肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用

（一）技术领域

本发明涉及肝素酶II在解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用，以 及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方法。

（二）背景技术

肝素是有糖醛酸和D-氨基葡萄糖以α（1→4）糖苷键连接而成的重复 双糖单位组成的糖胺聚糖家族中的一员，是具有不同链长即不同分子 量的各种大小分子所组成的混合物，其分子量具有多分散性，一般在 3000~30000D之间，平均分子量15000D（大约为45个单糖）。作为目前 世界上使用最广泛最有效的抗凝抗血栓试剂之一，它用于临床诊断已 有60多年的历史。但其副作用也越来越明显，如大量的使用肝素会引 起出血、骨质疏松等症状。

低分子量肝素（Low Molecular Weight Heparin，LMWH）是分离肝 素得到的一些组分或肝素裂解产生的小片段，它可以克服肝素的一些 副作用而仍保持其抗凝抗血栓活性，因此低分子量肝素在临床上得到 了广泛的应用。英国药典规定：LMWH是指重均分子量不得大于8000， 分子量低于8000的物质不少于60%的肝素。

目前LMWH常用制备方法包括物理分离法和化学裂解法，但其中收率低 ，环境污染问题却不容忽视。

肝素酶是自然界中唯一一类能够特异性裂解肝素大分子中糖苷键的酶 类，可以用来解聚肝素制备低分子量肝素，目前肝素黄杆菌（F.hepa rinum）中已发现三种肝素酶（Heparinase，简称Hep）：肝素酶I， 肝素酶II，和肝素酶III，各有其不同的底物特异性，主要是作用位点 不同。目前大量的商业化低分子量肝素是通过以肝素酶部分解聚普通 肝素获得，这同样有可能发生肝素污染等危机以及会出现肝素的硫酸 化基团丢失或减少。

肝素前体（Heparosan）是某些病原菌荚膜中的糖胺聚糖成分，表达式 为[-GlcUA-β(1,4)-GlcNAc-α(1,4)-]n（其中GlcUA是葡萄糖醛酸； GlcNAc是葡萄糖乙酰胺），是构成大肠杆菌K5和巴斯德菌D型的荚膜多 糖的成分，利用巴斯德菌D型产生的heparosan的分子量为200~300 K Da，而利用大肠杆菌K5产生的heparosan的分子量为3~150 KDa，更接 近于肝素的分子量大小。因此，利用大肠杆菌K5荚膜多糖heparosan作 为前体合成肝素以及硫酸乙酰肝素得到人们的广泛关注。

由于酶的特异性，目前肝素酶仅用于解聚肝素，还未有以肝素酶对肝 素前体进行解聚的报道。

（三）发明内容

本发明目的是提供肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素中的应用 ，并提供一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素的方 法。

本发明采用的技术方案是：

肝素酶II在解聚肝素前体（Heparosan）制备低分子量肝素（Low Mo lecular Weight Heparin，LMWH）中的应用。

具体的，所述应用为：以肝素前体为反应底物，加入肝素酶II进行解 聚，解聚后的产物再经进一步常规脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，制 得所述低分子量肝素。虽然肝素前体的多糖骨架与肝素多糖骨架类似 ，但是 未将葡萄糖醛酸异构化为艾杜糖醛酸，也未硫酸化修饰，因此，解聚 后的产物需再经进一步脱乙酰、硫酸化和异构化修饰，才能获得本发 明低分子量肝素。脱乙酰方法指利用氢氧化钠脱去N-乙酰葡萄糖胺的 乙酰基；硫酸化指通过与三甲基铵三氧化硫共聚物和碳酸钠反应在脱 乙酰位硫酸化；所述异构化，是指利用C5-异构酶将D-GlcA异构化为L -IdoA。

优选的，所述解聚在25℃下进行，反应时间1.5h。

优选的，所述解聚在缓冲液中进行，缓冲液组成如下：乙酸钠100 m M，BSA 0.01%，乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7.0。

优选的，所述肝素酶II为重组肝素酶II。

本发明还涉及一种利用重组肝素酶II解聚肝素前体制备低分子量肝素 的方法，所述方法包括：

（1）根据已报道Flavobacterium heparinum肝素酶II基因序列（Ge nbank access number U27585.1）和氨基酸序列（Genbank acce ss number AAB18277.1）设计引物，从肝素黄杆菌基因组DNA扩增得 到肝素酶II基因片段，克隆到pET-15b表达载体中，获得重组载体pET 15b-hepB，pET15b-hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. co li BL21(DE3) /pET15b-hepB，重组菌经乳糖诱导后，菌液经细胞破 碎后提取目标蛋白，获得重组肝素酶II；

（2）Heparosan与重组肝素酶II在缓冲液中于25℃下反应1.5h，反应 液经分离纯化，得到解聚后的Heparosan；所述缓冲液组成为：乙酸钠 100 mM，BSA 0.01%，乙酸钙10 mM，溶剂为水，pH7.0；缓冲液中 Heparosan初始浓度为0.01~0.1g/mL，重组肝素酶II初始添加量为100 ~500U/mL；

（3）解聚后的Heparosan进一步进行脱乙酰、硫酸化和异构化反应， 制得所述低分子量肝素。

具体的，所述脱乙酰、硫酸化方法可如下：

解聚后的Heparosan溶解于1~3M氢氧化钠溶液，在60~90℃下反应3~6  h，反应液进一步稀释，冷却并用盐酸调pH至7，再一步加入羧酸钠和 三甲基铵三氧化硫共聚物反应12h后再加入等体积的羧酸钠和三甲基铵 三氧化硫共聚物在50℃继续反应12h。反应液冷却至室温，3500 Da  截留分子量 cellulose membrane透析过夜，透析液冻干即获脱盐、 N-硫酸化heparosan。

具体的，所述异构化方法可如下：

20~160 ng/ml C5差向异构酶（C-5 epimerase，C5Epi）和适量底 物在含0.05 M Hepes，0.015 M EDTA，0.1 M KCl，0.05% Tr itonX-100，pH7.4的反应系统中混合，并在37℃反应30分钟。然后加 入冷的0.05 M醋酸钠、0.05 M LiCl至pH 4.0停止反应，反应混和 液进行DEAE-cellulose柱层析纯化，即得所述低分子量肝素。

本发明的有益效果主要体现在：提供了肝素酶II在解聚肝素前体中的 新用途，提供了一种肝素酶法制备LMWH的新途径，该方法反应条件温 和，产品和酶易于分离，生产方便，而且酶可以反复使用，可进一步 节约成本，具有重大应用前景。

（四）附图说明

图1 为Heparinase II表达情况验证；

A中: lane 1：标准蛋白分子量标记（MBI）；lane 2、3：无和有 IPTG诱导的LB培养基培养菌体总蛋白；lane 4、5：无和有IPTG诱导 的LB培养 基培养菌体超声裂解后上清液；

B中: lane 1：标准蛋白分子量标记（MBI）; lane 2：无IPTG诱 导LB培养基培养的菌体总蛋白；lane3：乳糖自诱导培养基培养的菌体 总蛋白; lane 4：乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后上清液 5：乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后细胞碎片。

图2 为Heparinase II的Ni-NTA亲和层析效果；

lane 1, 7: 标准蛋白分子量标记（MBI）；lane 2：无IPTG诱导 LB培养基培养的菌体总蛋白 lane 3:乳糖自诱导培养基培养的菌体 总蛋白；lane 4：乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后上清液； lane 5：乳糖自诱导培养基培养的菌体超声裂解后细胞碎片；lane  6：Ni-NTA 亲和柱纯化所得肝素酶II。

图3 为Heparinase II SDS-PAGE分子量分析。

图4为 Bradford法测定蛋白质含量标准曲线。

图5为Heparinase II降解Heparosan的PAGE验证；Lane 1-9，肝素酶 II解聚肝素前体样本，反应时间依次为0小时，0.5小时，1小时，1.5 小时，2小时，2.5小时，3小时， 3.5小时，4小时。

图6 为Heparosan在缓冲液A和B中酶解的PAGE；Lane 1，酶解3小时 ；lane 2，酶解3.5小时；lane 3，酶解4小时；lane 4，酶解3h； lane 5，酶解3.5小时；lane 6，酶解4小时。

图7为Heparosan在不同酶量下解聚的PAGE；Lane 1-9，100ul 肝素 酶II解聚肝素前体样本，反应时间依次为0小时，0.5小时，1.0小时， 1.5小时，2.0小时，2.5小时，3.0小时，3.5小时，4.0小时； lane  10-18，50ul肝素酶II解聚肝素前体样本，反应时间依次为0小时， 0.5小时，1.0小时，1.5小时，2.0小时，2.5小时，3.0小时，3.5小时 ，4.0小时。

图8 为Heparosan纯品和解聚后Heparosan的1H-NMR图谱。

图9为制得的低分子量肝素的1H-NMR图谱。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：重组肝素酶II的获得

1、E. coli BL21(DE3)/pET15b-hepB表达肝素酶II

根据已报道Flavobacterium heparinum肝素酶II基因序列（Genbank  access number U27585.1）和氨基酸序列（Genbank access n umber AAB18277.1）

设计引物（HepII-F: 5’-CATGCCATGGATGAAAAGACAATTAT-3’

HepII-R: 5’-GGAATTCCATATGTTATCTCAAAAAACGGT-3’        部分为酶切位点，上游引物加入NcoI酶切位点，下游引物加入NdeI 酶切位点） ，从肝素黄杆菌Flavobacterium heparinum基因组DNA 扩增到肝素 酶II（Heparinase II）基因片段（SEQ ID No.1），克隆到pET-1 5b表达载体（Novagen，WI），获得重组载体pET15b-hepB，该载体含 有一个N-末端His6-tag标签，便于重组蛋白的后续Ni²⁺柱亲和层析。p ET15b-hepB转化E. coli BL21(DE3)获得重组菌E. coli BL21(DE 3) /pET15b-hepB。

E. coli BL21(DE3) /pET15b-hepB在LB培养基中，经过IPTG（0.1  mmol/L）诱导培养后，Heparinase II得到了表达，经过超声破碎 以后，发现其蛋白主要在细胞的碎片中（图1A）。

Heparinase II在自诱导培养基（8.95 g/L Na₂HPO₄，3.40 g/L  KH₂PO₄，2.68 g/L NH₄Cl，0.710 g/L Na₂SO₄，0.241 g/L Mg SO₄，0.0273 g/L FeCl₃，5.00 g/L蛋白胨，2.50 g/L 酵母膏， 2.00 g/L 葡萄糖，1.00 g/L乳糖，and 20.0 g/L 甘油，溶剂 为水，pH 7.0）中，经过乳糖诱导培养后，Heparinase II同样得到 了表达，经过超声破碎可以看出，与LB培养基中经IPTG诱导相比，有 更多的蛋白存在于上清中，但是同样可以发现，细胞碎片中还是有一 定量的目标蛋白（图1 B）。

通过对图1两种情况的比较，可以判断，自诱导培养基中用乳糖诱导有 相对较好的效果。因此，实验选用自诱导培养基和乳糖诱导作为实验 的培养和诱导方法，超声破碎提取蛋白，然后利用重组质粒的His-Ta g标签利用Ni-NTA agarose柱层析进行纯化。

已经验证利用自诱导培养基在乳糖诱导的情况下，Heparinase II的 比较多的部分以存在于上清中的可溶性蛋白为主。因此，在本发明中 ，直接利用重组质粒上构建的His-Tag标签，通过Ni-NTA层析，确定该 表达的条带即为目标条带（图2），通过UN-SCAN-IT gel 6.1分析其 条带的大小，根据marker的相对迁移位置和其对应条带分子量的对数 的倒数制作标准曲线，然后根据目标条带的相对迁移位置即可计算目 标条带的分子量，大 小约为84.82 kDa（图3），和文献中分析得到的大小相近。经过UN- SCAN-IT gel 6.1软件灰度分析，lane 6中目标蛋白的含量为96.2 9%，说明纯化的效果比较好。

Bradford法测定蛋白质含量的标准曲如图4所示。其线性相关性较好， 计算公式y=217.5x-6.2496，R²=0.9968。

经过测定粗酶及经过亲和层析的酶液的蛋白含量和酶活力，计算得到 纯化表，如表1所示。经过Ni-NTA亲和层析后，蛋白得到有效纯化，纯 化了约2.6倍，收率为41.90%，根据SDS-PAGE条带灰度分析，蛋白的纯 度为96.29%。

表1：Heparinase II一步纯化表

实施例2：反应条件对肝素酶Ⅱ对heparosan解聚效果的影响：

（1）肝素酶Ⅱ解聚heparosan方法

称取一定量的heparosan溶解于不同酶解缓冲液使其完全溶解，于25℃ 水浴锅预热10 min，加入不同量的肝素酶Ⅱ，在25℃下进行降解反应 ，在不同的反应时间取样。沸水浴5 min，使酶失活，冷却至室温。

经过Heparinase II的处理后，发现heparosan粗品发生了解聚，从图 5中可以看出，随着Heparinase II作用时间的增加，heparosan的大 分子量部分越来越少，小分子量条带逐渐增加，至4 h时已经几乎全 部都是小分子了。说明heparinase II对于heparosan有良好的降解作 用。

（2）酶解缓冲液对heparosan解聚的影响

酶解缓冲液对于酶解过程有着十分重要的影响意义，酶解缓冲液中所 含的离子和缓冲液的pH都对酶解过程有影响，酶解缓冲液不能过酸或 过碱，否则酶解过程会不以酶解为主导而酸解或碱解为主导。因此选 择合适的酶解缓冲液对于酶解的顺利进行起着决定性的作用。

本实验选择了两种酶解缓冲液，分别是（缓冲液A）200 mM NaCl、 500 mM Tris， pH7.4和（缓冲液B） 100 mM乙酸钠、0.01%（w /v） BSA和10 mM乙酸钙，pH7.0。分别称取0.05 g heparosan用 相应的酶解缓冲液配成1 mL酶解体系，相同的条件下比较不同的酶解 缓冲液对heparosan酶解效果的影响，实验结果见图6。

从上图可以看出，在相同的温度（25℃）、不同的酶解缓冲液中，经 过相同的酶解时间所得到的酶解结果不同。在酶解缓冲液A条件下，酶 解3 h后heparosan的分子量集中于中间偏下的位置；而在相同条件下 ，处于酶解缓冲液B中的heparosan的分子量却集中于极低分子量区域 。由此可知，肝素酶Ⅱ在酶解heparosan时，于酶解缓冲液B中的酶解 效果明显优于酶解缓冲液A。因此，可确认heparosan酶解的最佳酶解 缓冲液是缓冲液B（100 mM乙酸钠、0.01% BSA和10 mM乙酸钙，pH 7.0）。

（3）Hep II加入量对heparosan解聚的影响

将0.05 g heparosan溶于1 mL的酶解缓冲液B中，分别加入50 μ L和100 μL总活力同为199 U/mL的heparinase II（Hep II），在 25℃下进行酶解反应，比较酶用量对heparosan解聚的影响，实验结果 如图7所示。

从图7可知，Hep II酶用量的增加，对heparosan的解聚作用加强。如 图7中Lane3和Lane12是在相同的解聚时间（1 h）时的不同酶用量的 解聚样品，可清楚地发现，在50 μL Hep II酶解下的heparosan产 物的相对分子质量明显大于在100 μL Hep II酶解下的heparosan 产物的分子量。 当然解聚时加入酶量的多少还与酶活力有关，当酶活较高时也可适当 地降低酶加入量；反之可适当增加酶量。

（4）酶解反应时间对heparosan解聚的影响

反应时间的长短直接影响着解聚的效率和产物相对分子质量的分布。 本实验根据上述对酶解缓冲液和酶用量优化后的条件进行对酶解反应 时间的优化，即将0.05 g heparosan溶解于1 mL的酶解缓冲液B（ 100 mM乙酸钠、0.01% BSA和10 mM乙酸钙，溶剂为水，pH7.0）中 ，待heparosan完全溶解后加入100 μL的Hep II在25℃条件下进行 酶解，酶解过程中每隔半小时取样，取样时间分别是：0 h、0.5 h 、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h，样品在 100℃沸水浴5 min后进行多糖PAGE检测，结果如图7中的Lane 1-9所 示。

由图可知，反应时间对产物相对分子质量有明显的影响。反应时间与 heparosan解聚产物相对分子质量之间的关系，表现为随着反应时间的 增加，heparosan解聚产物相对分子质量急剧降低。因此，根据实际应 用需要选择一个合适的解聚时间，既要考虑到有效发挥HepⅡ的酶活力 ，又要保证解聚产品的品质。基于后续的研究需要由于酶解1.5 h时 ，heparosan解聚产物的分子量集中于中偏小的部分，与实验目的即获 得低分子量肝素相符，因此本实验选择1.5 h为最佳酶解时间。

（5） Hep II酶解heparosan产物的¹H-NMR分析

称取0.05 g heparosan溶于1 mL酶解缓冲液中，待完全溶解后于2 5℃水浴锅中水浴10 min后加入100 μL Hep II，置于25℃水浴锅 中进行酶解1.5 h。将酶解液于100℃水浴锅中煮沸10 min后5000× g离心15 min，用0.45 μm的过滤膜进行过滤后冻干。分别称取冻干 heparosan样品各20 mg加入到核磁管中，再加入0.4 mL的D₂O使样品 完全溶解，进行¹H-NMR 分析，heparosan酶解前后的结构变化，结果如图8所示。

从上图的¹H-NMR的图谱可知，a：GlcNAc，H1；b：GlcA，H1；c：Glc NAc，H2、H3、H5、H6；d：GlcA，H5；e：GlcA，H3、H4；GlcNAc，H 4；f：GlcA，H2；g：GlcNAc，CH3。Heparosan纯品和H₂O₂解聚后hep arosan在a-g的化学位移处的均是一样的，H₂O₂解聚后heparosan样品 在i处多出了一个化学位移。以此可以得出，经H₂O₂解聚后heparosan 样品的结构仅发生了细微的变化。可以用于进一步进行硫酸化等修饰 来制备肝素产品。

实施例3：低分子量肝素的制备

（1）heparosan的解聚：

将0.05 g heparosan溶于1 mL的酶解缓冲液B（100 mM乙酸钠、0 .01% BSA和10 mM乙酸钙，溶剂为水，pH7.0）中使其完全溶解，于 25℃水浴锅预热10 min，加入100 μL总活力为199 U/mL的hepari nase II（Hep II，按实施例1方法获得），在25℃下进行降解反应 1.5h，降解反应结束后沸水浴5 min，使酶失活，冷却至室温。具体 结果见实施例2。

（2）脱乙酰、硫酸化

取解聚后的Heparosan 5 mg溶解于2M氢氧化钠溶液1 mL，在60℃温 度下反应3 h，反应结束后反应液稀释至5 mL，冷却并用1M盐酸调p H至7，再一步加入羧酸钠60 mg和三甲基铵三氧化硫共聚物60 mg反 应12 h后再加入与前述等量的羧酸钠和三甲基铵三氧化硫共聚物在5 0℃继续反应12h。反应液冷却至室温，3500 Da 截留分子量 cell ulose membrane.透析过夜，透析液冻干即获脱盐、N-硫酸化heparo san。

（3）异构化：

在含0.05 M Hepes，0.015 M EDTA，0.1 M KCl，0.05% Trit onX-100，pH7.4的反应系统中加入100 ng/ml C5的差向异构酶（分 离纯化自牛肝， 5×10⁸ cpm ³H/mg/30min，醛酸C5-³H标记的脱硫 肝素为底物）和400 ng/ml的底物（步骤（2）所得脱盐、N-硫酸化h eparosan），并在37℃反应30分钟。然后加入冷的0.05 M醋酸钠、0 .05 M LiCl至pH 4.0停止反应， 反应混和液进行DEAE-cellulos e柱层析纯化，即得所述低分子量肝素。

最终制得的生物工程低分子量肝素产品1H NMR图谱见图9。