一种云芝菌株以及利用其发酵产物提取云芝葡聚糖的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是本发明提供一种新的云芝菌株，以及利用该菌株 的发酵产物提取云芝葡聚糖的方法。

背景技术

云芝葡聚糖具有多种生物活性，研究表明其具有显著的抗肿瘤、抗溃疡、保肝护 肝、抗病毒、降血脂和免疫调节作用，被广泛应用于临床。目前的云芝葡聚糖均是从 现有的云芝菌株的发酵产物中提取获得的，并且目前通常采用例如水浸提法、酸提法 和碱提法等常规的提取工艺。在采用现有的云芝菌株以及现有的提取工艺中，所提取 获得的云芝葡聚糖的最高收率通常不超过10％。同时水浸提法在提取过程中要消耗大 量能量，而酸提法与碱提法则污染严重。

出人意外地，本申请人发现了一种新的云芝菌株，并进而在此基础上研发了新的 提取工艺，以此来提高云芝葡聚糖的纯度含量，很好地满足了人们对云芝葡聚糖的需 求以及环境要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的云芝菌株。

本发明的另一目的在于提供一种制备云芝葡聚糖的新方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种云芝菌株，其属非招菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae)，其 命名为Coriolus versicolor，其保藏登记号为CGMCC No.6760，保藏机构为：中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年11月07日。该菌株的 实验室编号为云芝菌株HT-6。

本发明的上述云芝菌株是从秦岭土壤通过初筛、复筛分离得到的。

菌株鉴定：通过观察HT-6菌株的菌体形态、培养特征，测定其生理生化指标， 测定16SrDNA基因序列，构建其系统进化树，最终确定HT-6为云芝菌株。

进一步地，本发明涉及一种制备云芝葡聚糖的新方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：菌株发酵步骤：将上述保藏登记号为CGMCC No.6760的云芝菌株接种 于液体培养基中进行发酵培养4-8天，然后将发酵产物在5000r/min离心10min得到 云芝菌丝体；所述液体培养基的组成为葡萄糖13.8g/L、蔗糖5g/L、酵母粉2g/L、 蛋白胨20g/L、KH₂PO₄ 2.5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L和VB₁ 8mg/L；所述发酵培 养条件为25～30℃，120～150r/min；

步骤二：提取步骤：(1)将上述云芝菌丝体加入2％的Na₂CO₃的60℃热水中， 二者的重量比为1∶5，浸提1～2h，反复浸提过滤2～3次，然后合并浸提液并浓缩至原 体积的1/5～1/3；

(2)将浓缩后的浸提液采用酶-超声波联用法提取云芝葡聚糖，提取方法如下： 称取浸提液置于20倍体积的水中制得水稀释液，用占水稀释液总量1.5重量％纤维素 酶、0.8重量％木瓜蛋白酶、3.5重量％菠萝蛋白酶混合酶系在温度为50℃，pH值为 5.5的条件下酶解100min，随后把酶解的产物经过升温灭酶，再按照料液比为1∶25 的比例，超声提取20min；

(3)将提取液过滤并减压浓缩，除去蛋白，并用活性碳进行脱色处理，然后将 滤液离心得上清液，在上清液中加入浓度为95％的乙醇进行沉淀，沉淀物用无水乙醇 进行滤洗，真空干燥得到云芝多糖粉末，经高效液相色谱测定分子量，红外光谱测定、 GC测定、核磁共振测定进行组成糖分析为云芝葡聚糖。

所述步骤(3)中的减压浓缩是在压力为-0.03Mpa下，温度为70℃进行的；浓缩 时间为1小时。

所述步骤(3)中除去蛋白的方法为Sevag法。

除非另有说明，本说明书中的“％”为重量百分比。

本发明的制备方法能显著提高云芝葡聚糖提取率，提取获得的云芝葡聚糖的收率 通常超过30％，与常规的水浸提法、酸提法和碱提法等常规的提取工艺所缩短的操作 时间近75％，降低能源的消耗，对环境友好，所采用的仪器自动化程度高操作简单， 从而为云芝多糖的工业化生产提供了可能。

附图说明

图1为本发明云芝葡聚糖制备流程图。

具体实施方案：

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限于下列实施例。

实施例1：一种云芝葡聚糖的制备方法，步骤如下

(1)将本申请保藏登记号为CGMCC No.6760的云芝菌株接种于液体培养基进行 发酵培养4天，然后将发酵液在5000r/min离心10min得到云芝菌丝体；所 述液体培养基的组分为葡萄糖13.8g/L、蔗糖5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨 20g/L、KH₂PO₄ 2.5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L和VB₁ 8mg/L；所述发酵 培养条件为25℃，120r/min；

(2)按重量比为1∶5，将云芝菌丝体加入质量分数为2％的Na₂CO₃的60℃热水中， 浸提1～2h，反复浸提过滤2～3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/5～1 /3；

(3)称取浸提液于20倍体积的水中制得水稀释液，用占水稀释液总量1.5重量％ 纤维素酶、0.8重量％木瓜蛋白酶、3.5重量％菠萝蛋白酶混合酶系在温度为 50℃，pH值为5.5的条件下酶解100min，随后把酶解的产物经过升温灭酶， 再按照料液比为1∶25的比例，超声提取20min；

(4)将提取液过滤并在-0.03Mpa，70℃下减压浓缩浓缩时间为1小时，采用Sevag 法除去蛋白，并用活性碳进行脱色处理，然后将滤液离心得上清，在上清液 中加入浓度为95％的乙醇进行沉淀，沉淀物用无水乙醇进行虑洗，真空干燥 得到云芝多糖粉末，经高效液相色谱测定分子量，红外光谱测定、GC测定、 核磁共振测定进行组成糖分析为云芝葡聚糖。提取获得的云芝葡聚糖的收率 为35％，与常规的水浸提法、酸提法和碱提法等常规的提取工艺所缩短的操 作时间约76％，

实施例2：一种云芝葡聚糖的制备方法，步骤如下：

(1)将本申请保藏登记号为CGMCC No.6760的云芝菌株接种于液体培养基中进 行发酵培养6天，然后将发酵液在5000r/min离心10min得到云芝菌丝体。 所述发酵液中含葡萄糖13.8g/L、蔗糖5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨20g/L、 KH₂PO₄ 2.5g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5g/L和VB₁ 8mg/L；所述发酵培养条件 为30℃，140r/min；

(2)按重量比为1∶5，将云芝菌丝体加入质量分数2％Na₂CO₃的60℃热水中，浸 提1～2h，反复浸提过滤2～3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/5～1 /3；

(3)称取浸提液于20倍体积的水中制得水稀释液，用占水稀释液总量2.0％纤维 素酶、1％木瓜蛋白酶、3.0％菠萝蛋白酶混合酶系在温度为50℃，pH值为 5.5的条件下酶解100min，随后把酶解的产物经过升温灭酶，再按照料液比 为1∶25的比例，超声提取20min；

(4)将提取液过滤并在-0.03Mpa，70℃下减压浓缩浓缩时间为1小时，Sevag法 除去蛋白，并用活性碳进行脱色处理，然后将滤液离心得上清，在上清液中 加入浓度为95％的乙醇进行沉淀，沉淀物用无水乙醇进行虑洗，真空干燥得 到云芝多糖粉末，经高效液相色谱测定分子量，红外光谱测定、GC测定、 核磁共振测定进行组成糖分析，确定为云芝葡聚糖。提取获得的云芝葡聚糖 的收率为33％，与常规的水浸提法、酸提法和碱提法等常规的提取工艺所缩 短的操作时间约75％。

本发明的一种云芝菌株以及利用其发酵产物提取云芝葡聚糖的方法已经通 过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、 工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容， 所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在 本发明的范围之内。