一种鹅细小病毒H株及其在小鹅瘟防治中的应用

技术领域

本发明属于生物疫苗领域，具体涉及一种鹅细小病毒H株及其在小鹅瘟防治 中的应用。

背景技术

小鹅瘟是由鹅细小病毒(GooseParvovirus，GPV)引起的雏鹅急性或亚急性败血 性传染病。该病是我国学者方定一于1956年首次在江苏扬州发现，60年代以来, 在欧洲、亚洲等国家相继报道该病的发生与流行。1974年，国际禽病学会(WPSA) 正式将该病命名为Derzsys氏病。该病主要侵害出壳后4～20日龄的雏鹅，也感染 雏鸭，传播速度快，发病率和死亡率较高达90%～100%，特别是近年来在我国的 一些省、市、自治区均有流行，给养鹅业造成严重危害，带来重大的经济损失，受 到国内外畜牧兽医工作者的广泛关注。因此，早期预防对控制本病十分重要。

各种抗菌药物对小鹅瘟均无治疗作用，本病的特异性防治有赖于被动免疫和主 动免疫。

发明内容

本发明目的之一是提供一株新分离的鹅细小病毒毒株；

本发明目的之二是将上述鹅细小病毒毒株应用于制备小鹅瘟灭活疫苗；

本发明目的之三是提供一种制备上述小鹅瘟灭活疫苗的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株新分离的鹅细小病毒毒株由本发明人自行分离得到，通过毒种的分离培 养、电镜负染观察、鹅胚中和试验、病毒的PCR检测及病毒的测序检测实验，确 定该毒株为一株新的鹅细小病毒，命名为鹅细小病毒H株（GPV-H），微生物保藏 号是：CGMCC No.6851。分类名是：鹅细小病毒；保藏时间是：2012年11月13 日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明鹅细小病毒（GPV）H株的分离结果显示：病毒盲传5代，多数鹅胚于 72～120h死亡。剖检鹅胚可见绒毛尿囊膜水肿，胚头，颈部、胸部、爪、翅尖及 喙旁均有出血。头及颈部水肿。收获的鹅胚尿囊液经红细胞凝集试验检测无血凝活 性。

本发明鹅细小病毒（GPV）H株的电镜负染观察结果显示：电镜照片可见，病 毒粒子直径约为20nm，呈球形，无囊膜，具有典型的细小病毒特征。见附图1。

本发明鹅细小病毒（GPV）H株的鹅胚中和试验结果显示：试验组鹅胚全部存 活，而对照组经5～6d全部死亡，死亡鹅胚出血，水肿。说明小鹅瘟抗血清可中和 该病毒。

本发明鹅细小病毒（GPV）H株的病毒的PCR检测结果显示：通过小鹅瘟病 毒特异性引物和相应的PCR试验，经1%琼脂糖凝胶电泳，约在500bp处出现了特 异性的DNA条带。见附图2。

本发明鹅细小病毒（GPV）H株的测序检测结果显示：利用DNA MAN软件， 将H株VP3基因序列与参考毒株的相应序列进行比较，核苷酸酸同源性在95.9%～ 99.1%，氨基酸同源性在97.9%～99.6%之间。通过基因进化树分析可以看出，H 株与黑龙江分离到的毒株关系较近。见附图3、4、5。

进一步的，本发明还提出了所述的鹅细小病毒H株在制备小鹅瘟灭活疫苗中 的应用。

本发明的一种小鹅瘟灭活疫苗，其特征在于有效成分为灭活后的鹅细小病毒H 株，所述的鹅细小病毒H株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏编号为CGMCC NO.6851。

更进一步的，本发明还提供了一种制备以上所述的小鹅瘟灭活疫苗的方法，其 特征在于包括以下步骤：将所述鹅细小病毒H株进行培养，得到鹅细小病毒抗原 液，将鹅细小病毒抗原液灭活、浓缩，分别配制油相和水相，将油相和水相混合后 乳化，即得小鹅瘟灭活疫苗。

在本发明中，优选的，所述的抗原液按照以下方法制备：

取所述的鹅细小病毒H株毒种（保藏编号为CGMCC NO.6851），用灭菌生理 盐水稀释至10^-3～10^-4，尿囊腔内接种12日龄无小鹅瘟抗体的鹅胚，0.2mL/胚，接 种后密封针孔，置37℃孵育，不必翻蛋，鸡胚接种后，每天照蛋2次，将72小时 前死亡的鹅胚弃去；此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的胚随时取出，直至216 小时，将72～216小时死亡鹅胚置于4℃冷却4～24小时；用碘酊消毒气室部位， 然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，挑破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取鹅 胚尿囊液，即为抗原液。

优选的，进一步的，将得到的抗原液进行5倍浓缩。

在本发明中，优选的，所述的油相按照以下方法制备：白油94份（以毫升为 单位）、司本-80 6份（以毫升为单位），混合后加热，加入硬脂酸铝2份（以克为 单位）混合均匀，即得油相。

在本发明中，优选的，所述水相按照以下方法制备：吐温-80 4份（以毫升为 单位）、灭活浓缩后的病毒抗原液96份（以毫升为单位），混合均匀，即得水相。

在本发明中，优选的，所述水相和油相按体积比为1：2混合，并加入1%（w/v） 硫柳汞溶液，使得硫柳汞最终浓度为0.01%（w/v）。

此处“w/v”表示的是质量（g）与体积（ml）的比，1%（w/v）硫柳汞溶液即 100ml水中含有硫柳汞的量为1g。

相较于现有技术，本发明的优点在于：

1、采用浓缩工艺，从而减少疫苗注射剂量，降低动物的应激反应，提高生产 性能。

2、将本发明灭活疫苗免疫种鹅，种鹅免疫血清琼扩抗体效价≥25，其下一代 雏鹅即可获得有效被动免疫保护。

3、本发明灭活疫苗不同剂量及批次免疫试验结果显示，注射0.05mL小鹅瘟 灭活疫苗，对雏鹅的保护率为97.78%。

4、本发明灭活疫苗免疫持续期试验结果显示，注射该疫苗后3天产生抗体， 免疫后5周抗鹅细小病毒抗体达到最高，并能维持到免疫后15周，免疫后20周， 抗体开始缓慢下降，免疫有效期可以达到6个月。

5、本发明灭活疫苗安全性试验结果显示，按照一次单剂量、重复单剂量和一 次大剂量（0.5mL/只）注射雏鹅，在观察时间内，均无任何不良反应，表明制备的 小鹅瘟灭活疫苗安全性良好。

附图说明

图1为鹅细小病毒H株的电镜检查结果；

图2为鹅细小病毒H株的PCR检测结果，其中，1为PCR扩增结果、2为2000 DNAMarker、3为阴性对照；

图3为不同毒株的VP3基因序列比较分析图；

图4为不同毒株的VP3基因推导氨基酸序列比较分析图；

图5为鹅细小病毒H株和其他几株GPVVP3的进化树分析图；

图6小鹅瘟灭活疫苗的方法流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描 述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。 本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术 方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围 内。

实施例1：鹅细小病毒H株的分离、鉴定及结果

1鹅细小病毒H株的分离、鉴定

1.1鹅细小病毒H株毒种的分离培养

无菌采集病死雏鹅的肝、脾组织，经冻融后剪碎磨细，用灭菌pH7.4PBS作 1：5～1：10稀释，经3000rpm离心30min，取上清液加入抗生素，使每毫升上清 液含有2000IU青霉素和2000μg链霉素，于37℃温箱作用30min后，按4:1加入 三氯甲烷，充分混匀后，置37℃温箱作用60min，经3000rpm离心30min，取上清 液加入抗生素,剂量同上，作为分离病毒材料。将上述病毒分离材料经尿囊腔接种 10枚12日龄无小鹅瘟抗体的鹅胚，0.2mL/胚，置37℃孵化，每天照胚2～4次， 观察9d。弃去72h以前死亡的鹅胚，72h以后死亡的鹅胚取出，置4～8℃冰箱内 过夜。无菌吸取尿囊液冻存，并观察鹅胚病变。

1.2电镜负染观察

将待检的尿囊液3000rpm离心30min，吸取上清液0.2mL，与生理盐水0.7mL 和小鹅瘟抗血清0.1mL充分混合。将混合液感作1h，然后4℃过夜。将混合液 15000rpm离心30min，去上清，将沉淀悬浮在少量蒸馏水中，涂片，用2%磷钨酸 负染后立即镜检。

1.3鹅胚中和试验

取收获的尿囊液做1：100稀释，与小鹅瘟抗血清（购自东北农业大学）等量 混合，37℃作用1h后，按0.2mL/胚接种鹅胚，观察记录鹅胚死亡情况，直至鹅胚 接种后216h。

1.4鹅细小病毒H株的PCR检测

根据鹅细小病毒GB株的全基因序列自行设计一对引物（由上海生物工程有 限公司合成），设计引物，P1：5`-GCCGAATTCATGCGGAATCTGAA-3`；P2： 5`-CAGGCGGCCGCACAGGTT-3`，扩增VP3区段蛋白基因，大小为534bp。

采用SDS-蛋白酶K方法提取尿囊液中的病毒核酸，然后用TE液悬浮，-20℃ 保存备用。以提取的小鹅瘟病毒核酸为模板进行PCR扩增，反应体系为：ddH₂O 35μL、10×PCR Buffer 5μL、mix dNTP(2.5mmol/L)4μL、上游引物(50pmol/μL) 1μL、下游引物(50pmol/μL)1μL、模板DNA 3μL、rTaq酶0.5μL、ddH2O。优选 的最佳反应条件为:95℃预变性5min、94℃变性1min、57℃退火1min、72℃延 伸1min，最后72℃延伸10min，共30个循环。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5病毒的测序检测

克隆H株VP3基因，寄送上海生物工程有限公司进行测序。

2结果

2.1鹅细小病毒H株分离培养结果

鹅细小病毒H株盲传5代，多数鹅胚于72～120h死亡。剖检鹅胚可见绒毛 尿囊膜水肿，胚头、颈部、胸部、爪、翅尖及喙旁均有出血。头及颈部水肿。收获 的鹅胚尿囊液经红细胞凝集试验检测无血凝活性。

2.2鹅细小病毒H株电镜负染观察结果

鹅细小病毒H株的电镜负染观察结果显示：病毒粒子直径约为20nm，呈球 形，无囊膜，具有典型的细小病毒特征（图1）。

2.3鹅细小病毒H株的鹅胚中和实验结果

试验组鹅胚全部存活，而对照组经5～6d全部死亡，死亡鹅胚出血，水肿。 说明小鹅瘟抗血清可中和该病毒。

2.4鹅细小病毒H株病毒的PCR检测结果

通过小鹅瘟病毒特异性引物和相应的PCR试验，经1%琼脂糖凝胶电泳，约 在500bp处出现了特异性的DNA条带（图2）。

2.5鹅细小病毒H株的测序结果

利用DNA MAN软件，将H株VP3基因序列与参考毒株的相应序列进行比较， 核苷酸同源性在95.9%～99.1%，氨基酸同源性在97.9%～99.6%之间。通过基因进 化树分析可以看出，H株与黑龙江分离到的毒株关系较近（图3、4、5），将分离 得到的鹅细小病毒H株冻干保存。

实施例2：疫苗用生产种子批建立

1基础种子批建立：取分离的冻干毒种，以pH7.4PBS作1：100稀释，接种 12日龄无小鹅瘟抗体鹅胚，0.2mL/胚，每日照胚2～4次，观察7d，弃掉72h以前 死亡的鹅胚，收集72h以后死亡的鹅胚，吸取尿囊液，无菌检验，并观察胎儿病变， 将无菌检验合格的尿囊液充分混合，分装，冻干保存。

2生产种子批建立：取无小鹅瘟抗体的12日龄鹅胚，接种基础毒种，37～38℃ 孵育，每天照胚2～4次，观察7d，72h以前死亡的鹅胚弃掉，吸取72～167h死亡 鹅胚的尿囊液，定量分装于玻瓶内，置-80℃冰箱内保存，按生产种子批指定的检 验标准进行检验，合格后用作生产毒种。

将合格后用作生产毒种的鹅细小病毒H株保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6851。

实施例3小鹅瘟灭活疫苗的制备

1制苗用抗原液的制备

取生产用鹅细小病毒H株毒种（保藏编号为CGMCC NO.6851。），用灭菌生 理盐水稀释至10^-3，尿囊腔内接种12日龄无小鹅瘟抗体的鹅胚，0.2mL/胚，接种 后密封针孔，置37℃孵育，不必翻蛋。鸡胚接种后，每天照蛋2次，将72小时前 死亡的鹅胚弃去。此后，每4～6小时照蛋1次，死亡的胚随时取出，直至216小 时，将72～216小时死亡鹅胚置于4℃冷却12小时。用碘酊消毒气室部位，然后 以无菌方法剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，挑破绒毛尿囊膜及羊膜，吸取鹅胚尿 囊液，即抗原液，冷冻保存。

2浓缩：取出冷藏的抗原液，在无菌条件下，用装有10层纱布和1层300 目铜纱的无菌漏斗过滤制苗用抗原液，除去尿囊液残渣和其它粗颗粒杂质。选用合 适孔径的浓缩膜，按照病毒浓缩机操作要求，在4℃条件下浓缩抗原液。抗原液浓 缩到5倍。

3灭活：将抗原液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10%的甲醛 溶液，在不断搅拌时加入含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓 度为0.1%。将灭活罐升温至37℃（以罐内温度达到37℃开始计时），维持灭活时 间16小时，期间不停缓慢搅拌。灭活结束后，取样10mL，用于做灭活检验和无 菌检验。

4油佐剂灭活疫苗的配制

4.1油相制备：取优质白油94毫升，加司本-80 6毫升，混合后加热，另加 硬脂酸铝2克，一边加一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

4.2水相制备：取4毫升吐温-80，加入到灭活的病毒抗原液96毫升中，使 吐温-80充分溶解。

4.3配苗及乳化：取60毫升油相加入乳化灌内，开动电机慢速搅拌，同时徐 徐加入上述30毫升水相，加完后继续搅拌，同时加入1%（w/v）硫柳汞溶液0.9 毫升，使其最终浓度为0.01%（w/v）；然后通过均质机乳化。制成小鹅瘟灭活疫苗。 乳化后，取样3～5毫升，以3000rpm离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化1 次。

实施例4：小鹅瘟灭活疫苗的应用

1、种鹅血清琼扩抗体水平与下一代雏鹅被动免疫保护力关系

三批小鹅瘟灭活疫苗（按照实施例3的方法制备）分别免疫开产种鹅，对每批 次血清琼扩抗体效价分别为2³、2⁴、2⁵和2⁶产蛋种鹅各选20只母鹅、4只授精用 公鹅为一组。隔离饲养7天后，再次采血分离血清，测定琼扩抗体效价，同时收集 当天所产蛋，孵化出1日龄雏鹅用于攻击100LD₅₀/0.2mL的鹅细小病毒H株（强 毒），保藏编号为：CGMCC No.6851，观察10天并作临床记录，10日龄称量体重， 设立非免疫对照鹅。判定种鹅血清琼扩抗体水平与下一代雏鹅被动免疫保护力关 系，结果见表1。

表1种鹅血清中和抗体水平与其下一代雏鹅被动免疫保护力关系

注：分母为试验数，分子为存活数。

结果显示小鹅瘟灭活疫苗免疫种鹅，免疫血清琼扩抗体效价≥2⁵，其下一代雏 鹅可获得有效被动免疫保护。

2、对雏鹅不同剂量及批次的小鹅瘟灭活疫苗免疫试验

取3批小鹅瘟灭活疫苗（按照实施例3的方法制备），按0.02mL/只、0.05mL/ 只和0.10mL/只，接种1日龄易感雏鹅，于接种后6日后攻击鹅细小病毒H株，保 藏编号为：CGMCC No.6851，100LD₅₀/0.2mL，观察雏鹅的保护情况，结果见表2。 对试验中死亡的雏鹅，按死亡数的1/3取样做分离病毒检查，结果均呈阳性。

表2不同剂量及批次的小鹅瘟灭活疫苗免疫试验结果

注：分母为试验数，分子为存活数。

不同剂量小鹅瘟灭活疫苗的免疫试验，分别注射0.02mL/只、0.05mL/只和 0.10mL/只，攻击小鹅瘟强毒后，雏鹅耐受强毒攻击，0.05mL能保护88/90，保护 率为97.78%，而0.02mL仅能保护80/90雏鹅，保护率为88.89%。

3、小鹅瘟灭活疫苗安全性试验

3.1一次单剂量注射的安全试验

使用3批小鹅瘟灭活疫苗，一次注射雏鹅0.05mL/只，雏鹅注射局部或全身 均无不良反应，结果见表3。

表3一次单剂量注射的安全试验结果

3.2单剂量重复注射抗体的安全试验

使用3批小鹅瘟灭活疫苗，2次重复注射雏鹅0.05mL/只，雏鹅注射局部或全 身均无不良反应，结果见表4。

表4单剂量重复注射安全试验结果

3.3一次大剂量注射的安全试验

以3批小鹅瘟灭活疫苗一次大剂量注射雏鹅，0.5mL/只，雏鹅注射局部或全 身均无任何不良反应，结果见表5。

表5大剂量注射安全试验结果

以3批制备的小鹅瘟灭活疫苗，按照一次单剂量、重复单剂量和一次大剂量 注射雏鹅，在观察时间内，均无任何不良反应，表明制备的小鹅瘟灭活疫苗安全性 良好。

4、实验室免疫持续期试验

以3批小鹅瘟灭活疫苗，用1日龄雏鹅颈部皮下注射0.05mL小鹅瘟灭活疫 苗，每个试验组免疫30只。对照组为1日龄雏鹅，共设10只。分别在免疫后的3 天、3周、5周、10周、15周、20周、20周和25周采血，应用琼脂扩散试验检测 抗鹅细小病毒抗体，每次10只，结果见表6。

表6小鹅瘟灭活疫苗持续期试验结果

免疫后3天即可产生抗体；在免疫后5周，抗鹅细小病毒抗体达到最高；并能 维持到免疫后15周，免疫后20周，抗体开始缓慢下降，免疫有效期可以达到6 个月。