肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因(INPP4b-基因)中的人类染色体4的单核苷酸多形性用于多发硬化症的诊断或者预诊断

本发明涉应用人类4号染色体上肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）在碱基位143470133（rs13102150）上碱基的单核苷酸多形性（SNP），来诊断或者预诊断多发硬化症，或者检测患多发硬化症的风险。

导致神经组织退化的疾病包括青年和老年中多种不同的紊乱。此类疾病导致大脑中和／或脊髓中功能活性神经元的减少。神经元的坏死会有不同的原因导致：蛋白质或蛋白质片段的沉积，新陈代谢出问题，中毒，炎症，血流不畅或者头部受伤。例如在中风的时候，所有这些因素引起神经元和胶质细胞的进一步大量流失。在其它情况中，它们引起特殊神经元组和官能系统的损伤，例如在帕金森症（PD）中或者在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中。

然而各个病症的临床特征或模式经常很难加以区分。这给明确诊断所需要的检查带来了困难。另外，不同疾病的进程也差异很大。因此，对于一些罕见的病症经常在尸检时才第一次能够准确确定疾病。

在年轻人群中，多发硬化症（MS）很大程度上代表了神经退行性疾病。多发硬化症是中枢神经系统（ZNS）的一种慢性炎症自身免疫系统疾病。该疾病特征在于神经髓鞘的损坏，所述髓鞘包围神经细胞的轴突。在多发硬化症（MS）的早期阶段，患者通常可以完全从症状中恢复。然而保留了结构性损伤，并且临床损伤的可能性随着每一次复发而提高。损伤大多局限在脑白质的病灶区域。结构性改变引起不同的临床病症，例如视觉障碍，行走问题，共济失调，感觉异常，肌无力和轻瘫，以及语言和协调障碍，且还伴有神经病学症状。多发硬化症（MS）的原因始终还是未知的。

疾病通常在20到30岁之间的年轻成年人中已经开始，其中女性明显更多。多发硬化症（MS）为自身免疫疾病，他在组织上的特征在于外周炎症细胞的浸润，其中大多涉及到T和B淋巴细胞。这些细胞位于局部受损点上的白质中，它们在那里与髓鞘相互作用。由于髓鞘的损坏，轴突遭到暴露。在健康状态下，动作电位通过在郎飞氏节上的跳跃性传导进行传递。该节是在轴突上的两个少突胶质细胞之间完全没有或者仅具有少量的髓鞘而形成的。损坏的轴突隔离不仅破坏跳跃性传导而且还因为离子浓度的改变导致代谢问题。

对于多发硬化症（MS）的疾病原因仅仅存在一些推测，即遗传因素或者环境影响也许能够在疾病的进程中起到一定作用。生物因素的参入同样被讨论过。

尤其是用于多发硬化症（MS）的基因指示剂是值得期待的，因为以此方式可能有明确的诊断。至今的学说表明，患多发硬化症（MS）发病率的提高与人类白细胞抗原（HLA）DR2的存有相关性。HLA-DR2是HLA部分中用于多发硬化症（MS）明确的基因指示剂之一。除了HLA-DR2-单体，其他人还调整了HLA部分中的用于多发硬化症（MS）的敏感性位点，例如HLA-DR3。然而遗传学研究表明，其它遗传因素对用于多发硬化症（MS）的敏感性也有影响。因此致力于寻找其它基因指示剂。

本发明的目标在于，找到更多与多发硬化症相关的基因指示剂。

在人类范围中，该任务将通过在肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类4号染色体的碱基位143470133（rs13102150）上碱基的单核苷酸多形性来完成，其用于多发硬化症的诊断或者预诊断，或者用于确定患多发硬化症的风险，并为此找到应用领域。

寻找参与多基因疾病例如多发硬化症（MS）的基因是非常复杂和大规模的。使用不同遗传作图组合，其中，首先使用动物模型。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是用于多发硬化症（MS）的动物模型。以此方法能够从小鼠到较高级的灵长类动物的不同种物种中引起疾病。动物模型与人类疾病具有较高的一致性，例如伴随复发和康复阶段的急、慢性疾病，像中枢神经系统（ZNS）的白质中的脱髓鞘。在小鼠实验中能够以两种不同的方式引起自身免疫性脑脊髓炎（EAE），也就是说，借助活性的或者适应性的免疫。活性疫苗注射包括例如带有髓鞘蛋白自身抗原的免疫或者带有脊髓匀质的免疫。适应性免疫是给小鼠接种之前免疫过的老鼠淋巴结细胞自或者接种激活的抗原特异性T细胞系。

为了分析而使用诱发电位（EPs）。诱发电位当病人被刺激后在其效应器官被记录到的电位。例如在这里值得一提的是肌肉萎缩。诱发电位（EPs）表明是否存在损伤。能够使用不同的诱发电位（EPs）用于诊断，例如视觉诱发电位（VEPs）或运动机能诱发电位（MEPs）。为了诊断而使用大脑电刺激来引起肢体肌肉中的运动机能诱发电位（MEPs）。由于髓鞘质分离的损伤导致神经元传导的暂时扩散，由此得到变化了的脑皮质引发回应。脑皮质运动机能诱发电位（cMEP）提供生理学状况的定量数据，并且因此尤其适合于功能研究。

多发硬化症（MS）和自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是综合疾病，许多位点（基因位点）参与其中，它能够具有表型作用（数量性状位点，QTL）。数量性状位点（QTL）是定量的特征位置，也就是说，基因组上的变量点影响确定的特征。当多于一个的基因参与到该项疾病中时，这些点的发现对寻找关于疾病的基因非常有帮助，。因为特征并非由一个单独的基因所构成，所以每个参与的基因都限制该特征。

为了鉴定用于不同特征（特点）的备选基因而使用数量性状位点（QTL）作图。在小鼠实验中，为了数量性状位点（QTL）作图在受控的环境条件下而使用近亲繁殖株，例如C57BI/6、SJL、FVB和C57BL/10.S。

为了基因位点的作图而使用不同的基因标记，例如限制性片段长度多态性（RFLPs），高变限制性片段长度多态性（RFLPs），小卫星，微卫星或者单核苷酸多形性（SNPs）。QTL EAE 31是意义重大的。

因为一个单独的数量性状位点（QTL）就能够包含上百个基因，所以为接下来的研究选择单个的备选基因是要求很高的。因此为了确定精确的染色体位点，补充的精细作图是必要的。为此而使用的是建立同类品系，重组选择和进一步的交叉品系。制造株的第一选项是回交群体的产生。回交株包含F1个体与双亲株之一的配对（参见图1B）。交叉代将通过F1代同胞的配对来制造，这样得到混合的F2群体（参见图1B）。不同表型的两株混合群体的分析是可能的。为了数量性状位点作图和染色体位点作图而应用软件工具。

不同鼠种系之间的差别能够借助高密度基因标记或者通过建立种类分布模型来分析。此外，单核苷酸多形性（SNPs）能够指明近亲繁殖株之间系统发育的关系。可能通过比较数量性状位点（QTL）区域中不同鼠种的单核苷酸多形性（SNPs）来确定哪些片段相同或者拥有不同的起源。根据单核苷酸多形性（SNPs）能够将株划分到单体型子群中。单核苷酸多形性（SNPs）有助于将信息与表型数据相组合。

另一方法是比较基因组（genomic）。根据不同种（例如大鼠、小鼠、人类，参加图2）的遗传学比较能够确定共同的序列片段。另外能够确定基因位点、高度保守区或者未编码DNA的数量。不同物种间疾病基因位点之内的高度保守区能够借助比较基因组来确定。这加快了可能疾病基因的分离。

单体型分析用于数量性状位点（QTL）（EAE31）的精细作图，单体型分析使用相互遗传学分析和基因表达谱。在此，肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）被确定为鼠8号染色体上的最佳候选基因（参见图3）。

Inpp4b（蛋白质）是不依赖于Mg²⁺的磷酸酶，它催化磷脂-3,4-双磷酸盐的4位置上的磷酸盐的水解，肌醇-1,3,4-三磷酸盐的水解和肌醇-3,4-双磷酸盐的水解。小鼠蛋白质与人类有96%同源性相同，与大鼠有90%的同源性。

为了找到序列中的区，Inpp4b基因作为最佳备选基因序列在两种鼠类中被测序，即有抵抗能力的种C57BL/10.S和易受感染的种SJL。有抵抗能力的种抵抗EAE诱导，易受感染的种与EAE诱导反应。

序列差别与已知的多形性比较，多形性导致人类中氨基酸变异。SJL和C57BL/10.S中Inpp4b的编码序列在pGEM-T-简易-载体中克隆（promega），并且在cDNA中得到两个SNP区别，它们导致氨基酸（AS）的转移：c1434C/A（AS 478S/R）和c1655A/C（AS 552H/P）。

为了弄清是否一个或两个SNPs通过EAE易感染性决定而制造DNA结构，其各自包含一个突变（或者丝氨酸→精氨酸，或者组胺酸→脯氨酸）或者两个突变。由原核注射制造出转基因老鼠。EAE的诱导中证实，两个SNPs都很重要。

对于小鼠定位在8号染色体上的Inpp4b基因在人类身上位于4号染色体上。该基因自身是已知的，序列例如在安德森等“克隆cDNA和肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2特征”，J.Biolog.Chem.1997,272卷，38号，23859-23864页中描述出。此外，该基因例如编目在ENSEMBL数据库中（染色体4:142,949,186-143,383,906）。已知三种剪切体，即阿尔法、短型阿尔法和贝塔。在短型阿尔法剪切体中缺少外显子4。

所有随后关于各个SNPs的陈述与定义或者根据Ensembl数据库（Ensembl释放56-2009年9月；智人译本56.37a（GRCh37））的编号有关。Inpp4b基因或者单个碱基关于染色体4编码基因链的取向读取。

在相关性研究中检验了MS病人，其中39个SNPs适合作为基因标记。从身体样本中提取DNA，并且在Inpp4b基因范围内辨认各自序列。在研究中，总共349名被测试者加入到控制组中，他们并不患有多发硬化症MS，其中210名女性，152名男性。在患病病人组中有362人，其中4人具有临床独立的并发症状，8人是初级进行性的，3人进行性复发，244人在康复阶段，并且90人是次级进行性。

SNP标签的选取

借助Haploview软件中的Tagger算法选取39个SNPs标签，这覆盖了Inpp4b基因之内所有通常的单体型（http://www/broad.-mit.edu/mpg/tagger，www.hapmap.org）。算法基于r²。在SNPs之间使用严格的r²限定值（r²＞0.8）允许所选取的SNPs标签，它们解决大部分存在的单体型（参见Altshuler D,Brooks LD,Chakravarti A,Collins FS,Daly MJ & Donnelly P 2005International HapMap consortium a haplotype map of the human genome,Nature437,1299-1320;Barrett JC,Fry B,Maller J & Daly MJ 2005 Haploview:analysisand visualization of LD and haplotype maps,Bioinformatics 21,263-265）。选取较小等位基因频率（MAFs，minor allele frequencies）大于0.5的SNPs。

SNP基因分型

使用QIAamp DNA Blood Mini Kits（Diagen，USA）从外周血白细胞中提取遗传学DNA。所有SNPS的基因分型借助5’-核酸外切酶-检测（TaqMan assays on demand;Applied Biosystems,Inc.,【ABI】Foster City,CA）来实现，其中，使用生产者提供使用的引物。探针的荧光信号按照制造商说明来检测（TaqMan Assay for Real-Time PCR,7500 Real Time PCRSystem;ABI）。

为每一位被测试者确定EDSS，其表明疾病严重程度（ExpandedDisability Status Scale）。为了测试疾病易感染性种群以及为了测试EDSS值而应用Cochran-Armitage-Trend测试。所有被研究的SNPs的结果列在表1中。

“rs××××××××”的表述是根据Ensemble数据库的标记，人类染色体4上的SNP所代表的碱基对列在了第二栏中，P栏给出了所得电势值。A1栏给出了正常碱基，A2栏是SNPs的碱基。在此rs13102150【4:143470133（编码基因链，正链）】，rs2059510【4:143459907（编码基因链，正链）】和rs17717651【4:143453079（编码基因链，正链）】具有显著性，其中尤其rs13102150是很重要的（2010年1月11日的Ensembl数据库记录）。

表1

本发明相应的涉及在肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位143470133（rs13102150）上碱基的单核苷酸多形性（SNP），用于多发硬化症的诊断或者预诊断，或者用于确定患多发硬化症的风险。胞嘧啶一般位于该碱基位143470133上。该碱基在SNPs情况下被其他碱基所代替。“其他碱基”的概念在全篇中被理解为，碱基一般为碱基腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T），并且“其他碱基”的表述分别包括剩余三个碱基的组，也就是说，例如当在碱基位置143470133上通常存在胞嘧啶时，其他碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶，其中之一代替胞嘧啶存在。

本发明尤其涉及单核苷酸多形性，其为通过腺嘌呤在肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位143470133（rs13102150）上替换掉碱基胞嘧啶，用于多发硬化症的诊断或者预诊断，或者用于确定患多发硬化症的风险。

对于以下情况，即在碱基位143470133上另一碱基代替胞嘧啶存在，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶存在，将病人诊断或者预诊断为多发硬化症（MS），或者将病人归于高患病风险。

鉴于与EDSS结合的测试借助Jonckheere-Terpstra-测试实现。仅仅测试多发硬化症（MS）患者。如前所实施的那样，“扩展的残疾状况评分”（EDSS）为结果指标，其反应出多发硬化症患者残疾严重程度的情况。该指标始于0并止于10，其中，疾病的严重程度随着升高的数值而增加。医生凭EDSS的确定进行病人功能系统（FS）的研究。表2列出了结果。所示为MS结合测试中p＜0.1的SNPs，或者是用于与EDSS结合的Jonckheere-Terpstra-测试的SNPs。rs13102150尤其在这里也是很重要的。

表2

用于MS的单体分析借助“滑动窗口法”实现，其中，窗口大小设定为3。结果列于表3并展示在图4中。从单体型1至6中表明，肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位置143470133（rs13102150）、碱基位置143459907（rs2059510）和碱基位置143453079（rs17717651）上具有碱基SNPs的单体型1与伴有MS有显著性。

表3

相应的，本发明优选的实施方式特征在于，使用单体型，其包括在肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位143470133（rs13102150）、碱基位143459907（rs2059510）和碱基位143453079（rs17717651）上碱基的单核苷酸多形性（SNPs），用于多发硬化症的诊断或者预诊断，或者用于确定患多发硬化症的风险。

特别优选地，该单体型特征在于，多型性包括用腺嘌呤在碱基位143470133（rs13102150）上代替掉胞嘧啶，用胞嘧啶在碱基位143459907（rs2059510）上代替掉胸腺嘧啶和用腺嘌呤在碱基位143453079（rs17717651）上代替掉胞嘧啶。

换句话说，对于单体型而言，另一个碱基在碱基位143470133上代替胞嘧啶，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶，另一个碱基在碱基位143459907上代替胸腺嘧啶，特别是胞嘧啶代替胸腺嘧啶，并且另一个碱基在碱基位143453079上代替胞嘧啶，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶，用于将病人诊断或者预诊断为多发硬化症（MS），或者将病人归于高患病风险。

依据发明方法诊断或者预诊断多发硬化症（MS）或者用于确定被测试者的患MS的风险，至少分析一个肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位143470133（rs13102150）上的碱基，其中对于如下情况，即在那里存在不同于胞嘧啶的其他碱基，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶，那么将被测试者诊断为多发硬化症或者将被测试者归于高患病风险。

用于多发硬化症的诊断或者预诊断，或者用于确定被测试者患多发硬化症的风险的方法的优选实施方式中，至少分析肌醇聚磷酸盐-4-磷酸酶-类型2-基因（INPP4b-基因）中人类染色体4的碱基位143470133（rs13102150）、碱基位143459907（rs2059510）和碱基位143453079（rs17717651）上的碱基，其中对于如下情况，即其他碱基在碱基位143470133上代替胞嘧啶，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶，并且另一个碱基在碱基位143459907上代替胸腺嘧啶，特别是胞嘧啶代替胸腺嘧啶，并且另一个碱基在碱基位143453079上代替胞嘧啶，特别是腺嘌呤代替胞嘧啶，用于将被测试者诊断为多发硬化症（MS），或者将被测试者归于高患病风险。

在本发明方法中，从被测试者上获取身体材料，优选的是细胞质和/或组织材料。特别优选的获取血样。此外，提取作为基因信息载体的DNA，并且接下来确认序列，以及与人类染色体4根确切地说是Inpp4b基因相应位置上的参考序列比较。多种专业人员已知的方法适合用于确认序列，该方法还包括DNA的测序。用专业人员已知方法能够实现至少片段基因的扩增，用于DNA复制所要求的方法。例如在这里值得一提的是PCR和/或LCR。另外值得一提的例如是“自主序列复制”方法，转录扩展系统或者Q-Beta复制酶。

作为优先使用的检点方法,因为DNA测序是非常昂贵的，它并不要求完全测序。为此值得一提的方法如由QIAGEN公司提供的焦磷酸测序方法，用于探测DNA差别的特殊方法，如由ABI公司所提供的-PCR（基于实时PCR检测（Real-Time PCR-Based Assays）），或者Gensoric公司的电化学方法来检测DNA。EP1388589A1（段落[0111]之后）中描述了使用的其他鉴定方法。

附图说明

图1示出两种所使用的精细遗传作图方法。在图的A部分中示出了F1与亲代（FO）的回交的建立。在图的B部分中示出了与同胞间（F1）的F1杂交。

图2示出人类、小鼠和大鼠染色体片段的比较。示出了所有三个种属中QTL EAE 31的位置。

图3图解示出人类（A）和小鼠（B）的EAE31QTL。EAE31的精细基因作图指向基因Inpp4b。

图4示出单体型分析，基于表3给出总体p值用于亚单体型。2.5和3.0之间的线示出了用于多次测试校正后的显著临界值。