具有低免疫副作用的神经生长因子突变体的制备方法及其药物应用价值

发明领域：

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及鼠源神经生长因子 (mNGF)与脂类小分子lysoPS复合物的晶体结构以及复合物的细胞生物 学效应。具体地，本发明通过晶体结构分析确定了mNGF结合lysoPS的 关键氨基酸，即第88位赖氨酸，随后利用定点突变技术突变该位点，制 备突变体蛋白并开展细胞实验。研究结果表明，mNGF突变体蛋白结合 lysoPS的能力明显下降，其对细胞的毒副作用也明显降低。本发明提供上 述复合物的晶体结构，脂类小分子lysoPS的结构特点，mNGF突变体蛋白 的制备方法以及其在调控免疫系统和神经系统药物方面的用途。

背景技术：

神经生长因子(NGF)在人体中广泛分布，是一个有着复杂功能的生 物活性蛋白。学者们对NGF的研究遍及NGF提取纯化、基因定位、家族 成员、膜受体，到它的转运、膜内信号传导和调控机制，还有NGF的三 维结构以及与受体复合物的三维结构。成熟的有生物活性的NGF以同源 二聚体的形式存在于生物体中，其单体是含有120个氨基酸的多肽，分子 量约为13kD。两个单体的折叠片以广泛的疏水作用形成稳定非共价的活 性双体形式。

NGF具有神经元营养和促进突起生长双重生物学功能，对种属和周围 神经元的生长、发育、分化、正常状态的维持、凋亡、损伤后的保护和轴 突的有效再生都有着重要作用。研究表明，NGF在神经系统以外表现出非 常活跃的生物学功能，主要表现在影响免疫细胞的活性，进而调节免疫系 统功能，在免疫系统炎症疾病中扮演了非常重要的角色。但是NGF在免 疫系统微环境中的作用到目前研究得还不是很透彻，还有很多问题有待解 决。

NGF是一个功能多样的生物活性分子，它与不同的受体识别传递不同 的信号，引导细胞回馈不同的反应，它与不同细胞上的同种受体识别后也 会产生不同的效应。NGF通过两种受体不仅调控细胞内相关蛋白激酶和效 应蛋白的活性和分布，诱导细胞做出各种抉择，还可以诱导细胞膜上和细 胞内脂类分子的合成和降解，调控它们的分布，激活脂分子下游的效应蛋 白，发挥复杂的功能。胞内的这些蛋白和脂分子在NGF的调控下协同作 用或相互制约。

在这些研究中经常可以注意到一些脂类分子的存在，这些脂类分子或 是与其受体偶联的信号通路相关，或是与调节NGF的受体表达水平相关， 或是被NGF调节等等。长久以来，科学家们都是在NGF周边间接地研究 这些脂分子与NGF相关的生物功能，也很少有学者直接的将NGF与脂分 子联系起来。例如，从蛇毒和大鼠颌下腺中提取的NGF与lysoPS可以共 同诱导肥大细胞的脱颗粒反应，释放出多种炎症介质：如5-羟色胺(5-HT)、 组胺(hiatamine)和白介素等，而二者单独作用并不能诱发此效应，但是 其机理至今仍然不清楚。

脂类是一类低溶于水却易溶于非极性溶剂的生物有机分子。脂类是富 含能量的营养素，是生物体中能量的一种储存形式，脂类也是组成生物膜 的重要组分，为保持膜的完整性和流动性提供支持。脂类还作为一些物质 的前体形式存在。近年来研究表明脂类也参与了细胞信号传导，有一些非 常重要的脂类被定义为第二信使，发挥传递信号的中介功能，调控生命活 动。

来自鼠的NGF近几年已经作为国家一类新药上市，是有效的治疗神 经系统疾病的新型生物制剂，适用于神经内科、神经外科和创伤等病症。 但是由于NGF生物功能的多样性，其作为药物应用的同时可能会带来潜 在的副作用，其分子生物学机制还在不断深入研究中。

表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)技术是目前国际上 广泛用于研究两种分子相互作用的手段。这种方法检测生物分子的相互作 用时，无需对生物分子进行标记，只需将一种生物分子固定在传感器芯片 表面，将与之相互作用的分子的溶液流过芯片表面，就可以检测两种分子 的结合、解离全过程。这种方法适用于多种生物体系，包括小分子化合物、 多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、病毒、细胞等等。

实验中使用的传感器芯片是GE公司生产的CM5芯片，传感片CM5 表面覆盖了一层葡聚糖。带有化学基团如-NH2，-SH，-CHO，-OH， -COOH的生物分子可通过化学反应，以共价键耦联的方式与葡聚糖上的 羧基耦联，从而使生物分子不可逆的耦联到传感片表面。我们的目的蛋白 鼠源NGF是天然提取的，没有任何标签，所以我们选了CM5传感片。

发明内容：

本发明利用结构生物学方法解析了蛇毒神经生长因子cNGF的晶体结 构，第一次在NGF双体的疏水通道中发现了脂类分子的存在。由一级序 列比对及三级结构的保守性分析，我们推测其它来源的神经生长因子也具 有结合脂类分子的能力。根据cNGF中发现的脂类小分子的结构特点，我 们选取了多种具有类似结构特征的脂类小分子，利用SPR技术研究了它们 与鼠源神经生长因子mNGF之间的相互作用，得到了mNGF结合脂类分 子的结构特点。能够与mNGF形成较高亲和力复合物的脂类小分子其结构 特征为：具有一个极性头部，如磷酸基团或糖基修饰，结构式中有一条或 两条由40个左右碳原子组成的疏水碳链，具有一定的可溶性。随后利用 结构生物学方法解析了鼠源神经生长因子mNGF与脂类小分子lysoPS复 合物的晶体结构。

通过mNGF与lysoPS复合物晶体结构分析，我们找到了mNGF结合 lysoPS分子头部磷酸基团的关键氨基酸，即，第88位赖氨酸，利用定点 突变技术突变该位点并制备突变体蛋白，随后开展细胞实验。研究结果表 明mNGF与特定的脂类小分子形成的高亲和力复合物具有不同于mNGF 本身的重要的细胞生物学功能，具体表现在mNGF与lysoPS共同刺激小 鼠肥大细胞瘤细胞可以诱导其释放组胺。mNGF双体中的某些关键氨基酸 对于脂类分子的结合进而对复合物功能的发挥具有非常重要的作用。我们 有理由推测mNGF与脂类分子的结合可能是mNGF作为药物应用时产生 副作用的潜在因素。通过SPR实验证明突变体蛋白结合脂类分子的能力明 显下降，而其刺激小鼠肥大细胞瘤细胞时组胺释放水平也明显下降。因此 mNGF突变体蛋白可以作为一种具有低免疫副作用的NGF药物替代品。

在本发明中提供下列：

1.鼠源神经生长因子mNGF与脂类小分子lysoPS复合物的晶体结构， 其中每两个mNGF组成一个双体分子，每个双体分子中夹有一个lysoPS 分子。

2.鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，将其称为K88L mNGF，即将mNGF的第88位氨基酸由带电荷的 赖氨酸突变为不带电荷的侧链长度相近的中性氨基酸亮氨酸。

3.第2项的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白用于制备低免疫副 作用的神经生长因子替代药物的应用。

4.一种低免疫副作用的神经生长因子替代药物，其包含治疗有效量的 第2项所述的鼠源神经生长因子mNGF突变体蛋白。

附图简述：

图1是mNGF及其突变体K88L mNGF与lysoPS复合物的小鼠肥大细 胞瘤细胞组胺释放实验。相比mNGF，突变体K88L mNGF所引起的组胺 释放效应明显降低。

图2是mNGF与lysoPS复合物的晶体结构。在双体结合面的疏水通道 中夹着一个lysoPS分子。

图3是鼠源神经生长因子mNGF的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图4是鼠源神经生长因子第88位突变体蛋白K88LmNGF的氨基酸 序列(SEQ ID NO：2)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限制本发明。

本领域技术人员应该理解，实施例中所用的试剂除特别说明外均为市 售分析纯级别的试剂。

实施例1

1、SPR实验分析鼠源神经生长因子(mNGF)与多种脂类小分子的亲和力

本实施例所用的脂类小分子购买白avanti polar lipids，Inc。

使用GE公司的Biocore 3000仪器进行SPR实验分析。当光线从高折 射率的介质进入低折射率的介质时，一部分光线会在接触面上被反射。当 入射角大于临界角的时候，光线会发生全反射。但是，当玻璃的表面覆盖 一层薄的惰性金属膜(如金)时，金属膜表面的等离子体(plasma)发生 振动，一部分光会“损失”在金属膜上。当入射光的波矢量与表面等离子 体振子的频率一致的时候，电子发生“共振”，这种现象被称为表面等离 子共振(surface plasmon resonance)。当反射光的强度达到最小值时的入射 角，被称为表面等离子共振角(θspr，surface plasmon resonance angle)。 SPR随金属膜表面介质的折射率变化而变化，而折射率的变化则与结合在 金属表面的分子质量成正比。因此，我们可以通过观察表面等离子共振角， 来分析生物分子之间的相互作用。结果描绘为RU(resonance unit)对时 间的图。

实验流程：

首先选取合适的PH值将目的蛋白固定到CM5芯片表面，一般是 PH4.5到5.5之间的醋酸钠溶液，NGF在酸性溶液中表现稳定，选取PH5.5 的醋酸钠溶液按标准化流程固定目标蛋白(即，mNGF)，用流动相溶液 50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5将小分子分别稀释到终浓度为 10ug/ml-300ug/ml之间，通过芯片。以30ul/min的流速注射，持续注射 时间为1min，并记录相应曲线。使用BIAcore3000白行携带软件 BIAevaluation 4.1版进行数据分析。

在BIAcore实验中，我们测试了13种小分子(如表1所示)与mNGF 的结合能力。在这部分实验中，我们只是定性的分析了小分子能否与 mNGF结合，并没有测试他们之间的亲和力。

结果显示有3种小分子与mNGF有相互作用，分别是PA、PIP2、lysoPS， 它们的分子式和结构式见表1。

表1选取的脂类分子名称和结构信息表

2、mNGF突变体蛋白的表达和纯化

鼠源proNGF基因购买白ATCC公司(http://www.atcc.org)，基因库 号为：BC011123。使用Stratagene公司的试剂盒QuikChange Site-directed Mutagenesis kit进行单点突变(将第88位的赖氨酸突变为亮氨酸)。突变 体基因被克隆在载体pET-28a(购于Qiagen公司)上，使用大肠杆菌表达 菌株BL21(购于Merck公司)表达。

挑取单克隆，在含50μg/ml kana的5ml LB中37℃振摇过夜后，取2ml 接种到含50μg/ml kana的200ml LB中摇至OD600约为0.6，再转接至6 瓶含50μg/ml kana的1.5L LB中摇至OD600约为0.8，加入终浓度为0.5mM 的IPTG，37℃诱导6h，离心收集菌体。

将收集的菌体超声破碎，4℃16000rpm离心30min，取包涵体沉淀用 溶液2M盐酸胍，100mM Tris-HCl pH 8.0，0.5mM NaCl，2％Triton X-100 洗5次。然后用含7M盐酸胍的溶液溶解包涵体，并在溶液0.7M Arg， 100mM Tris-HCl pH 9.5，0.5mM NaCl，5mM GSH，0.5mM GSSG中稀释复 性。。将此溶液于4℃放置一周以上，等待二硫键正确配对。 蛋白复性后透析：

透析溶液：

第一步溶液：50mM Tris-HCl pH 9.5，0.5mM NaCl，

5mM EDTA，10％甘油

第二步溶液：PBS pH 7.4，0.3mM NaCl，

5mM EDTA，10％甘油

第三步溶液：50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，0.5mM NaCl，

5mM EDTA，5％甘油

将含蛋白的复性溶液装在透析袋中，在第一步溶液中透析6小时以 上后，换第二步溶液透析6小时以上后，再换第三步溶液透析6小时以 上，根据具体情况可以再透析一次第三步溶液6小时。

收集透析后蛋白酶解：将结束透析后溶液高速离心，16000rpm× 30min，收集上清。此时折叠好的蛋白即在上清中。浓缩，换成无甘油的 50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0溶液。用胰蛋白酶对目的蛋白进行酶切处理， 除去pro部分，形成成熟的NGF蛋白。酶切后的蛋白，加入商业的混合蛋 白酶抑制剂cocktail(CALBIOCHEM，Protease Inhibitor Cocktail Set III)。 酶切后的蛋白换为50mM醋酸钠pH 5.3 140mM氯化钠溶液，用凝胶排 阻superdex 75(GE)分离纯化，去除杂蛋白，取得比较纯的目的蛋白。

3、mNGF及其突变体与lysoPS复合物的小鼠肥大细胞瘤细胞组胺释放实 验

细胞实验内容：mNGF，mNGF突变体工作浓度均为200ng/ml，将上 述NGF与表1所示的脂类小分子共同孵育约10分钟，刺激时细胞培养液 为5％FBS(胎牛血清)DMEM。实验中NGF、脂类分子均用添加了0.5mM CaCl2的50mMNa2Ac稀释。

细胞实验结果：相比mNGF单独作用，mNGF与lysoPS共同刺激时， 肥大细胞释放组胺的量明显增加，突变mNGF中与lysoPS相互作用的关 键氨基酸第88位赖氨酸后，二者共同孵育刺激肥大细胞其组胺释放量明 显降低。

上述实验结果说明第88位赖氨酸确实如复合物晶体结构中所显示的 一样，是mNGF结合lysoPS脂分子的关键氨基酸，将其突变为不带电荷 的亮氨酸后，mNGF结合lysoPS脂分子的能力下降，从而当二者共同刺激 肥大细胞瘤细胞时组胺释放效应显著降低。据此可以应用88位突变体 mMGF作为mNGF的替代药物，降低对细胞的毒副作用。

4、mNGF与lysoPS复合物的结晶及结构解析

我们尝试了商业晶体试剂盒，它们是hampton公司的PEG/ion， QIAGEN公司出品的NeXtal Tubes Classics Suite和NeXtal Tubes PEGs Suite。经过筛选后，NGF与lysoPS共晶在多个条件都出现了微晶。对pH 值范围、沉淀剂浓度、蛋白浓度、蛋白与小分子比例还有温度都细化筛 选，最终得到了衍射良好的晶体。

经过脱水处理后的晶体在上海同步辐射(Shanghai Synchrotron Radiation Facility，SSRF)进行数据收集，晶体衍射分辨率达到

晶体结构研究表明，每两个mNGF组成一个双体分子，每个双体分子 中夹有一个lysoPS分子。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地 显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权 利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式 和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。