制备共沉淀氢氧化铁酸奶的方法

技术领域

本发明涉及酸奶的制作方法，具体涉及一种添加铁强化剂的酸奶制作方法。 

背景技术

铁是人体的必需微量元素，而铁缺乏却是造成世界范围内能力缺失和死亡的主要因素之一，影响着大约20亿人。目前有三种方法可用于铁缺乏的改善：一是通过饮食改变或多样化来提高营养价值和铁的生物利用率；二是直接补充微量营养物质，通常使用较高的剂量；三是在食品中添加微量元素。在这三种方法中，对于降低铁缺乏的流行，在食品中进行铁强化被公认为是最长期有效的方法。 

乳及乳制品中添加的铁强化剂种类比较多，《食品营养强化剂使用卫生标准》中允许使用的铁强化剂基本上都可以应用在其中，能用于其中的铁强化剂可分三类，见表1。第一类是铁盐,是应用最广泛的一类,包括二价铁盐和三价铁盐。这些铁盐虽然可溶于水及乳中,但它们也具有能和乳中的组成成分相互作用,从而改变乳的感官性质的缺点。第二类是元素铁,可通过H₂或CO还原、电解或羰基化而制得。这些铁呈粉末状,化学性质呈惰性,在水中溶解性很差或不溶于水,因此只能应用于固体脱水乳制品中。第三类是铁和蛋白质或磷酸肽形成的复合物。结合铁的位点主要是氨基酸,例如磷酸丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。结合在这些化合物上的铁一般不能被置换,也不能与乳中的成分发生反应。为了防止或减轻直接用硫酸亚铁等铁盐强化乳制品时产生的氧化味、金属味及色泽变化等不良影响,可以用卵磷脂、聚甘油单硬脂酸酯等为壁材,把上述铁盐制成微胶囊,使得铁和乳制品不接触,从而防止乳脂肪氧化等不希望反应的发生。也有人采用一种方式制备出硫酸亚铁脂质体，并将其应用于牛奶中，使牛奶中的铁含量达到了15mg/L，在100℃下热杀菌30min及在4℃下保藏一周，它都是稳定的。 

表1铁强化乳制品中的常用铁化合物 

乳及乳制品是人体所需蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素和矿物质元素的良好来源。但其体系复杂，对于多种因素如酸、碱、盐等都比较敏感。当对其进行铁强化后容易引起一些生物物理化学变化如脂肪氧化，色泽风味变化，pH值、酪蛋白、乳清蛋白及盐类平衡的变化等等。 

脂肪氧化及风味变化：脂肪是乳中的重要成分，但是其中的不饱和脂肪酸易氧化产生酸败，这不仅影响乳及乳制品的风味，还危害人体的健康。促进脂肪氧化的因素有内在因素和外在因素两类，内在因素为脂肪的不饱和度，外在因素为光照、氧气、贮藏温度和金属。铁可催化氢过氧化物的分解，加快自由基的产生，从而使得乳及乳制品中的脂肪发生氧化，最终产生金属氧化味等令人讨厌的风味。 

色泽变化：一些铁强化剂的颜色较深，如柠檬酸铁铵、柠檬酸铁、富马酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、血红素铁等，其颜色多为棕色、红褐色等，直接添加必然会对产品的色泽产生影响。 

pH值变化：添加FeCl₂和FeCl₃到脱脂乳中，会导致pH值的降低。这与铁溶液的酸度和铁离子与胶束结合的H⁺之间的交换有关。 

酪蛋白和乳清蛋白的变化：铁的加入会使酪蛋白和乳清蛋白发生变化，但乳清蛋白只是发生轻微变化，而铁会与酪蛋白结合从而导致酪蛋白结构发生变化，并且Fe³⁺与酪蛋白的结合能力高于Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺几种金属阳离子。铁对乳清蛋白的影响小于对酪蛋白的影响是由于乳清蛋白的结合位点只有8个，而酪蛋白的结合位点有14个。铁与两种蛋白的结合还受pH的影响。 

盐类平衡的变化：造成盐类平衡变化一般来说是由于铁与酪蛋白的结合，受铁的盐类有无机磷酸盐、柠檬酸盐等。对盐类平衡的影响还决定于铁化合物的性质， 价态的铁影响的盐类是有所不同的。 

尽管铁的加入直接或间接的改变了其中几乎所有的化合物，如脂类、酪蛋白、乳清蛋白等，但铁强化的乳及乳制品一般还是为人们接受的。 

酸奶是利用微生物对乳类的作用，在特定条件下经发酵得到的乳制品。它是一种传统的保健食品，具有改善乳糖不耐受症的作用；能够预防和治疗小儿腹泻以及由抗生素引起的腹泻，还能降低健康成年人发生腹泻的机率；调节胃肠道菌群，甚至可以提高爱滋病病毒携带者对营养的吸收能力；可降低乳腺癌、结直肠癌、胃癌及膀胱癌的发生率；提高机体免疫力；降低胆固醇；延缓机体衰老；提高机体对矿物质的吸收。但牛奶是贫铁食物，酸奶中铁含量很低（小于0.1mg/100g）。为了使其营养更全面，在酸奶中进行铁强化很有必要。在酸奶中进行铁强化是预防铁缺乏的有效途径。但是到目前为止，在酸奶中加入什么样的铁强化剂最好，以及如何依据酸奶的特点进行铁强化剂的添加，还是一个有待研究的课题。 

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供一种制备共沉淀氢氧化铁酸奶的方法，该方法利用共沉淀法制备出符合要求的共沉淀氢氧化铁，再将该共沉淀氢氧化铁作为强化剂加入，制作铁强化酸奶。本方中涉及到的共沉淀氢氧化铁具有粒子粒径小（粒径小于100nm，为纳米粒）、在酸中易溶解、机体内易吸收、制备简单、成本低、安全、对产品感官性质影响小等特点；加入到酸奶中能够弥补普通酸奶中铁元素含量不足的问题，同时最大程度的保证了酸奶的原有风味和口感。 

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案： 

一种制备共沉淀氢氧化铁酸奶的方法，包括以下步骤： 

步骤1，酸奶发酵剂的准备； 

步骤2，使用共沉淀法制备共沉淀氢氧化铁浆； 

步骤3，将牛奶预热到50——60℃； 

步骤4，添加白砂糖到步骤3所述的牛奶中， 

步骤5，再向牛奶中加入步骤2中制备的共沉淀氢氧化铁，同时进行充分搅拌；然后采用超声波对共沉淀氢氧化铁强化乳进行均质处理，超声均质条件为：功率180W—270W，超声时间180S～250S；； 

步骤6，将步骤5中得到的混合物放入95℃中杀菌5分钟，再迅速冷却到42——45℃； 

步骤7，在无菌条件下接种步骤1中得到的酸奶发酵剂，在42℃温度条件下发酵5小时，取出后让酸奶半成品在4℃条件下冷却、后熟12—24小时，即得到共沉淀氢氧化铁酸奶成品。 

更进一步的技术方案是： 

所述的步骤2具体包括以下步骤： 

步骤2-1，4重量份FeCl₃·6H₂O₃·6H₂O和3重量份MgCl₂·6H₂O进行混合； 

步骤2-2，再加入4000重量份的水； 

步骤2-3，加入2-3重量份的氢氧化钠，所述的氢氧化钠为质量分数10g/100mL一边加入一边搅拌，以pH值达10-11为准； 

步骤2-4，将步骤2-3的产物用水漂洗3—4次，至pH值达到8.0； 

步骤2-5，将步骤2-4漂洗后的产物进行过滤，得到约100重量份共沉淀氢氧化铁浆。 

所述的步骤4中添加的白砂糖的质量百分比为6%—8%，所述的步骤5中加入的共沉淀氢氧化铁折合铁添加量为2—5mg/100g，所述的步骤7中酸奶发酵剂接种量为质量分数2%——6%。 

所述的步骤4中添加的白砂的质量百分比为5%——7%；所述的步骤5中加入的铁添加量为1毫克/100克——3毫克/100克；所述的步骤7中酸奶发酵剂接种质量百分比为3%——5%。 

所述的步骤4中添加的白砂的质量百分比为7%；所述的步骤5中加入的铁添加量为2毫克/100克；所述的步骤7中酸奶发酵剂接种质量百分比为5%。 

所述的步骤1具体为：将发酵剂在无菌条件下接种到灭菌牛奶中，在42℃温度中恒温培养4小时后，取出放到温度在4℃条件下作为酸奶发酵剂冷藏备用。 

所述的步骤1中将发酵剂在无菌条件下接种到灭菌牛奶中时，所述的发酵剂的质量百分比为2—3%。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

1、选择了利用共沉淀法自制的共沉淀氢氧化铁作为加入酸奶的铁强化剂。对该强化剂进行了毒理学安全性评价研究。急毒性实验结果表明，该强化剂对小鼠经口LD₅₀大于21.5g/kg.ig，属于实际无毒；小鼠骨髓微核试验与小鼠精子畸形试验研究，该强化剂对小鼠无致突变作用；30d喂养试验表明，该强化剂对大鼠有促进生长的作用。在按照相关要求进行添加的前提下，该强化剂加入到酸奶中是安全可靠的。 

2、利用共沉淀法自制的共沉淀氢氧化铁作为铁强化剂，铁的吸收率高，经动物（大鼠）试验表明，其生物利用率达88%，远远高于其它目前常用的铁强化剂。 

3、采用本发明的方法制备出来的酸奶，其感官评价、酸度、TBA值和乳酸菌数等质量指标均不低于其它目前常用的铁强化剂制作的酸奶。 

4、本发明制作的酸奶，不仅达到强化铁的目的（普通酸奶铁含量0.1mg/100g以下，而本发明制作的酸奶铁含量2mg/100g以上），而且能够最大程度的保证酸奶原有的风味和口感。 

具体实施方式

现将本文件中所涉及到的概念进行解释，以便于对本文的理解。 

所谓共沉淀，指化学共沉淀法，是指在两种或多种阳离子的溶液中加入沉淀剂，淀反应后，可以得到各种成分均一的沉淀，它是最早采用液相化学反应合成金属氧颗粒的方法。化学共沉淀法可用于制备Fe₃O₄、镁铁型层状双氢氧化物纳米颗粒、纳 化物（ITO）粉体等。它的优点在于：其一是通过溶液中的化学反应可直接得到化学成分均一的纳米材料，其二是容易制备粒度小且分布均匀的纳米材料。 

所谓共沉淀氢氧化铁，是指利用共沉淀法制备出来的氢氧化铁。 

本发明以本发明人采用共沉淀法自制的共沉淀氢氧化铁作为铁强化剂，制作铁强化酸奶，研究其最佳生产工艺条件，并研究根据在最佳工艺条件下制作出的铁强化酸奶与未进行强化的普通酸奶和以焦磷酸铁、硫酸亚铁、乳酸亚铁、乙二胺四乙酸铁钠、富马酸亚铁等其它铁强化剂制作的酸奶，在7d贮藏期内的感官指标、酸度、乳酸菌数及TBA值的变化情况进行了对比研究，确证本发明的共沉淀氢氧化铁酸奶不仅铁含量有效提高，而且产品品质优良，为共沉淀氢氧化铁酸奶的开发提供了理论依据和实验依据。本发明所采用的共沉淀氢氧化铁具有粒子粒径小、在酸中易溶解、机体内易吸收、制备简单、成本低、对食品感官性质影响小、安全性高等特点。 

下面再来具体叙述本发明的整体步骤： 

制备共沉淀氢氧化铁酸奶的方法，包括以下步骤： 

步骤1，酸奶发酵剂的准备，具体可以是将汉森公司生产的FD-DVS YF-L812商业发酵剂（当然也可以使用市面上其他可以代替的商业发酵剂，例如法国罗地亚公司），在无菌条件下接种到灭菌牛奶中，在42℃温度中恒温培养4小时后，取出放到温度在4℃环境中作为酸奶发酵剂冷藏备用；本步骤中，发酵剂的加入量为占灭菌牛奶质量百分比的2—3%； 

步骤2，使用共沉淀法制备氢氧化铁浆；步骤2具体包括以下步骤： 

步骤2-1，4重量份FeCl₃·6H₂O₃和3重量份的MgCl₂·6H₂O进行混合； 

步骤2-2，再加入4000重量份的水； 

步骤2-3，加入2—3重量份的氢氧化钠，所述的氢氧化钠为质量分数10g/100mL的溶液，一边加入一边搅拌，以pH值达10-11为准； 

步骤2-4，将步骤2-3的产物用水漂洗3—4次，至pH值达到8.0； 

步骤2-5，将步骤2-4漂洗后的产物进行过滤，得到约100重量份共沉淀氢氧化铁浆； 

步骤3，将牛奶预热到50——60℃； 

步骤4，添加白砂糖到步骤3所述的牛奶中，添加的白砂的质量百分比为4%——8%，优选为5%——7%，最优为7%。 

步骤5，再向牛奶中加入步骤2中制备的共沉淀氢氧化铁，在本步骤中，加入的铁添加量≦5毫克/100克，优选为1毫克/100克——3毫克/100克，最优为2毫克/100克；同时进行充分搅拌，然后采用超声波对共沉淀氢氧化铁强化乳进行均质处理，超声均质条件为：功率180W—270W，超声时间180S～250S； 

步骤6，将步骤5中得到的混合物放入95℃中杀菌5分钟，再迅速冷却到42——45℃； 

步骤7，在无菌条件下接种步骤1中得到的酸奶发酵剂，在42℃温度条件下发酵取出后让酸奶半成品在4℃条件下冷却、后熟12—24小时，即得到共沉淀氢氧化铁酸本步骤中，酸奶发酵剂接种量为质量分数2%——6%。 

下面再来详细叙述本发明涉及的共沉淀氢氧化铁酸奶制作所开展的相关研究。 

1主要研究内容 

本试验在对共沉淀氢氧化铁进行毒理学安全性评价后，将其作为一种铁强化剂应用于凝固型酸奶，并研究其对凝固型酸奶品质的影响，同时与其他铁强化剂进行对比，为其能够作为铁强化剂应用于酸奶中提供实验依据和理论依据。具体研究内容如下： 

（1）根据食品安全性毒理学评价程序，选择小鼠经口急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验和SD大鼠30d喂养试验对共沉淀氢氧化铁进行安全性评价。 

（2）将共沉淀氢氧化铁添加于凝固型酸奶中，对共沉淀氢氧化铁酸奶的最佳工艺条件进行研究，并在7d贮藏期内对酸奶的酸度进行测定；在最佳工艺条件下，将强化共沉淀氢氧化铁的酸奶与强化其他种类铁强化剂的酸奶进行对比研究，在7d贮藏期内对它们的酸度、TBA值、乳酸菌数进行测定。 

2实验方法 

2.1共沉淀氢氧化铁的经口急性毒性研究 

2..1.1实验动物分组及剂量选择 

选择18~24g的健康昆明种小鼠50只，雌雄各半。根据体重随机分组的方法，按照霍恩氏法剂量设计原则，设四个剂量组和一个对照组。在预试验的基础上，共沉淀氢氧化铁以2.15g/kg.ig、4.64g/kg.ig、10.00g/kg.ig、21.50g/kg.ig的剂量一次性灌胃，对照组以生理盐水按相同灌胃体积一次性灌胃。灌胃前空腹16h，不限制饮水，灌胃2~3h后恢复饮食与饮水。 

2..1.2实验期间小鼠中毒症状及死亡情况观察 

灌胃后，对小鼠的中毒症状及死亡情况进行观察记录，实验时间为一周。小鼠的中毒症状可依据表1中所列出的观察项目进行观察。 

表1 

2.1.3LD₅₀的确定 

试验结束后查霍恩氏法LD₅₀值计算表得LD₅₀值，并根据LD₅₀值将共沉淀氢氧化铁进行急性毒性分级。急性毒性剂量分级标准如表2所示。 

表2 

2.1.4小鼠体重变化称量 

在试验前及试验结束后逐只称量小鼠体重。 

2.1.5小鼠剖检及脏器指数的计算 

试验结束后，将小鼠颈椎脱臼处死，进行解剖，肉眼观察主要脏器及胸、腹腔情况，完整取出心、肝、脾、肺和肾，用手术剪将黏附于脏器上的组织剪去，并用生理盐水冲洗，去除脏器表面残留的血液与结缔组织，然后用滤纸擦干，准确称重，计算脏器指数，即脏器的重量与相对应体重的比值。 

2.2共沉淀氢氧化铁的致突变试验 

2.2.1实验动物分组及剂量选择 

共沉淀氢氧化铁的小鼠骨髓微核试验选择25~30g的健康昆明种小鼠50只，雌雄各半。 

共沉淀氢氧化铁的小鼠精子畸形试验选择25~35g的健康昆明种小鼠25只，雄性。 

根据体重随机分组的方法将实验动物分为五组。其中，三个剂量组，灌服共沉淀氢氧化铁剂量从低到高依次为2.50g/kg.ig、5.00g/kg.ig、10.00g/kg.ig，另设一个阴性对照组（灌服生理盐水）和一个阳性对照组（灌服环磷酰胺40mg/kg.ig）。 

2.2.2共沉淀氢氧化铁的小鼠微核试验操作步骤 

小鼠连续灌胃2d，在第二次给受试物后6h，颈椎脱臼处死。迅速用手术剪将两腿股骨取下，将肌肉剔除，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨节，用带针头的注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打使骨髓细胞分布均匀，以1000r/min离心10min，弃除多余的上清液，留下约0.5mL与沉淀物混合均匀后，用并滴一滴在清洁的载玻片上，推片。涂片自然干燥后放入甲醇中固定5~10min，晾入Giemsa应用液中，染色10~15min。立即用pH6.8的磷酸盐缓冲液冲洗、晾干。写 阴凉干燥处保存。在低倍镜下找到细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，用油镜观察计数。采用Giemsa染色法，骨髓嗜多染红细胞(PCE)呈灰蓝色，成熟红细胞(NCE)呈粉红色，细胞中含微核的呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，计算微核率，微核率以千分率表示。 

2.2.3共沉淀氢氧化铁的小鼠精子畸形试验操作步骤 

经口灌胃共沉淀氢氧化铁，每天一次，连续5d，在第一次灌胃后第35d颈椎脱臼处死小鼠，取出两侧附睾，放入盛有适量生理盐水(约1mL)的小烧杯中。用眼科剪将附睾纵向剪l～2刀，静置3～5min，轻轻摇动。用4层擦镜纸过滤，吸取滤液涂片。空气干燥后，用甲醇固定5min以上，干燥，用1~2%伊红染色1h，用水轻冲，干燥。在低倍镜下找到背景清晰、精子重叠少的部位，用高倍镜检查精子形态，计数结构完整的精子。精子有头无尾（轮廓不清）或头部与其他精子或碎片重叠，或明显是人为剪碎者，均不计算。每只动物至少检查1000个精子。精子畸形，主要表现在头部，其次为尾部。畸形的类型可分为无钩、无定形、香蕉形、双头、双尾、胖头及尾折叠等。观察畸形精子数，计算精子畸形率，畸形率以百分率表示。 

2.3共沉淀氢氧化铁30天喂养试验 

2.3.1实验动物分组及剂量选择 

SD大鼠，60~80g，雌雄各半。观察喂养一周后，剔除不合格大鼠，最后得80只，称重，按体重随机分为4组，每组20只大鼠，雌雄各半。 

共沉淀氢氧化铁剂量分别取10.00g/kg.ig、5.00g/kg.ig、1.25g/kg.ig，同时设阴性对照组（生理盐水）。 

2.3.2灌胃染毒 

大鼠分组后严格控制室温于25±2℃，湿度保持60±5%，饮水使用蒸馏水，每天每只大鼠按0.1mL/10g经口灌胃，实验期间全部饲喂大鼠基础饲料。每天观察动物的一般状况，每周称体重，记录采食量，计算每组大鼠的增重重量、进食量和总食物利用率。 

2.3.3生物标本的采集 

连续灌胃30d，禁食16h，次日眼睛内眦静脉取全血，颈椎脱臼处死，解剖，肉眼观察有无明显器质性病变，取心、肝、脾、肺、肾、睾丸、卵巢称重，计算脏器指数。 

2.3.4血液学常规指标及血液生化指标测定 

取200μL新鲜血液，加入抗凝剂中，进行血液学检查，检查项目包括：血红蛋g/L）、红细胞（RBC×10¹²个/L）、血小板（PLT×10⁹个/L）、白细胞（WBC×10⁹个巴细胞百分比（LYM%）、单核细胞百分比（MID%）、中性粒细胞百分比（GRA%）。 血3000r/min离心8min取上清液-20℃保存，用于测定血清生化指标，测定指标包括：血糖（GLU）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肌酐（CRE）、尿素（BUN）、总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、血清白蛋白（ALB）、总蛋白（TP）。 

2.4共沉淀氢氧化铁及其他铁强化剂在酸奶中的应用 

2.4.1制作铁强化酸奶的工艺流程 

鲜牛乳预处理→混料（铁强化剂、白砂糖）→均质→杀菌（95℃，5min）→冷却→接种发酵剂→分装→发酵→后熟（4℃）→贮藏（4℃） 

2.4.2共沉淀氢氧化铁酸奶发酵条件的优化 

（1）制作共沉淀氢氧化铁酸奶主要因素单因素试验 

以感官评价为指标，在发酵温度42℃、发酵时间5h条件下，考察共沉淀氢氧化铁添加量（以Fe计）、发酵剂接种量、白砂糖添加量3个因素对酸奶风味的影响。①在菌种接种量为4%、白砂糖添加量为6%的条件下研究不同铁添加量0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg对酸奶风味的影响；②在铁添加量为30mg/kg、白砂糖添加量为6%的条件下研究不同发酵剂接种量2%、3%、4%、5%、6%对酸奶风味的影响；③在铁添加量为30mg/kg、发酵剂接种量为4%条件下研究不同白砂糖添加量4%、5%、6%、7%、8%对酸奶风味的影响。 

上述条件下制备所得酸奶都进行留样，在4℃条件下后熟、贮藏，并在第1、3、5、7d对其酸度进行测定。 

（2）共沉淀氢氧化铁酸奶主要因素正交试验 

根据单因素试验结果，按L₉(3³)表进行正交试验。 

2.4.3不同铁强化剂对酸奶品质的影响 

按优化出的最佳条件，选择共沉淀氢氧化铁、焦磷酸铁、硫酸亚铁、乳酸亚铁、乙二胺四乙酸铁钠、富马酸亚铁，按2.4.1的酸奶制作工艺流程进行酸奶制备。所得产品后熟、贮藏24h后进行感官评价，于第1、4、7d对酸奶的酸度、TBA值、乳酸菌数进行测定。 

2.4.4指标测定方法 

（1）酸奶感官评分标准 

根据产品色泽、滋味、气味、组织状态对酸奶进行感官评分，具体标准见表3。 

表3 

（2）酸度的测定 

采用GB5413.34-2010方法。用0.1moL/L的NaOH溶液滴定，酸度以°T表示。 

（3）乳酸菌的测定 

无菌操作条件下，将冷却到60℃左右的MRS培养基倒入灭菌培养皿中，冷却后待用。酸奶样品充分混匀，依次做10倍递增稀释，最后选择2个适宜稀释度，每个稀释度吸取0.1mL样品均液分别置于MRS培养平板，用涂布棒进行表面涂布。在37℃恒温培养48±2h后计数平板上的菌落。采用自动菌落分析仪进行计数。 

（3）TBA值测定（脂肪氧化分析） 

取5mL样品加入2.5mL TBA试剂，于沸水浴中反应10min后取出，放入冰水中迅速冷却，然后依次加入1mL4mol/L的硫酸铵、10mL环己酮，充分混合均匀，让环己酮充分提取生成物，在室温、3000r/min的条件下离心5min，吸取上清液在532nm波长下用1cm的比色皿测定吸光度。 

2.5数据处理 

试验结果采用SPSS17.0和excel2007进行分析。 

3结果与分析 

3.1共沉淀氢氧化铁经口急性毒性试验结果 

3.1.1灌胃后小鼠中毒症状及死亡情况 

灌胃后，小鼠的自发活动、肌肉运动、反应、自主神经、呼吸等均未出现表1的不良症状，在观察期7d内一切正常，各试验组均未出现小鼠死亡。 

3.1.2LD₅₀的确定 

各剂量组均未出现死亡情况，根据霍恩氏法LD₅₀值计算表无法得出确切的LD₅₀值，只能判断出共沉淀氢氧化铁的LD₅₀＞21.50g/kg.ig，根据急性毒性分级标准可知，共沉淀氢氧化铁属于无毒级。 

3.1.3共沉淀氢氧化铁急性毒性试验对小鼠体重的影响 

共沉淀氢氧化铁灌胃对小鼠体重的影响情况如表4所示。 

表4 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表4可见，各组小鼠体重均是增加的。对照组体重与各剂量组体重进行比较，在统计学上无显著差异，说明共沉淀氢氧化铁各个剂量经口灌胃在7d观察期内对小鼠体重增长的影响不明显。 

3.1.4小鼠剖检记录 

观察期7d结束后，小鼠逐只称重后颈椎脱臼处死，进行解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃、肠及胸腔、腹腔情况，均未发现异常。 

3.1.5共沉淀氢氧化铁急性毒性试验对小鼠脏器指数的影响 

共沉淀氢氧化铁灌胃对小鼠脏器指数的影响情况如表5所示。 

表5 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表5可见，对照组与各剂量组相比，雌雄小鼠脏器指数均无显著差异，由此可说明在这些灌胃剂量下，共沉淀氢氧化铁不会造成小鼠脏器的病变。 

3.2共沉淀氢氧化铁致突变试验的结果 

3.2.1共沉淀氢氧化铁的小鼠骨髓微核试验结果 

共沉淀氢氧化铁灌胃对小鼠骨髓微核细胞的影响情况如表6所示。 

表6 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表6可见，雄性小鼠阴性对照组的微核率为1.60‰，雌性小鼠阴性对照组的微核率为2.20‰。一般小鼠阴性对照组的微核率小于5‰，所以实验中小鼠微核率在正常范围内。与阴性对照组相比，试验组小鼠在共沉淀氢氧化铁各剂量下，嗜多染红细胞微核出现率无统计学上的显著性差异，且无剂量反应关系，而阳性对照组则显示出显著性差异，由此可说明共沉淀氢氧化铁小鼠骨髓微核试验结果为阴性。 

3.2.2共沉淀氢氧化铁的小鼠精子畸形试验 

共沉淀氢氧化铁灌胃对小鼠精子畸形的影响情况如表7所示。 

表7 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表7可知，阴性对照组的精子畸形率为2.22%，一般小鼠阴性对照组的精子畸形率为0.8~3.4%，所以实验中小鼠精子畸形率在正常范围内。与阴性对照组相比，试验组小鼠在共沉淀氢氧化铁各剂量下，精子畸形率没有统计学上的显著性差异，且无剂量反应关系，而阳性对照组则显示出统计学上的显著性差异，因此可以说共沉淀氢氧化铁小鼠精子畸形试验结果为阴性。 

3.3共沉淀氢氧化铁30d喂养试验结果 

3.3.1体重和总食物利用率 

共沉淀氢氧化铁30d喂养试验对大鼠体重的影响情况如表8所示。 

表8 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比 学上有极显著性差异（P＜0.01） 

30d染毒期间，试验SD大鼠活动、进食、饮水等状况良好，未出现中毒症状和不良反应，也未出现死亡，全部存活。由表8的结果可知，在体重上，雌雄SD大鼠体重每一周的增长表现出不同的增长量。雄性大鼠的三个剂量组与对照组相比较都没有统计学上的显著性差异。雌性大鼠的中剂量组（5.00g/kg.ig）体重增长从灌胃第二周开始就显著高于对照组，直到第四周其体重增长出现极显著高于对照组，到试验结束时，体重增长仍显著高于对照组。雌性大鼠的低剂量组（2.50g/kg.ig）和高剂量组（10.00g/kg.ig）在体重的增长上与对照组相比较均未表现出统计学上的显著性差异。可见，各剂量组的共沉淀氢氧化铁对雌雄大鼠的体重增长无不良影响。 

共沉淀氢氧化铁30d喂养试验对大鼠的总食物利用率的影响如表9所示。 

表9 

注：表中数据同一列内带有不同字母的数差异显著，显著水平P＜0.05。 

由表9可知，对照组与剂量组的食物利用率进行对比，无显著性差异，说明共沉淀氢氧化铁对大鼠的总食物利用率无明显影响。 

3.3.2脏器指数 

共沉淀氢氧化铁30d喂养试验对大鼠脏器指数的影响情况如表10所示。 

表10 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表10结果可知，雄性SD大鼠的脏器指数与对照组相比较，不存在统计学上的显著性差异。而雌性SD大鼠除低剂量组（2.50g/kg.ig）和高剂量组（10.00g/kg.ig）的脾脏指数与对照组相比有显著性差异外，其余的脏器指数均无显著性差异。 

3.3.3血液学常规指标 

共沉淀氢氧化铁30d喂养试验对雄、雌性大鼠血液指标的影响情况如表11、12所示。 

表11 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

表12 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表11、12的结果可知，各剂量组雌雄SD大鼠的血液学指标与对照组相的血液学指标相比均无显著性差异。 

3.3.4血液生化学指标 

共沉淀氢氧化铁30d喂养试验对雄、雌性大鼠血清生化指标的影响情况如表13、14所示。 

表13 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表13的结果可知，在雄性SD大鼠中，中剂量组（5.00g/kg.ig）的总胆固醇与对照组相比较有显著性差异。其余上述指标与对照组相比均无显著性差异。 

注：*与对照组相比在统计学上有显著性差异（P＜0.05）；**与对照组相比在统计学上有极显著性差异（P＜0.01） 

由表14的结果可知，在雌性SD大鼠中，低剂量组（2.50g/kg.ig）和中剂量组（5.00g/kg.ig）的甘油三酯与对照组相比较有显著性差异，其余上述指标与对照组相比较均无显著性差异。 

3.4共沉淀氢氧化铁及其他铁强化剂在酸奶中的应用研究结果 

3.4.1铁添加量对酸奶感官评价的影响及贮藏过程中酸度的变化 

3.4.1.1铁添加量对酸奶感官评价的影响（见表15） 

表15 

由表15可得，铁添加量的多少主要影响滋味，对色泽与气味、组织状态无多大影响。在铁的添加量小于30mg/kg时，酸奶的滋味基本一致；铁添加量高于30mg/kg时，滋味有所下降。从实验得出铁加量小于30mg/kg时可以得到令人满意的风味。因此正交试验时铁添加量选择10、20、30mg/kg。 

3.4.1.2不同铁添加量酸奶在贮藏过程中酸度的变化（见表16） 

表16 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著，显 著水平P＜0.05。 

由表16的结果可知，整个贮藏过程中，与对照组相比，铁的强化剂量对酸度的影响基本上均有显著性差异。而不同的强化剂量组间又表现出不同的差异，第1d时，2号除与3号酸奶的酸度无显著差异外，与其他几个强化剂量酸奶的酸度均有显著差异；第3d时，5号与2、6号酸奶的酸度相比无显著差异，与3、4号酸奶的酸度有显著差异，3号除与4号酸奶的酸度无显著性差异外，与其他酸奶的酸度均有显著差异；第5、7d时，6号与其他酸奶的酸度均有显著性差异。总的来说，铁强化剂量对酸奶的酸度在贮藏过程中是有影响的，在铁强化剂量小于40mg/kg的情况下，对酸度的影响不大，与对照组相比最大差值仅为1.4°T。 

3.4.2发酵剂接种量对酸奶感官评价的影响及贮藏过程中酸度的变化 

3.4.2.1发酵剂接种量对酸奶感官评价的影响（见表17） 

表17 

由表17可得，发酵剂接种量的多少对于滋味、色泽与气味无多大影响，主要影响组织状态，当发酵剂接种量为3%时，感官评分最高，当高于该量时，评分有所下降。但发酵剂接种量为4%时，感官评价高于2%，因此正交试验时选择发酵剂接种量为3%、4%、5%。 

3.4.2.2不同发酵剂接种量酸奶在贮藏过程中酸度的变化（见表18） 

表18 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著水平P＜0.05。 

由表18的结果可知，发酵剂的接种量对酸奶酸度的影响存在显著性差异。第1号酸奶与其他发酵剂接种量酸奶的酸度均存在显著差异。在随后的贮藏过程中，不同 接种量酸奶的酸度变化显示出不同程度的变化。总的来说，发酵剂的接种量越大，在贮藏过程中酸度的增加越大。 

3.4.3白砂糖添加量对酸奶感官评价的影响及贮藏过程中酸度的变化 

3.4.3.1白砂糖添加量对酸奶感官评价的影响（见表19） 

表19 

由表19可得，随着白砂糖添加量的增加，产品的感官评分也随之增加，当添加量达到7%时，感官评分最高，再增加白砂糖的量则会造成甜度过高而破坏酸奶的酸甜感，所以确定白砂糖的添加范围为5%~7%。 

3.4.3.2不同白砂糖添加量酸奶在贮藏过程中酸度的变化（见表20） 

表20 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著，显著水平P＜0.05。 

由表20的结果可知，白砂糖的添加量会对酸奶的酸度产生显著影响。在整个贮藏过程中，各组酸奶之间的酸度值表现出不同的差异性。整体趋势表现为，白砂糖的添加量越大，其酸度值越小。 

3.4.4共沉淀氢氧化铁酸奶主要因素L₉(3³)正交试验结果 

根据单因素试验结果，按因素水平表21进行正交试验，正交试验结果见表22。 

表21 

表22 

由表22可知，极差中因素B最大，说明发酵剂接种量对共沉淀氢氧化铁酸奶的感官评价影响最大，其次是影响因素C，最后是A。优化方案组合是A₂B₃C₃。这一组合在正交试验中没有，因此需要通过进一步的实验进行验证。验证后得到其感官评分结果为94分，得分比正交表中组合的所有得分都高，因此确定其最佳工艺条件为A₂B₃C₃，即铁添加量为20mg/kg、发酵剂接种量为5%、白砂糖添加量为7%。 

3.4.5不同铁强化剂酸奶感官评价结果及在贮藏过程中品质的变化 

3.4.5.1不同铁强化剂对酸奶感官评价的影响（见表23） 

表23 

由表23可知，从整体上看，各组感官评分差值不大，铁强化剂的种类对酸奶滋味的影响基本一致，主要是对组织状态、色泽与气味的影响存在差别。 

3.4.5.2不同铁强化剂酸奶在贮藏过程中酸度的变化（见表24） 

表24 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著，显著水平P＜0.05。 

由表24的结果可知，在贮藏1d时，对照组酸奶的酸度与各组的酸度相比均有显著性差异，各种铁强化剂酸奶的酸度又各自表现出不同的差异性。 

3.4.5.3不同铁强化剂酸奶在贮藏过程中乳酸菌数的变化（见表25） 

表25 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著，显著水平P＜0.05。 

由表25的结果可知，各组酸奶中的乳酸菌数随着贮藏期的增加均呈现减少趋势。期7d内，添加不同铁强化剂酸奶中的乳酸菌数与对照组酸奶中的乳酸菌数无显著性3.4.5.4不同铁强化剂酸奶在贮藏过程中TBA值的变化（见表26） 

表26 

注：表中数据为3次试验结果的平均值，同一列内带有不同字母的平均数差异显著，显著水平P＜0.05。 

由表26可知，在整个贮藏期7d以内，添加不同铁强化剂酸奶的TBA值与对照组酸奶的TBA值均无显著性差异。 

4结论 

（1）共沉淀氢氧化铁对小鼠经口急性毒性试验未见中毒症状，也无死亡；共沉淀氢氧化铁对雌雄小鼠经口LD₅₀大于21.50g/kg.ig，属于实际无毒。 

（2）小鼠骨髓微核试验与小鼠精子畸形试验的研究发现，在各试验剂量下，实验组与空白对照组均无显著性差异，即两者结果均为阴性，可认为共沉淀氢氧化铁对小鼠无致突变作用。 

（3）在共沉淀氢氧化铁30d喂养试验中，SD雌雄大鼠的体重、总食物利用率、血液学指标、血液生化学指标、器官病理学观察均未观察到不良作用,可初步推测共沉淀氢氧化铁灌胃产生毒性的最大未观察到有害作用剂量为5.00g/kg.ig。 

（4）以共沉淀氢氧化铁为铁强化剂制作酸奶，共沉淀氢氧化铁（以Fe计）的适宜添加量为10~30mg/kg，酸奶的最佳生产工艺条件为铁添加量为20mg/kg、发酵剂接种量为5%、白砂糖添加量为7%。 

（5）在同一铁添加量条件下，与以焦磷酸铁、硫酸亚铁、乳酸亚铁、乙二胺四乙酸铁钠、富马酸亚铁、富马酸亚铁等常见铁强化剂对比，以共沉淀氢氧化铁作为铁强化剂制备酸奶，对酸奶的感官指标、酸度、乳酸菌数、TBA值等质量指标均无明显不良影响。 

综上所述，无论从安全性考虑，还是从对酸奶品质的影响考虑，共沉淀氢氧化强化剂加入到酸奶中是可行性的。本发明所开发的酸奶不仅安全，而且品质好。