSH测定  用电化学发光法测定FT₃ 、FT₄，ELISA测定大鼠血清TSH。

2.3　眼眶组织病理学观察   将固定的组织酒精梯度脱水，石蜡包埋切片，苏木精伊红（HE）染色，在光学显微镜下进行观察。

2.4 免疫组织化学法　组织脱蜡至水，抗原热修复后，组织切片表面滴加生长抑素抗体2和5（工作液浓度为1：100），置于湿盒中，4℃冰箱内过夜。用PBS代替一抗作为阴性对照。之后经SP工作液孵育，PBS水洗，DAB 显色，苏木素复染。抗体染色阳性反应产物位于细胞质内和细胞膜上，呈棕褐色颗粒状，以出现均匀完整的着色定为阳性。

1.3 统计学方法

用统计分析软件：应用SPSS13.0统计软件包，所有实验数据均采取均数±标准差（± S）表示。不同组比较采用方差分析，P <0.05为差异有统计学意义。

二、结果

Wistar大鼠血清FT₃、FT₄和rTSH水平组间比较（表1）。

表1 Wistar大鼠血清FT₃、FT₄和rTSH水平组间比较

注：与D组比较 ▲P <0.05； 与A组比较 Δ P <0.05。

实验前，Wister大鼠血清FT₃水平各组之间差异无统计学意义（P >0.05）。实验组注射¹³¹I 8周后，血清FT₄水平明显下降，与正常组比较，差异均有统计学意义（P <0.05），其中B组和C组明显低于A组（P <0.05），差异均有统计学意义（P <0.05）；血清TSH水平，B组、C组略高于正常组、A组略低于正常组，差异均无统计学意义（P >0.05）。

2.1  HE染色观察（图1）

低剂量组：约25%眼眶组织出现黏液变性、水肿，无明显纤维组织和脂肪组织增生，肌纤维无变性断裂。中剂量组：约50%大鼠眼眶组织出现明显黏液变性、水肿，局部纤维组织和脂肪组织增生，肌纤维透明变性断裂；高剂量组：约70%大鼠眼眶组织出现明显黏液变性、水肿，局部纤维组织和脂肪组织增生，肌纤维透明变性断裂，空泡形成。另外，实验组均有不同程度的肥大细胞为主的免疫细胞浸润。正常组：小鼠的眼眶组织均无形态学改变。

2.2 免疫组化结果判断（图2）　

SSTR阳性染色为棕黄色颗粒, 定位于细胞膜及细胞浆。每张切片随机选择10个高倍视野, 根据阳性细胞的比例判定, 20%～ 50%SSTR阳性定为弱阳性(+ ) , 大于50% 定为阳性(+ + ) , 大于75% 定为强阳性(+ + + ), 小于20%的细胞着色或细胞与背景一致不着色定为阴性(－ )。

D组6片：SSTR2呈3/6(－)，3/6(+ )，SSTR5呈2/6(－)，3/6(+ )，1/6(+ + )；A组3片：SSTR2呈2/3 (+ )，1/3 (+ + + )，SSTR5呈2/3(+ )，1/3(+ + + )；B组8片：SSTR2呈5/8(+ )，3/8(+ + + )；SSTR5呈3/8(+ )，5/8 (+ + + )；C组6片：SSTR2呈5/6(+ )，1/6(+ + + )；SSTR5呈6/6(+ + + )。将A组和B组合并为AB组，通过χ² 检验或校正χ² 检验，SSTR 5的表达在C组、D组和AB组三组间差异有统计学意义 (P < 0. 0005)，而SSTR 2的表达差异无统计学意义 (P > 0. 05)。

三、讨论

SSTRs普遍存在于人体各组织细胞，目前发现SSTR有5个亚型。在TAO患者眼眶组织不同细胞表面都发现有SSTRs，淋巴细胞表面含所有SSTR亚型，但SSTR1-3表达相对较强，眼眶脂肪细胞内、纤维组织中表达SSTR1-3和SSTR5，眼外肌细胞仅有SSTR1-3的表达。已有多项研究发现，在TAO活动期，球后组织浸润的淋巴细胞和活化的成纤维细胞表达SSTR数量与其活动度相关。SSTR介导的细胞效应较多，主要表现在抑制细胞的分泌和细胞分化以及诱导细胞凋亡，SSTR还可抑制淋巴细胞释放细胞因子，调节免疫细胞功能。

SSTA眼眶显像是基于通过放射性核素标记的SSTA与球后组织浸润的淋巴细胞和活化的成纤维细胞SSTRs相结合，有效地反映眼眶组织的活动性，并指导对患者的治疗。SSTA用于治疗Graves眼病的机制仍不完全清楚，可能的机制有以下3个可能：一是通过抑制胰岛素样生长因子-I(IGF-I）的活性，从而减低了IGF-I对成纤维细胞的刺激，抑制了糖胺多糖（GAG）的合成；二是通过抑制T淋巴细胞等释放细胞因子或促免疫炎症反应的物质；三是通过直接与靶细胞上的SSTR结合而引起一系列改变，最终达到治疗的目的。

TAO不仅并发于GD甲亢，¹³¹I治疗后出现甲减时也可存在，其眼病的恶化与球后组织TSH受体的敏感性增强有关。为了解甲减发生时大鼠是否已具备了TAO发生的病理基础，本发明采用Rebagliati等方法并加以改进，甲减发生后观察大鼠眼外肌病理改变和SSTR2和5的分布情况。结果显示，在大鼠眼眶组织中出现明显黏液变性、水肿，局部纤维组织和脂肪组织增生，肌纤维透明变性断裂等现象，并随着放射性剂量的增加而加重，而眼外肌表达SSTR的强度上SSTR5明显大于SSTR2，且随着放射性剂量的增加而递增。

本发明建立的动物模型具有甲减的病理特征。经一定剂量¹³¹I内照射致正常大鼠发生甲减，其眼眶组织的病理改变与人类TAO极其相似，推断由¹³¹I治疗所致的甲减患者，TAO的病理改变也可能单独存在。本发明研究结果认为SSTRs的表达总体上与眼眶组织的变性、水肿及增生密切相关，能够为SSTA的治疗或显像、评价疗效等提供依据。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。