从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法及其应用和青霉素的提取方法

技术领域

本发明涉及一种从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法，以及该方法在从 青霉素发酵液中提取青霉素中的应用；本发明还涉及一种青霉素的提取方 法。

背景技术

青霉素是一类具有6-氨基青霉素烷酸母核的物质的总称，根据取代基的 不同，青霉素主要包括青霉素F、青霉素G、青霉素X、青霉素K、青霉素 V、氨苄青霉素和羟氨苄青霉素。由于青霉素的母核6-氨基青霉素烷酸是一 种酸，因此，在酸性环境下，青霉素为易溶于疏水性有机溶剂的青霉素酸； 在碱性环境下，青霉素则成为易溶于水的盐。从青霉素发酵液中提取青霉素 的溶媒萃取法正是利用青霉素在酸碱环境下不同的溶解性，将青霉素从青霉 素发酵液中提取出来并进行提纯的。

目前，通常使用的从青霉素发酵液中提取青霉素的溶媒萃取法包括：向 青霉素发酵液中加入酸的溶液，并将该为酸性的青霉素发酵液与乙酸正丁酯 混合，从而将青霉素转移到乙酸正丁酯中，得到含有青霉素和乙酸正丁酯的 萃取液；将得到的含有青霉素和乙酸正丁酯的萃取液的pH值调节为碱性， 并与水混合，从而将青霉素转化为易溶于水的青霉素的盐并将该青霉素的盐 转移到水相中，得到含有所述青霉素的盐的青霉素水提液；向上述青霉素水 提液中加入正丁醇，并在减压条件下进行共沸蒸馏，脱除正丁醇和水，使得 青霉素的盐结晶析出，并经干燥而得到青霉素的盐的固体产物。另外，也可 以重复上述萃取步骤，从而进一步提高青霉素的盐的纯度。

然而，现有的青霉素溶媒萃取法的萃取收率还有待于进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种从青霉素水溶液 中提取青霉素的方法以及青霉素的提取方法，根据本发明的方法的萃取收率 高。

本发明的发明人在研究过程中意外地发现，如果采用乙酸仲丁酯代替乙 酸正丁酯作为溶剂来从青霉素水溶液中萃取青霉素，能够显著提高青霉素的 萃取收率。

本发明提供了一种从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法，该方法包括将 有机溶剂与青霉素水溶液混合，得到第一混合物，并使所述第一混合物的pH 值为小于6，将所述第一混合物分为油相和水相，分出所述油相，以得到含 有青霉素的萃取液，其中，所述有机溶剂为乙酸仲丁酯。

本发明还提供了一种根据本发明的方法在从青霉素发酵液中提取青霉 素中的应用。

本发明又提供了一种青霉素的提取方法，该方法包括：

(1)将有机溶剂与青霉素水溶液混合，得到第一混合物，并使所述第 一混合物的pH值为小于6，将所述第一混合物分为油相和水相，分出所述 油相，以得到含有青霉素的萃取液，其中，所述有机溶剂为乙酸仲丁酯；

(2)将水与所述含有青霉素的萃取液混合，得到第二混合物，并使所 述第二混合物的pH值为6以上，将所述第二混合物分为油相和水相，分出 所述水相，以得到含有青霉素的盐的萃取液；以及

(3)将所述含有青霉素的盐的萃取液与正丁醇混合，得到第三混合物， 并将所述第三混合物在共沸蒸馏条件下进行蒸馏浓缩，使得到的浓缩液中的 青霉素的盐结晶析出，以得到为固体的青霉素的盐。

根据本发明的方法使用乙酸仲丁酯作为从青霉素水溶液中提取青霉素 的有机溶剂，能够获得更高的萃取收率。并且，由于与乙酸正丁酯相比，乙 酸仲丁酯的生产成本更低，因此根据本发明的方法能够降低青霉素的生产成 本。另外，由于乙酸仲丁酯的毒性更低，因此根据本发明的方法还能够降低 对于操作人员健康的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法，该方法包括将 有机溶剂与青霉素水溶液混合，得到第一混合物，并使所述第一混合物的pH 值为小于6，将所述第一混合物分为油相和水相，分出所述油相，以得到含 有青霉素的萃取液，其中，所述有机溶剂为乙酸仲丁酯。

根据本发明，所述青霉素可以为各种以6-氨基青霉素烷酸为母核，且 6-氨基青霉素烷酸具有不同取代基的青霉素。例如，所述青霉素可以为青霉 素G或青霉素V。

根据本发明，所述青霉素水溶液可以为各种来源的青霉素水溶液，例如： 所述青霉素水溶液可以为将通过细菌发酵方法得到的青霉素发酵液进行过 滤以及任选的浓缩而得到的含有青霉素的水溶液。具体地，所述青霉素水溶 液可以为将采用丝状菌三级发酵工艺或球状菌二级发酵工艺得到的发酵液 进行过滤以及任选的浓缩而得到的含有青霉素的水溶液。根据本发明，将所 述青霉素发酵液进行过滤的方法可以为本领域的常规选择，只要能够除去所 述青霉素发酵液中残余的菌丝体和蛋白即可，例如：可以先向所述青霉素发 酵液中添加絮凝剂以使发酵液中的蛋白沉淀出来，然后用真空转鼓进行过滤 或者进行板框过滤。

本发明的方法对于所述青霉素水溶液中青霉素的含量没有特别限定，可 以为本领域的常规选择，例如：所述青霉素水溶液中青霉素的含量可以为 0.1-4.5重量％。

根据本发明的从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法采用乙酸仲丁酯作 为从青霉素水溶液中萃取青霉素的有机溶剂。本发明的发明人在研究过程中 惊讶地发现，与常规用作溶媒的乙酸正丁酯相比，青霉素在乙酸仲丁酯中的 溶解度更高。在相同的萃取条件下，乙酸仲丁酯对青霉素的萃取率更高。

因此，根据本发明的方法，在其余条件相同时，与使用乙酸正丁酯来萃 取青霉素相比，采用乙酸仲丁酯作为有机溶剂能够获得更高的青霉素萃取收 率；换句话说，与使用乙酸正丁酯来萃取青霉素相比，根据本发明的方法可 以使用更少量的乙酸仲丁酯来获得相同的青霉素萃取收率。

本发明中，所述萃取收率是指萃取体系达到平衡后被萃取物质进入萃取 液中的量(包括以各种分子形式存在的被萃取物质)与原始料液中被萃取物 质的总量的百分比，是通过以下公式计算得到的，

萃取收率(重量％)＝被萃取物质进入萃取液中的量/原始料液中被萃取 物质的总量×100％。

并且，与乙酸正丁酯相比，乙酸仲丁酯的毒性更低，因而根据本发明的 方法的安全性更高，对操作人员健康产生的危害更小。例如：山东省安全生 产监督管理局危险货品数据库中，乙酸正丁酯在操作环境中的最高浓度不应 当超过700毫克/立方米，而乙酸仲丁酯在操作环境中的最高浓度则可以达到 950毫克/立方米；另外，根据山东省安全生产监督管理局危险货品数据库中 的数据，乙酸仲丁酯的半数致死量(大鼠经口，96小时)为13400毫克/千 克，而乙酸正丁酯的半数致死量则为10768毫克/千克。

另外，与乙酸正丁酯相比，乙酸仲丁酯的生产成本更低，因而，使用乙 酸仲丁酯来萃取青霉素还能够降低青霉素的生产成本。

根据本发明，乙酸仲丁酯与青霉素水溶液的体积比可以为本领域的常规 用量，例如：1∶1.5-5。根据本发明，从平衡青霉素的萃取收率和降低有机 溶剂的用量的角度出发，乙酸仲丁酯与青霉素水溶液的体积比优选为1∶2-4。 根据本发明的从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法，将乙酸仲丁酯与青霉素 水溶液混合的方法和条件没有特别限定，可以为本领域的常规方法和常用条 件。

一般地，将乙酸仲丁酯与青霉素水溶液混合的时间可以为0.1-10分钟， 优选为1-5分钟；混合的温度可以为0-10℃，优选为2-6℃。

根据本发明的方法包括使所述第一混合物的pH值为小于6。在所述第 一混合物的pH值为小于6时，所述第一混合物中的青霉素以酸的形式存在， 因而能够从水相迁移到油相中，以得到含有青霉素的萃取液。根据本发明， 优选使所述第一混合物的pH值为1.8-3.0，更优选使所述第一混合物的pH 值为2.0-2.8。

根据本发明，可以采用本领域技术人员公知的方法使所述第一混合物的 pH值满足上述要求。例如，可以通过向所述青霉素水溶液中添加酸，从而 使所述第一混合物的pH值为小于6、优选为1.8-3.0、更优选为2.0-2.8；还 可以通过向所述第一混合物中添加酸，从而使所述第一混合物的pH值为小 于6、优选为1.8-3.0、更优选为2.0-2.8。根据本发明，所述酸可以为本领域 常用的各种酸，例如：所述酸可以为选自硫酸、盐酸、磷酸和草酸中的一种 或多种。

可以采用本领域常用的各种方法将pH值为小于6的所述第一混合物分 为油相与水相，并分离出油相，从而得到含有青霉素的萃取液(即，含有青 霉素的油相)。例如：可以通过离心分离方法或者静置分离方法将pH值为小 于6的第一混合物分为油相和水相，并将油相分离出来。

由本发明的方法得到的含有青霉素的萃取液可以根据具体的应用场合 进行处理，从而得到为固体的青霉素。例如，可以通过将所述青霉素萃取液 与沉淀剂(如醋酸钠-乙醇)接触，从而使青霉素结晶出来；也可以利用青 霉素在等电点时在水溶液中溶解度最小的特性，将所述含有青霉素的萃取液 的pH值调节至等电点，使青霉素沉淀析出；还可以通过将所述含有青霉素 的萃取液与水在碱性条件下混合，从而将青霉素以青霉素的盐的形式从乙酸 仲丁酯中转移到水中，并将含有所述青霉素的盐的水溶液进行减压共沸蒸 馏，从而得到为固体的青霉素的盐。

本发明的从青霉素水溶液中萃取青霉素的方法特别适用于将青霉素发 酵液经过滤以及任选的浓缩而得到的青霉素水溶液中萃取青霉素。由此，本 发明还提供了一种本发明的方法在从青霉素发酵液中提取青霉素中的应用。

本发明又提供了一种青霉素的提取方法，该方法包括：

(1)将有机溶剂与青霉素水溶液混合，得到第一混合物，并使所述第 一混合物的pH值为小于6，将所述第一混合物分为油相和水相，分出所述 油相，以得到含有青霉素的萃取液，其中，所述有机溶剂为乙酸仲丁酯；

(2)将水与所述含有青霉素的萃取液混合，得到第二混合物，并使所 述第二混合物的pH值为6以上，将所述第二混合物分为油相和水相，分出 所述水相，以得到含有青霉素的盐的萃取液；以及

(3)将所述含有青霉素的盐的萃取液与正丁醇混合，得到第三混合物， 并将所述第三混合物在共沸蒸馏条件下进行蒸馏浓缩，使得到的浓缩液中的 青霉素的盐结晶析出，以得到为固体的青霉素的盐。

使用乙酸仲丁酯作为有机溶剂来萃取青霉素水溶液中的青霉素，以得到 含有青霉素的萃取液的方法在前文已经进行了详细的描述，在此不再赘述。

根据本发明的青霉素的提取方法是通过使用本发明的从青霉素水溶液 中萃取青霉素的方法来实现本发明的目的的，对于得到含有青霉素的盐的萃 取液以及通过蒸馏浓缩使青霉素的盐从所述含有青霉素的盐的萃取液中结 晶出来的条件没有特别限定，可以为本领域的常规选择。

根据本发明的青霉素的提取方法，水与所述含有青霉素的萃取液的体积 比可以为1∶2-4。

根据本发明的青霉素的提取方法包括使所述第二混合物的pH值为6以 上。在pH值为6以上的条件下，青霉素以溶于水的盐的形式存在，因而能 够从油相中迁移到水相中，从而得到含有青霉素的盐的水相。根据本发明， 优选使所述第二混合物的pH值为6.8-7.4。

根据本发明的青霉素的提取方法，可以采用本领域常用的方法来使所述 第二混合物的pH值满足上述要求。例如，可以通过向所述含有青霉素的萃 取液中添加含有选自碳酸氢钠、碳酸氢铵、氢氧化钠、碳酸钠和氨水等碱性 物质的水溶液来使得所述第二混合物的pH值为6以上、优选为6.8-7.4；也 可以通过将上述碱性物质添加到用于与所述含有青霉素的萃取液混合以制 备所述第二混合物的水中，从而使得到的第二混合物的pH值为6以上、优 选为6.8-7.4。

根据本发明的青霉素的提取方法，可以采用本领域常用的各种方法将 pH值为6以上的所述第二混合物分为油相和水相，并分出所述水相，以得 到含有青霉素的盐的萃取液(即，含有青霉素的盐的水相)。例如：可以通 过离心分离方法或者静置分离方法将pH值为6以上的所述第二混合物分为 油相和水相，进而分出所述水相。

根据本发明的青霉素的提取方法，对于正丁醇与所述含有青霉素的盐的 萃取液的体积比没有特别限定。优选地，正丁醇与所述含有青霉素的盐的萃 取液的体积比可以为1.8-2.5∶1，优选为2.0-2.5∶1。

根据本发明的青霉素的提取方法对于将所述含有青霉素的盐的萃取液 与正丁醇的混合物进行共沸蒸馏浓缩的条件没有特别限定，只要所述共沸蒸 馏条件能够将水与正丁醇以共沸物的形式蒸出，从而使浓缩液中的青霉素的 盐结晶析出即可。例如：所述共沸蒸馏条件可以包括：温度为16-26℃，压 力为0.67-1.3kPa。

从进一步提高制备的青霉素的纯度的角度出发，根据本发明的青霉素的 提取方法还可以包括将得到的青霉素的盐溶解于水中，在pH值为小于6的 条件下用乙酸仲丁酯进行萃取得到含有青霉素的二次萃取液，并在pH值为 6以上的条件下用水对所述二次萃取液进行萃取，得到含有青霉素的盐的二 次萃取液，并将含有青霉素的盐的二次萃取液与正丁醇混合后在共沸蒸馏条 件下进行蒸馏，从而得到为固体的青霉素的盐。

即，根据本发明的青霉素的提取方法还可以包括将所述青霉素的盐进行 至少一次以下操作：(1)将青霉素的盐(如钠盐或钾盐)溶解于水中，得到 含有所述青霉素的盐的水溶液，将所述水溶液的pH值调节为小于6，将该 pH值为小于6的水溶液与乙酸仲丁酯混合，得到第四混合物，将所述第四 混合物分为油相和水相，并分离出油相，以得到含有青霉素的二次萃取液 (即，含有青霉素的油相)；(2)将所述含有青霉素的二次萃取液与水混合， 得到第五混合物，并使所述第五混合物的pH值调节为6以上，将所述第五 混合物分为油相和水相，并分离出水相，以得到含有青霉素的盐的二次萃取 液(即，含有青霉素的盐的水相)；以及(3)将所述含有青霉素的盐的二次 萃取液与正丁醇混合，并在共沸蒸馏条件下进行蒸馏浓缩，使得到的浓缩液 中的青霉素的盐结晶析出，以得到为固体的青霉素的盐。根据本发明，步骤 (1)中，所述青霉素的盐与水的重量比可以为1∶2-4，优选为1∶2-3。上 述各步操作中的条件可以与前文所述的条件相同，此处不再赘述。

以下结合实施例详细说明本发明。

实施例1

本实施例用来说明根据本发明的方法及其应用。

(1)向青霉素丝状菌发酵液中加入十五烷基溴化吡啶和草酸(其中， 十五烷基溴化吡啶的用量为6g，草酸的加入量使得发酵液的pH值为5)进 行预处理，并进行板框过滤，得到400mL青霉素水溶液(以所述青霉素水 溶液的总量为基准，青霉素的含量为3.5重量％)。所述青霉素丝状菌发酵液 是通过以下方法制备的：

将产黄青霉素菌接种到固体培养基上，在25℃的温度下培养7-10天， 得到青霉素孢子培养物。用无菌水将孢子培养物制成悬浮液接种到种子罐内 已灭菌的培养基中，通入无菌空气、搅拌，在27℃的温度下培养28h，然后 将种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌 空气，搅拌，在27℃的温度下培养7天，得到青霉素发酵液。在发酵过程中 补入苯乙酸前体及适量的培养基。

(2)向步骤(1)得到的400mL青霉素水溶液中加入浓度为10重量％ 的稀硫酸，将青霉素水溶液的pH值调节为2.0，然后与126mL乙酸仲丁酯 在5℃的温度下，混合1分钟，并采用高速离心方法将上述混合物分为油相 和水相，并分离出油相，从而得到含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液，萃取收率 为83.18％，萃余相中乙酸仲丁酯的含量为0.5重量％。

(3)将步骤(2)得到的含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液与碳酸氢钠水溶 液(pH为7.8)以4∶1的体积比在5℃的温度下混合5分钟，得到的混合物 的pH值为6.8，并采用高速离心分离方法将上述混合物分为油相和水相，分 离出水相，从而得到含有青霉素的盐的水溶液。

(4)将步骤(3)得到的含有青霉素的盐的水溶液与正丁醇以1∶2.5 的体积比在10℃下混合2分钟，将得到的混合物进行共沸蒸馏，其中，共沸 蒸馏的条件包括：温度为16℃，压力为0.67kPa。蒸馏过程中，水与正丁醇 形成共沸物而被蒸出，青霉素的盐则结晶析出。将得到的晶体进行洗涤和干 燥，得到10.9g为固体的青霉素盐。

对比例1

采用与实施例1相同的方法从青霉素水溶液中提取青霉素，不同的是， 步骤(2)中，使用乙酸正丁酯代替乙酸仲丁酯，得到含有青霉素的乙酸正 丁酯溶液，萃取收率为79.06％，萃余相中乙酸正丁酯的含量为0.9重量％； 最终得到10.2g为固体的青霉素盐。

对比例2

采用与实施例1相同的方法从青霉素发酵液中提取青霉素，不同的是， 步骤(2)中，使用150mL乙酸正丁酯代替126mL乙酸仲丁酯，含有青霉素 的乙酸正丁酯溶液，萃取收率为79.56％，萃余相中乙酸正丁酯的含量为0.9 重量％；最终得到10.3g为固体的青霉素盐。

对比例3

采用与实施例1相同的方法从青霉素发酵液中提取青霉素，不同的是， 步骤(2)中，使用乙酸叔丁酯代替乙酸仲丁酯，得到含有青霉素的乙酸叔 丁酯溶液，萃取收率为79.02％，萃余相中乙酸叔丁酯的含量为0.7重量％； 最终得到10.2g为固体的青霉素盐。

实施例2

本实施例用来说明根据本发明的方法及其应用。

(1)向青霉素丝状菌发酵液中加入十五烷基溴化吡啶和草酸(其中， 十五烷基溴化吡啶的用量为6g，草酸的加入量使得发酵液的pH值为5.2) 进行预处理，并进行板框过滤，得到350mL青霉素水溶液(以所述青霉素 水溶液的总量为基准，青霉素的含量为3.8重量％)。所述青霉素丝状菌发酵 液是通过以下方法制备的：

将产黄青霉素菌接种到固体培养基上，在25℃的温度下培养7-10天， 即可得到青霉素孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已 灭菌的培养基中，通入无菌空气、搅拌，在27℃的温度下培养24h，然后将 种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空 气，搅拌，在27℃的温度下培养7天，得到青霉素发酵液。在发酵过程中补 入苯乙酸前体及适量的培养基。

(2)向步骤(1)得到的350mL青霉素水溶液中加入浓度为10重量％ 的稀硫酸，将青霉素水溶液的pH值调节为2.2，然后与233mL乙酸仲丁酯 在6℃的温度下，混合2分钟，并采用高速离心方法将上述混合物分为油相 和水相，分离出油相，从而得到含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液，萃取收率为 85.10％，萃余相中乙酸仲丁酯的含量为0.52重量％。

(3)将步骤(2)得到的含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液与碳酸氢钠水溶 液(pH为8.2)以3∶1的体积比在10℃的温度下混合5分钟，得到的混合 物的pH值为7.0，并采用高速离心方法将得到的混合物分为油相和水相，分 离出水相，从而得到含有青霉素的盐的水溶液。

(4)将步骤(3)得到的含有青霉素的盐的水溶液与正丁醇以1∶2.2 的体积比在5℃下混合3分钟，将得到的混合物进行共沸蒸馏，其中，共沸 蒸馏的条件包括：温度为20℃，压力为0.8kPa。蒸馏过程中，水与正丁醇形 成共沸物而被蒸出，青霉素的盐则结晶析出。将得到的晶体进行洗涤和干燥 后，得到10.4g为固体的青霉素的盐。

实施例3

本实施例用来说明根据本发明的方法及其应用。

采用与实施例2相同的方法从青霉素发酵液中提取青霉素，不同的是， 步骤(2)中，使用175mL乙酸仲丁酯，得到含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液， 萃取收率为84.36％，萃余相中乙酸仲丁酯的含量为0.5重量％；最终得到 10.3g为固体的青霉素的盐。

实施例4

本实施例用来说明根据本发明的方法及其应用。

(1)向青霉素丝状菌发酵液中加入十五烷基溴化吡啶和草酸(其中， 十五烷基溴化吡啶的用量为6g，草酸的加入量使得发酵液的pH值为5.1) 进行预处理，并进行板框过滤，得到750mL青霉素水溶液(以所述青霉素 水溶液的总量为基准，青霉素的含量为4.0重量％)。所述青霉素丝状菌发酵 液是通过以下方法制备的：

将产黄青霉素菌接种到固体培养基上，在25℃的温度下培养7-10天， 即可得到青霉素孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐内已 灭菌的培养基中，通入无菌空气、搅拌，在27℃的温度下培养26h，然后将 种子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中，通入无菌空 气，搅拌，在27℃的温度下培养7天，得到青霉素发酵液。在发酵过程中补 入苯乙酸前体及适量的培养基。

(2)向步骤(1)得到的750mL青霉素水溶液中加入浓度为10重量％ 的稀硫酸，将青霉素水溶液的pH值调节为2.8，然后与150mL乙酸仲丁酯 混合物在2℃的温度下，混合3分钟，并采用高速离心方法将上述混合物分 为油相和水相，分离出油相，从而得到含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液，萃取 收率为80.12％，萃余相中乙酸仲丁酯的含量为0.45重量％。

(3)将步骤(2)得到的含有青霉素的乙酸仲丁酯溶液与碳酸氢钠水溶 液(pH为8.6)以2∶1的体积比在5℃的温度下混合2分钟，得到的混合物 的pH值为7.4，并采用高速离心方法将得到的混合物分为油相和水相，分离 出水相，从而得到含有青霉素的盐的水溶液。

(4)将得到的含有青霉素的盐的水溶液与正丁醇以1∶2.5的体积比在 4℃的温度下混合5分钟，将得到的混合物进行共沸蒸馏，其中，共沸蒸馏 的条件包括：温度为25℃，压力为1.2kPa。蒸馏过程中，水与正丁醇形成共 沸物而被蒸出，青霉素的盐则结晶析出。得到的晶体进行洗涤后干燥后，得 到22.2g为固体的青霉素的盐。

实施例5

本实施例用来说明根据本发明的方法及其应用。

采用与实施例4相同的方法从青霉素发酵液中提取青霉素，不同的是， 步骤(2)中，使用187.5mL乙酸仲丁酯，得到含有青霉素的乙酸仲丁酯溶 液，萃取收率为80.69％，萃余相中乙酸仲丁酯的含量为0.45重量％；最终 得到22.3g为固体的青霉素的盐。