提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ

技术领域：

本发明涉及水生生物的样品采集领域，具体涉及一种提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素 样品的δ¹⁵N测试精度和制备效率的方法。

背景技术：

珊瑚礁生态系统具有各种海洋生物供栖息地和维持海洋生物多样性、保护海岸线和生态 观光旅游等重要的功能，也是非常敏感和脆弱的生态系统。珊瑚礁生态系统往往是贫营养盐 的。氮营养盐随着污水进入近岸珊瑚礁区，往往会导致珊瑚礁区大型海藻和有机颗粒物的显 著增多，这不仅会加剧大型海藻和造礁石珊瑚的空间竞争，还会引起珊瑚礁区缺氧和颗粒物 在珊瑚表面的沉积，对造礁石珊瑚产生负面的影响。氮营养盐增多已成为引起近岸珊瑚礁生 态系统退化的重要原因。

由于传统的氮（有机氮和无机氮）营养盐监测方法，具有瞬时性、测试次数易受海况和 人力物力限制及准确测试难度大等方面的诸多问题，很难获得准确的，能够反映珊瑚礁区氮 营养盐状况的较为连续的数据。然而，在指示近岸水体中氮污染方面，大型海藻氮稳定同位 素比值（δ¹⁵N(‰)=[(R_海藻/R_标准物质)-1]×10³，R是¹⁵N/¹⁴N，标准物质为大气中的氮气）呈现 出非常好的潜能。在近岸珊瑚礁区，氮营养盐主要是伴随污水（如生活污水和养殖污水）排 放到珊瑚礁区的。由于污水等δ¹⁵N介于6～10‰，大型海藻快速吸收污水中的氮营养盐之后， 其δ¹⁵N会升高1～6‰。因此，大型海藻δ¹⁵N不仅可以甄别珊瑚礁区氮的来源，配合大型海 藻的TON，还可以指示氮污染的水平（Risk MJ,Lapointe BE,Sherwood OA,Bedford BJ(2009) The use of delta N-15 in assessing sewage stress on coral reefs.Mar Pollut Bull 58:793-802）。相比 传统的营养盐监测方法，大型海藻氮稳定同位素技术具有简单、便宜、准确和高效的特点， 它还可以提供达到数周氮污染状况的累计信息。但是，在国内尚无人在珊瑚礁区开展此方面 的研究。

近岸珊瑚礁区大型海藻上往往会附着沉积物、植物以及各种碳酸钙成分，海藻样品处理 不干净就会降低大型海藻的δ¹⁵N和TON。稀盐酸常用来去除大型海藻内部的和表面附着物 的碳酸钙成分，但是不合理的稀盐酸浓度及浸泡时间，往往会引起大型海藻δ¹⁵N的分馏。由 于测试大型海藻δ¹⁵N和TON之前，需要将大型海藻磨碎，粒度不均也会引起大型海藻δ¹⁵N 和TON重复测试时的显著差异。但是多数国外发表的文献在描述样品处理方法时一笔带过， 非常缺乏详细的记录，如稀盐酸的浓度、酸化处理时间、样品的研磨时间、样品是否要筛分 及筛网的合适孔径等。目前，国际上也未见相关专利的报道。我国近岸珊瑚礁区水质较差， 大型海藻上更容易存在附生物，不处理干净会严重影响大型海藻δ¹⁵N指示近岸氮污染的效果。

发明内容：

本发明的目的是针对以上技术难点，提供了一种可有效快速去除附着大型海藻表面的附生 植物、沉积物及碳酸钙成分，通过解剖镜检查、洗净、烘干、碾磨、筛匀，从而获得大量纯 净的大型海藻粉末状同位素样品的提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ¹⁵N测试精度和 制备效率的方法，该方法不仅能够提高样品的测试精度，还能够提高样品的制备效率。

本发明的提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ¹⁵N测试精度和制备效率的方法，其 特征在于，包括以下步骤：

（a）在珊瑚礁海区，采集大型海藻样品，然后冷冻保存，待测试时解冻，用自来水冲洗 大型海藻样品表面，选取表面整洁的大型海藻叶片和/或分枝，浸泡于5～10%（v/v）的稀盐 酸中，浸泡时间为0.5～2小时，待没有气泡冒出为止，取出大型海藻，用刷子刷大型海藻表 面，然后再用水洗若干次，再放入解剖镜下，检查大型海藻表面，确认大型海藻表面无附着 物，用水洗若干次；

（b）将洗净的大型海藻烘干，再研磨成粉，过孔径为0.6～1.2mm的筛网，保留筛下部分， 即获得纯净的大型海藻粉末状样品，再应用稳定同位素比质谱仪观测大型海藻粉末状样品的 δ¹⁵N，应用元素分析仪观测大型海藻粉末状样品的TON。

所述的步骤（a）的采集大型海藻样品优选从海底所采集的健康大型海藻，其生长正常， 群体颜色较为一致，没有出现部分死亡的，最好采3～5个同种大型海藻群体，混合使用。目 的是获得代表这一研究区域氮污染水平的平均δ¹⁵N和TON。

所述的步骤（a）的冷冻保存优选是在-20℃冷冻保存，所述的步骤（a）的用水洗若干次 都为冲洗3次。

所述的步骤（b）的将洗净的大型海藻烘干优选是将洗净的大型海藻放入烘箱内，60℃烘 干48h。

所述的步骤（b）的研磨成粉，优选用电动搅拌器研磨，具体是用间歇式搅动的电动搅拌 机研磨烘干的大型海藻，间歇式搅动的电动搅拌机每次搅拌10～15s，停留5～10s，直到样品 呈粉末状；搅拌时间约1～2min，过长，容易烧毁搅拌器和造成大型海藻样品过热而散发出糊 味，搅拌时间过短，会降低研磨效果。

在步骤（b）中，筛网的孔径选择为0.6～1.2mm，孔径太大会造成筛后大型海藻粉末粒径 均一性差，孔径太小会增加过筛的难度和增加样品量，降低制备效率。

本发明用自来水冲洗大型海藻样品表面，主要是为了去除附着在大型海藻表面的小型生 物和松散的沉积物。用稀盐酸浸泡大型海藻，是为了溶解大型海藻体内或表面附着的碳酸钙 成分，应用蒸馏水冲洗，去除附着大型海藻表面的沉积物和附生植物，在本发明中稀盐酸（v/v） 浓度为5～10%，浸泡时间为0.5～2h，这样不仅去除碳酸钙效果好，还不会引起大型海藻δ¹⁵N 的分馏。本发明的步骤（a）的目的主要是去除附着大型海藻表面的沉积物、附生植物、钙化 生物和大型海藻体内的碳酸钙成分。由于附生的沉积物、附生植物（如固氮蓝藻）和碳酸钙 的δ¹⁵N往往会低于大型海藻δ¹⁵N的1～6‰。因此，上述成分会明显降低大型海藻δ¹⁵N，影 响大型海藻δ¹⁵N指示珊瑚礁区海水中氮污染的效果。

上述步骤（b）研磨的主要目的是磨碎大型海藻样品，获得粒度均匀、混合良好的大型海 藻粉末状样品，在做重复测试，δ¹⁵N的均一性好，偏差小。筛分后大型海藻粉末状样品的δ¹⁵N 偏差介于0～0.2‰，而未经筛分的大型海藻研磨样品δ¹⁵N偏差介于0.5～1‰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明经过三种处理方式，如自来水冲洗、应用5～10%稀盐酸处理和解剖镜检查， 可最终确保大型海藻表面没有附生物和碳酸钙成分，去除影响大型海藻δ¹⁵N和TON的主要 因素；

2、本发明通过研磨和合理孔径筛网的筛分大型海藻样品，获得了纯净、粒度均匀的大型 海藻粉末状样品，显著提高大型海藻δ¹⁵N和TON的代表性和测试精度；

3、本发明可以快速获得纯净、粒度均匀的大型海藻粉末状样品，其操作步骤经过优化后 的稀盐酸浓度、浸泡时间、研磨时间和塑料筛网孔径等，降低了大型海藻δ¹⁵N的分馏，减少 了操作过程中样品量的损耗，提高了制备效率。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例的提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ¹⁵N测试精度和制备效率的方法， 其具体步骤如下：

（1）于2011年5月3日～5月4日，分别在三亚鹿回头和亚龙湾野猪岛珊瑚礁区2m水 深处，从5个群体中共采集喇叭藻Turbinaria ornata样品10g，带回实验室后-20℃冷冻保 存；

（2）待测试时解冻，用自来水冲洗喇叭藻，选取表面整洁的喇叭藻叶片5g放入250ml 的烧杯中；

（3）在上述的烧杯中倒入10%（v/v）的稀盐酸，放置0.5h后，没有气泡再冒出，倒出 稀盐酸液体，用刷子洗刷喇叭藻表面，蒸馏水清洗3次；

（4）将酸处理后的喇叭藻放入解剖镜下（10倍焦距），检查喇叭藻表面，确认喇叭藻 表面无附着物，用蒸馏水清洗3次；

（5）将洗净的喇叭藻放入烘箱内，60℃烘干48h；

（6）取出烘干的喇叭藻，用间歇式电动搅拌器研磨，电动搅拌器每次搅拌15s，停留10 s，如此研磨2min，样品呈粉末状，然后再筛过孔径为0.6mm的塑料筛网，保留筛下部分， 即获得1.5g纯净的喇叭藻粉末状样品，倒入干净的聚乙烯封口袋内，置于干燥器中保存；

（7）应用稳定同位素比质谱仪观测喇叭藻粉末状样品的δ¹⁵N，应用元素分析仪观测喇叭 藻粉末状样品的TON。鹿回头和野猪岛的喇叭藻的δ¹⁵N分别为5.81±0.01‰和3.79±0.06‰ (均值±标准偏差)，TON分别为0.95±0.04%和0.80±0%(均值±标准偏差)。以上结果表 明，鹿回头珊瑚礁区遭受更为严重的污水排放的影响；

与不用稀盐酸处理和筛分研磨样品的对照（没有步骤3、4和6）相比，对照测得的鹿回 头和野猪岛的喇叭藻的δ¹⁵N分别为5.74±0.8‰和3.68±0.6‰(均值±标准偏差)，TON分 别为1.22±0.3%和1.1±0.28%(均值±标准偏差)。由此可见，按照本发明的方法进行处理， 喇叭藻的δ¹⁵N和TON的测试精度和制备效率都得到了较大的提高。

实施例2

本实施例的提高珊瑚礁区大型海藻稳定同位素样品的δ¹⁵N测试精度和制备效率的方法， 其具体步骤如下：

（1）于2010年5月3日-5月4日，在文昌清澜珊瑚礁区，从近河口（～2.8km）与远 离河口（～6.6km）3m水深处，从4个不同群体中采集匍扇藻Lobophora variegata样品8g， 带回实验室后-20℃冷冻保存；

（2）待测试时解冻，用自来水冲洗匍扇藻表面，选取表面整洁的匍扇藻叶片4.5g放入 250ml的烧杯中；

（3）在上述的烧杯中倒入5%的稀盐酸（v/v），放置2h后，没有气泡冒出，倒出稀盐酸 液体，用刷子洗刷匍扇藻表面，蒸馏水清洗3次；

（4）将酸处理后的匍扇藻放入解剖镜下（10倍焦距），检查匍扇藻表面，确认匍扇藻 表面无附着物，用蒸馏水清洗3次；

（5）将洗净的匍扇藻放入烘箱内，60℃烘干48h；

（6）取出烘干的匍扇藻，用间歇式电动搅拌器研磨，电动搅拌器每次搅拌10s，停留10 s，如此研磨1min，样品呈粉末状，然后再筛过孔径为1.2mm的塑料筛网，保留筛下部分， 即获得1.8g纯净的匍扇藻粉末状样品，倒入干净的聚乙烯封口袋内，置于干燥器中保存；

（7）应用稳定同位素比质谱仪观测匍扇藻粉末状样品的δ¹⁵N，应用元素分析仪观测匍扇 藻粉末状样品的TON。近河口与远离河口采集的蒲扇藻的δ¹⁵N分别为7.97±0.05‰和6.33± 0.02‰(均值±标准偏差)，TON分别为2.33±0.05%和1.83±0.04%(均值±标准偏差)。以 上结果表明，近河口区域遭受更为严重的污水排放的影响；

与不用稀盐酸处理和筛分研磨样品对照（没有步骤3、4和6）相比，对照测得的近河口 与远离河口的蒲扇藻的δ¹⁵N分别为7.92±0.82‰和6.3±0.65‰(均值±标准偏差)，TON分 别为2.55±0.45%和2.13±0.38%(均值±标准偏差)。由此可见，按照本发明的方法进行处 理，蒲扇藻的δ¹⁵N和TON的测试精度和制备效率都得到了较大的提高。