产脂类生物表面活性剂的原油降解菌及应用

技术领域

本发明涉及一种菌株，特别涉及一种产脂类生物表面活性剂的原油降解菌 及应用。

背景技术

表面活性剂是一种既有亲水基团又有亲油基团的物质，其具有润湿或抗粘、 乳化或破乳、起泡或消泡以及增溶、分散、洗涤、防腐、抗静电等作用，是一 种用途非常广泛的精细化工产品。表面活性剂除了在日常生活中作为洗涤剂， 其他应用几乎可以覆盖所有的精细化工领域。

然而化学表面活性剂的大量使用可能引起土壤或者水体的二次污染，并且 大多数化学表面活性剂都难以被再次利用因而会在环境中滞留。因此，对环境 友好的生物表面活性剂越来越受到人们的关注。

生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种，主要是指微生物在一定培养条 件下产生的一些具有明显降低表面张力的代谢产物。与化学合成的表面活性剂 相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外， 还具有一般化学表面活性剂所不具备的环境友好特性，如无毒、可自然生物降 解、生态安全等优点。另外生物表面活性剂也常比化学表面活性剂具有更高的 表面活性，乳化能力也更强，在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业方面具有 潜在的应用价值。特别是在难降解疏水性有机物如多环芳烃、多氯联苯、石油 烃的修复中，生物表面活性剂发挥着重要的作用，它使疏水性有机物乳化并明 显增溶，使得降解菌更容易降解这些物质。

另外，生物表面活性剂在极端环境中依然能发挥作用，其不受温度等外界 环境的影响，而一般的化学表面活性剂对环境条件要求严格，在极端环境下得 不到应有的效果。而且，生物表面活性剂可以被微生物利用，不会在环境中长 期残留，对环境不会产生有害影响。然而，生物表面活性剂目前还是难以商业 化利用，主要是因为其产率低以及底物成本高，纯化过程投资大。获得能大量 代谢的生物表面活性剂的菌种是解决目前生物表面活性剂成本高的一种途径。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种产脂类生物 表面活性剂的原油降解菌。

本发明的另一目的在于提供所述产脂类生物表面活性剂的原油降解菌的应 用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种产脂类生物表面活性剂的原油 降解菌，名称为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）MZ01，于2012年7 月12日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6354；

所述的铜绿假单胞菌MZ01的形态为：菌落光滑、球型，边缘平整，呈浅 绿色，属革兰氏阴性菌，电子显微镜下观察该菌体的形态为球菌；

所述的铜绿假单胞菌MZ01的16S rDNA如SEQ ID NO.1所示；

所述的产脂类生物表面活性剂的原油降解菌在制备生物表面活性剂以及石 油降解中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的菌株主要产脂类，其CMC值为0.1g/l，并能将水的表面 张力从72.0mN/m降至29.9mN/m，其对疏水性有机物具有明显的乳化和增溶作 用，而且作用持久。

（2）本发明提供的菌株25℃、pH值为7，转速为150rpm的条件下5d可 将原油从200mg/l降至约92mg/l左右，石油总去除率为达52%以上，其中该菌 株对原油的降解率在30%以上。

附图说明

图1是菌株MZ01的形态观察图，其中，A为平板菌落照片图，B为电镜图。

图2是MZ01菌株所产生的表面活性剂的红外光谱图。

图3是MZ01产生的表面活性剂的¹H谱分析结果图。

图4是MZ01产生的表面活性剂的¹³C谱分析结果图。

图5是生物表面活性剂的CMC值测定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

MZ01的筛选分离。

采集广州某炼油厂附近石油污染土壤，取2g土壤添加到培养基A中，放置 30℃，150rpm摇床中振荡过夜。将原油作为唯一碳源添加至培养基A对土壤中 的菌株反复驯化培养（放置30℃，150rpm摇床中振荡5d，5d之后再次接种至 新鲜含2g原油的培养基A中，重复三次该步骤对土壤中的菌株进行驯化），原 油（来源于广州中石化公司）的添加量为每升培养基A中加入2g原油。

培养基A（以下使用的培养基A的组成同此处）的组成为每升富集培养基 中添加1ml微量元素，pH值为7.0；

每升富集培养基中含有：0.5克MgSO₄.7H₂O、0.02克CaCl₂.2H₂O、1克 NH₄NO₃、1克NaCl、3克酵母提取物、1.5克KH₂PO₄、2克K₂HPO₄，水定容 至1L；

每升微量元素中含有：0.1克ZnSO₄.7H₂O、0.3克MnSO₄.H₂O、0.1克 FeSO₄.7H₂O、0.1克CaCl₂.2H₂O、0.1克CoCl₂.6H₂O、0.01克CuSO₄.5H₂O、0.01 克AlK(SO₄)₂.12H₂O、0.01克H₃BO₃、0.0137克(NH₄)₂Mo₂O₇、0.0107克 MgSO₄.7H₂O，水定容至1L。

经反复驯化并分离纯化得到若干株产表面活性剂以及降解原油的菌株，利 用油滴坍塌实验、乳化指数测试以及发酵液表面张力测定筛选出能较好产表面 活性剂的菌株，筛选结果如表1所示。同时利用DCPIP试剂的氧化还原显色反 应筛选出能有效降解原油的菌株，得到菌株MZ01是既产表面活性剂又能很好 降解原油的菌株。平板观察该菌落的形态（如图1所示），其呈浅绿色，不规 则形，边缘平整，菌落表面光滑湿润。电子显微镜下观察该菌体的形态为球菌， 直径为707～870nm。将其送至测序公司（广东省微生物分析检测中心）测其16S rDNA，得到的序列如下所示，通过NCBI BLAST，其与铜绿假单胞菌属相似同 源性达100%，因此鉴定该菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。将其 命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）MZ01，于2012年7月12日保 藏于位于中国北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6354。

表1

油滴坍塌实验

①将纯化的菌株用初始发酵培养基（在每升培养基A加入5g葡萄糖得到， 下同）（150rpm，30℃左右）发酵培养2d，4000rpm离心10min，得到上清液。

②往96孔板板盖中心中添加原油，每孔2μl，静置24小时，得到处理好的 96孔板板盖，接着往其中加入步骤①得到的上清液，每孔2μl。选取一分钟内能 产生排油圈的菌株进行后续实验。每株菌株做三组平行样。

乳化指数测定

经初始发酵培养基培养的菌液（150rpm、30℃左右培养2d）于4000rpm离 心10min，分别取2ml上清液以及2ml正十六烷于10ml离心管中，超声破碎 15min，然后静置2h，观察乳化层高度及其乳化分层效果。每株菌株做三组平行 样。

表面张力测定

经初始发酵培养基的菌液（150rpm、30℃左右培养2d）于4000rpm离心 10min，取上清液测量其表面张力的大小。所需仪器是由上海方瑞仪器公司生产 的QBZY-1型表面张力仪。每株菌株做三组平行样。

DCPIP试剂显色反应筛选原油降解菌

①经初始发酵培养基的菌液（150rpm、30℃左右培养2d）于5000rpm离心 15min，取沉淀；然后用质量百分比0.85%的NaCl溶液洗涤两次再用其悬浮， 调整其OD580为0.4～0.6。

②在96孔板中按每孔加入200μl培养基A，30μl石油，20mg DCPIP（2,6- 二氯酚靛酚）作为氧化还原剂。加25μl经上述处理的菌体悬浮液后放置室温培 养，油降解菌能将培养物从蓝色变为无色，以24h后颜色变化显著情况作为衡 量降解油的能力标准。每株菌株做三组平行样。

16S rDNA的序列如下：

  1catgcaagtc gagcggatga agggagcttg ctcctggatt cagcggcgga cgggtgagta

 61atgcctagga atctgcctgg tagtggggga taacgtccgg aaacgggcgc taataccgca

121tacgtcctga gggagaaagt gggggatctt cggacctcac gctatcagat gagcctaggt

181cggattagct agttggtggg gtaaaggcct accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag

241aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg

 301gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc

 361ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggcagt aagttaatac cttgctgttt

 421tgacgttacc aacagaataa gcaccggcta acttcgtgcc agcagccgcg gtaatacgaa

 481gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt tcagcaagtt

 541ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatcca aaactactga gctagagtac

 601ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac

 661cagtggcgaa ggcgaccacc tggactgata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc

 721aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcgactag ccgttgggat

 781ccttgagatc ttagtggcgc agctaacgcg ataagtcgac cgcctgggga gtacggccgc

 841aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa

 901ttcgaagcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatgc tgagaacttt ccagagatgg

 961attggtgcct tcgggaactc agacacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg

1021agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacctcgg

1081gtgggcactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt

1141catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aaagggttgc

1201caagccgcga ggtggagcta atcccataaa accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa

1261ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgtgaatc agaatgtcac ggtgaatacg

1321ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggttgctc cagaagtagc

1381tagtctaacc gcaaggggga cggt

实施例2：表面活性剂菌株的鉴定

生物表面活性剂的提纯

添加玉米油至培养基A（玉米油的添加量为每升培养基A中加入2g玉米油） 中对菌株MZ01进行发酵培养，7d后，将得到的菌液用2N NaOH调节pH值至 8.0，然后于10000rpm离心15min，收集上清液，再用12N HCl调节上清液的 pH值至2.0，并放入4℃冰箱静置过夜。然后将此溶液于10000rpm离心15min， 收集沉淀。沉淀用按体积比2:1配比的氯仿：甲醇溶液进行三次萃取，取下层， 用0.22μm滤膜过滤，取滤液，再进行旋转蒸发（45℃），即得到所需产物。经 过测定，25℃，初始pH值为7，用含玉米油2g/L的培养基A进行发酵培养，3 天后提取并纯化其发酵产物，可得其产生的生物表面活性剂为2.27g/l，并且在 25℃下，该表面活性剂可将发酵液从56.4mN/m降到26.7mN/m。

生物表面活性剂的鉴定

（1）薄层层析

在层析缸中倒入约20ml的展开剂（氯仿：甲醇：质量百分比28%的氨水按 体积比65:35:5混合），并让其在层析缸中挥发使之达到气液平衡。将硅胶板用 铅笔标记下端以及上端，用毛细管取提取的表面活性剂点在硅胶板上用铅笔标 记的下端线上面，将硅胶板放入层析缸中。注意展开剂不能超过铅笔标记的下 端。待展开剂近到上端线时，取出薄层板，分别喷三种显色剂，放入105℃烘箱 中灼烧5min，观察颜色变化。薄层层析显色剂有：I）苯酚-硫酸：3g苯酚和5mL 浓硫酸溶于95mL乙醇中，糖脂显棕色斑点；II）钼酸铵-高锰酸钾：磷脂显色 剂；III）茚三酮：0.5%无水丙酮溶液，脂肽显红色。

测试结果表明，该表面活性剂喷茚三酮显色剂后显红色，因此初步判断该 物质属于脂肽类。

（2）傅里叶红外变换光谱（FTIR）

经提纯的表面活性剂呈黄色膏状体，用棉签沾取少量该膏状体物质涂抹在 压片上进行FTIR分析。

由图2可知，宽峰3359cm^-1是由O-H引起的伸缩振动峰（分子链间氢键引 起的C-H）；伸缩振动3008cm^-1是C-H基团的分子内氢键引起的C-H伸缩谱 带；2926cm^-1和2855cm^-1是脂肪酸族的连接CH₂以及CH₃基团的C-H伸缩振 动；1745cm^-1是乙酰酯键的C=O伸缩振荡谱带；1166cm^-1是烯烃中C-H异变的 伸缩谱带；1097以及1062cm^-1的峰值显示的是C-OH伸缩键；在此图谱中，916 和810cm^-1的峰值显示的是与正位异构体相关的组分；983以及732cm^-1的伸缩 振荡显示的是牢固连接在端位碳头上的O-H基团，即该表面活性剂的亲水端； 在此图谱中的特征鉴别区域1238cm^-1和1462cm^-1之间的区域是指典型的脂肪酸 族的C-H伸缩振动以及O-H基团的异变伸缩振荡，此处显示的是该生物表面 活性剂的疏水部分。

由此图可以验证，该表面活性剂是一种脂类物质。 （3）核磁共振

对提纯的MZ01产生的生物表面活性剂进行H¹谱和C¹³谱分析，用毛细管 取少量该物质溶于氯仿中，在400MHZ以及297K下分析并分别得到¹H谱和¹³C 谱谱图。

如图3和4，¹H以及¹³C核磁共振分析所示图谱，可知该物质主要是由脂类 组成。在1H谱中，0.88-2.78ppm之间所示的区域表明该物质一种长链碳氢化合 物，该长链化合物中，0.88ppm显示的化学键是-CH₃，1.28、1.30ppm为（-CH₂） -CH₂-，2.31ppm为-CH₂-COO-，4.12-4.31ppm显示的是碳碳双键，5.31-5.38ppm 表示为碳碳三键。在¹³C谱中，13ppm所示为-CH₃-，70ppm表示的是碳碳三键， 170ppm左右表示的是-COO-，20ppm至30ppm之间的区域显示的是（-CH₂） -CH₂-，130ppm附近区域所示为碳碳双键。进一步说明菌株MZ01产生的生物表 面活性剂是一种脂类物质。

实施例3：菌株MZ01产生的表面活性剂CMC值测定

将按实施例2提纯干燥后的表面活性剂配制成浓度为0.025、0.04、0.05、 0.1、0.2、0.25、0.3g/l的一系列水溶液，使用上海方瑞仪器公司生产的QBZY-1 型表面张力仪在25℃下测定其表面张力，结果如图5所示。根据图可得，菌株 MZ01产生的表面活性剂其CMC值为0.1g/l，此时能将水的表面张力由72mN/m 降至30mN/m。结果表明，该表面活性剂对疏水性有机物具有较好的乳化增溶效 果。

实施例4：菌株降解原油实验

将营养肉汤过夜培养的菌株MZ01于6000rpm条件下离心5min，然后用无 菌水将沉淀的菌体洗涤三次，相同条件下离心5min，并用无菌水制成菌悬液并 调节OD₆₀₀至0.5。取1ml该菌悬液至含原油200mg/l的培养基A中，于25℃、 150rpm的条件下培养五天。设置空白，为不含有MZ01菌，两个平行实验组。 五天后，利用正十六烷萃取原油组分，并用正十六烷定容。然后用紫外-可见分 光光度计（UV-2550）于224nm测量原油的剩余量。结果如表2所示，五天原 油的去除率达50%以上，而菌株对原油的降解率在30%以上，表明菌株MZ01 对原油有较好的利用效果。

表2菌株MZ01降解原油的效果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。