一种降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备方法、所得微生态制剂及其用途

技术领域

本发明涉及一种降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备方法，本发明还涉及使用该方法制得的降解亚硝酸盐的微生态制剂，本发明还进一步涉及了该降解亚硝酸盐的微生态制剂在养殖水体水质改良中的用途。

背景技术

随着国内外水产养殖业迅猛发展，养殖规模的日益扩大，集约化程度的不断提高，超限量放养和集中投饵导致养殖水体产生大量残饵、粪便和死亡的动植物尸体，这些有机物沉积于池底，在异养菌的作用下腐败发酵，其中的蛋白质和核酸慢慢被分解，产生大量含氮有害物质，使养殖水体水质迅速恶化，造成严重的自身污染，严重时使得整个养殖生态环境都遭到破坏。污染发生时，水体中铵氮、亚硝酸盐等有毒有害物质大量产生，尤其是高浓度的亚硝酸盐使养殖对象血液输送氧气能力下降，促使血液中的血红蛋白转化为高铁血红蛋白，失去和氧结合的能力，不仅直接危害养殖动物，同时由于它的长期蓄积中毒作用，导致鱼、虾等抗病力降低，易招致各种病原菌的侵袭，故被视为是鱼、虾的致病根源，由此带来的病害使养殖户蒙受了严重损失，水环境中亚硝酸盐污染问题已成为困扰水产养殖业发展的瓶颈之一，极大的限制了水产养殖业的发展。

目前市场上降解亚硝酸盐的方法主要有物理、化学和生物方法，采用换水、吸附、投施氧化还原剂等物理化学方法来降解亚硝酸盐，存在用量大、环保性差、降解率不高、维持时间短、易反弹等缺点，是治标不治本的举措。而采用投加微生态制剂的生物方法降解亚硝酸盐具有操作简单、无毒副作用、无残留、效果显著、成本低、不破坏生态平衡等多方面优点，已成为养殖水体净化技术的最新发展趋势。芽孢杆菌、光合细菌、乳酸菌等微生态制剂在降解亚硝酸盐方面的突出效果不断有研究报道，其中枯草芽孢杆菌以其繁殖能力强、耐储存的优势，受到广泛关注。

现有微生态制剂产品发酵生产工艺主要有液态发酵工艺和固态发酵工艺，液态发酵产品普遍存在有效活菌数和芽孢率低的问题，导致在后续生产处理过程中菌体损失严重；固态发酵产品生产过程中工艺参数难监测和控制，杂菌率高。此外，微生态制剂投入养殖水体后菌体呈游离状态，对水中不良环境的耐受力低，难以抵御池塘中土著菌的竞争拮抗及水生生物的捕食，而固定化技术可以对微生态制剂中的功能菌起到有效保护，但现有固定化包埋技术操作繁琐，难以应用于大规模生产。固定化吸附技术操作简单，载体成本低廉，目前的主要处理方式是在发酵结束后将发酵液浓缩再投入固定化载体吸附，菌体与载体间结合力弱，入水后菌体很容易析脱出来，达不到有效固定化的目的。

尽管微生态制剂在降解水产养殖水体中亚硝酸盐的应用具有许多优点，但由于存在上述多方面缺陷，发展至今，在实际应用中仍存在效果不稳定或施用后毫无效果的问题，市面上基本还没有能够真正有效降解亚硝酸盐的特效药，导致亚硝酸盐污染成为令养殖业头疼的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本较低、操作简单、产品活菌数和芽孢率高的降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备方法。本发明的另一个目的是公开了使用本发明方法所制得的降解亚硝酸盐的微生态制剂和该微生态制剂在养殖水体水质改良中的用途。

为达到所述目的，本发明的技术方案如下：

一种降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

(a)制备枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的种子液。

(b)将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的种子液接种至发酵罐的液体发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养中采用二步控温法，发酵前期和后期使用不同的温度进行发酵，在发酵前期发酵温度较高，在发酵后期发酵温度较低；

在发酵前期，菌体处于停滞期和对数生长早期，较高的罐温有利于加速菌体的萌发，缩短停滞期时间，在发酵后期，菌体进入对数生长旺盛时期，自身代谢产热严重，容易出现局部温度过高，适当降低控制温度更有利与发酵生产菌数的提高和后期芽孢的形成。

(c)发酵完成后，浓缩发酵液，将菌体干燥，稀释，检测，包装，即得到降解亚硝酸盐的微生态制剂。

其中，上述步骤(b)中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）种子液的接种量为液体发酵培养基重量的5～10%；所述发酵培养条件为：起始pH值为7～7.5，转速为150～200r/min，罐压为0.04～0.06MPa,发酵时间为24～28h，在1～16h控温35～38℃，16h至发酵结束控温28～32℃；所述液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，玉米粉2～3%、糖蜜1～2%、豆饼粉1～2%、硫酸铵0.2～0.5%、磷酸氢二钾0.1～0.2%、七水硫酸镁0.03%、一水硫酸锰0.01%、沸石粉5～10%，余量为水。

其中，上述步骤(b)中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌液的接种量优选为液体发酵培养基重量的5%；所述发酵培养条件优选为：起始pH值为7～7.5，转速为200r/min，罐压为0.04～0.06MPa,发酵时间为24h，在1～16h控温37℃，16h至发酵结束控温32℃；所述液态发酵培养基各组分含量优选为：按重量百分比记，玉米粉2%、糖蜜1%、豆饼粉2%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%、七水硫酸镁0.03%、一水硫酸锰0.01%、沸石粉10%，余量为水。

其中，所述步骤(c)中浓缩发酵液的方法为离心后收集菌体；菌体干燥的方法为常规喷雾干燥法。

用上述方法获得的降解亚硝酸盐的微生态制剂和所述降解亚硝酸盐的微生态制剂在养殖水体水质改良中的用途也属于本发明的保护范围。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）在液态发酵法采用二步控温法，发酵液活菌数可达到103亿/ml，芽孢率99％以上，有效提高了活菌数和芽孢率，保证了产品质量的稳定性；

（2）向液态发酵培养基配方中添加沸石粉，可以使菌体在发酵培养中进入沸石粉的微孔结构中，在菌体增殖的同时实现与载体的紧密结合，形成牢固的生物膜系，比发酵结束后再添加沸石粉的常规固定化方法实现更牢固的结合作用，实现有效固定化，同时，这一操作还延长了微生态制剂的保质期；

（3）所得微生态制剂降解水体亚硝酸盐的效果很好，且生产、使用操作简单，成本低廉，易于推广应用。

本发明的详细内容可通过后述的说明及所附图而得到。

附图说明

图1为本发明降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备方法的工艺路线图。

图2为不同温度控制方式下发酵液中活菌数增长状况比较。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验材料

本发明所用到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）购于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，产品编号为：ACCC02973。

预备实施例1液态发酵培养基的制备

配制液态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，玉米粉2%、糖蜜1%、豆饼粉2%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%、七水硫酸镁0.03%、一水硫酸锰0.01%、沸石粉10%，余量为水；按重量百分比称取各组分加入水中，搅拌至均匀。

预备实施例2不含沸石粉的液态发酵培养基的制备

配制不含沸石粉的液态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，玉米粉2%、糖蜜1%、豆饼粉2%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%、七水硫酸镁0.03%、一水硫酸锰0.01%，余量为水；按重量百分比称取各组分加入水中，搅拌至溶解均匀。

实施例1降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备

1.将购买来的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株经PDA斜面培养基活化，挑菌至装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h；再将三角瓶中培养好的菌液接种至装有LB液体培养基的种子罐进行扩大发酵培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的种子液。

2.将步骤1所得的种子液接种至发酵罐的液态发酵培养基中进行发酵培养，种子液的接种量为液体发酵培养基重量的5%，发酵培养条件为：起始pH值为7～7.5，转速为200r/min，罐压为0.04～0.06MPa,发酵时间为24h，在1～16h控温37℃，16h至发酵结束控温32℃。

3.发酵完成后，将发酵液液离心后收集菌体，得到的菌体使用常规喷雾干燥法进行干燥，稀释至活菌数为210亿/g，检测，包装，即得到降解亚硝酸盐的微生态制剂。

对照例1后固定化降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备

1.将购买来的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株经PDA斜面培养基活化，挑菌至装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h；再将三角瓶中培养好的菌液接种至装有LB液体培养基的种子罐进行扩大发酵培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的种子液。

2.将步骤1所得的种子液接种至发酵罐中进行发酵培养，发酵培养使用不含沸石粉的液态发酵培养基，种子液的接种量为液体发酵培养基重量的5%，发酵培养条件为：起始pH值为7～7.5，转速为200r/min，罐压为0.04～0.06MPa,发酵时间为24h，在1～16h控温37℃，16h至发酵结束控温32℃。

3.发酵完成后，向发酵液中添加10%的沸石粉吸附，将发酵液离心后收集菌体，得到的菌体使用常规喷雾干燥法进行干燥，稀释至活菌数为210亿/g，检测，包装，即得到后固定化降解亚硝酸盐的微生态制剂。

对照例2不固定化降解亚硝酸盐的微生态制剂的制备

1.将购买来的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株经PDA斜面培养基活化，挑菌至装有LB液体培养基的三角瓶中培养，培养温度为37℃，培养时间为24h；再将三角瓶中培养好的菌液接种至装有LB液体培养基的种子罐进行扩大发酵培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的种子液。

2.将步骤1所得的种子液接种至发酵罐中进行发酵培养，发酵培养使用不含沸石粉的液态发酵培养基，种子液的接种量为液体发酵培养基重量的5%，发酵培养条件为：起始pH值为7～7.5，转速为200r/min，罐压为0.04～0.06MPa,发酵时间为24h，在1～16h控温37℃，16h至发酵结束控温32℃。

3.发酵完成后，将发酵液离心后收集菌体，得到的菌体使用常规喷雾干燥法进行干燥，稀释至活菌数为210亿/g，检测，包装，即得到不固定化降解亚硝酸盐的微生态制剂。

试验例1二步控温法与一步控温法发酵效果对比

1.试验方法

按照实施例1所述步骤1制备枯草芽孢杆菌的种子液，在步骤2中，设置三组试验进行发酵效果对比，其中：

处理A：发酵全程控温32℃；

处理B：发酵全程控温37℃；

处理C：采用二步控温法，对温度进行分段控制，前16h控温37℃，16h后，控温32℃。

发酵过程中每4h抽取每组的发酵液检测其活菌数，结果见图2；发酵结束时检测每组发酵液的活菌数和芽孢率，结果见表1。

2.试验结果

2.1发酵过程中活菌数增长状况比较

从图2可知，处理A全程控温在32℃的较低温度，前期菌数上升缓慢，后期进入对数增长期菌数增长较快但高度有限；处理B全程控温在37℃的较高温度，前期菌数上升快，但发酵后期菌数增长速率不及处理A和处理C；处理C采用二步控温法分段控制温度相较于处理A和处理B有明显优势，前期菌数上升快，同时后期可实现高速率的对数增长。

2.2不同温度控制方式下发酵液中活菌数和芽孢率比较

表1不同温度控制方式下发酵液中活菌数和芽孢率的比较

表1数据显示，采用二步控温方式发酵液中菌数和芽孢率分别达到103亿/mL和99.5％，均明显优于全程固定温度32℃和37℃的控温方式所得的发酵液。试验例2不同处理微生态制剂的实际净水效果比较

试验于2011年6月10日～2011年6月16日在武汉市江夏区多福科技农庄养殖场进行。试验挑选3个亚硝酸盐超标的混养池塘A、B和C，这3个池塘NO^-₂-N浓度都超过了0.15mg/L。对其中池塘A作投施本发明实施例1的微生态制剂处理；池塘B作投施本发明对照例1的微生态制剂处理；池塘C作投施本发明对照例2的微生态制剂处理；每个池塘投菌量均为200g/亩·米。

6月10日投菌后连续监测3个鱼池中的亚硝酸盐含量，结果见表2

表2亚硝酸盐超标池塘治理前后亚硝酸盐含量变化（mg/L）

由表2可以看出，投施了三种微生态制剂的池塘亚硝酸盐浓度都有不同程度的下降，其中，投施实施例1的效果较对照例1和对照例2更为显著，其最终降解率达到94.2％，明显高于后固定化的75.5％和不固定化的58.2％，说明向液态发酵培养基配方中添加沸石粉进行前固定化，比不进行固定化效果好，比发酵结束后再添加沸石粉的常规固定化方法实现更牢固的结合作用，实现有效固定化。

试验例3不同处理微生态制剂的保质期比较

将实施例1、对照例1和对照例2所得的三种微生态制剂于密封条件下恒温25℃保存，定期检测活菌数，结果见表3。

表3三种微生态制剂保存期内活菌数比较

表3数据显示，两年内，实施例1的微生态制剂活菌数保存率达91.6％，对照例1的微生态制剂活菌数保存率为43.8％，对照例2的微生态制剂活菌数保存率为27.3％。结果表明，本发明向液态发酵培养基配方中添加沸石粉进行前固定化的方式，对枯草芽孢杆菌的存活具有保护作用，可有效延长菌剂的保存期。

试验例4本发明产品在实际养殖池塘中净水效果检测

本试验于2011年7月14日～2011年7月20日在武汉市江夏区多福科技农庄养殖场进行。试验挑选3个亚硝酸盐超标严重的草鱼养殖池塘A、B和C，这3个池塘NO^-₂-N浓度都超过了0.2mg/L，池水老化发黑，氨氮超标，有大片蓝藻漂浮。对其中池塘A作投施本发明实施例1的微生态制剂处理，投菌量为200g/亩·米；池塘B作投施市场同类产品菌剂处理，投菌量为200g/亩·米；池塘C作不投菌对照。

7月14日投菌后连续监测3个鱼池中的亚硝酸盐含量，结果见表4：

表4亚硝酸盐超标池塘治理前后亚硝酸盐含量变化（mg/L）

由表4可以看出，投放了本发明降解养殖水体亚硝酸盐的微生态制剂后池塘A的亚硝酸盐浓度呈明显下降趋势，投菌3天后亚硝酸盐由0.281mg/L下降到0.023mg/L，去除率91.8％，并在试验后期池塘亚硝酸盐浓度未有反弹。同期，另外两个池塘亚硝酸盐浓度没有明显下降，反而有上升趋势。

同时，在试验期间，观测到池塘A水质明显改善，水色由黑转为绿爽，经检测氨氮由0.52mg/L降为0.31mg/L。