利用血红素辣根过氧化物酶催化比色检测三价砷的方法

技术领域

本发明涉及的是一种水体安全检测技术领域的方法，具体是一种利用氯化血红素辣根过 氧化物酶的活性，并通过紫外-可见吸收光谱检测三价砷的方法。

背景技术

无机砷化合物是公认的人类致癌物，广泛分布于土壤、岩石和水体中，而水体中的砷化 物极易通过消化道进入人体内。水砷中毒重灾区主要分布在中国、印度、孟加拉和越南部分地 区，而我国是世界上砷中毒病类型最全和中毒危害最严重的国家之一，所以对水体中的砷进行 快速和准确检测是杜绝这类危害的有效手段之一。水体中的无机砷尤其以三价砷的毒性最高， 是其它砷化合物毒性的60倍，所以开展三价砷的检测具有更重要的意义。

目前测定砷的通用方法主要有原子荧光光谱法、银盐法、砷斑法、硼氢化物还原比色法 (新银盐法)四种。银盐法或新银盐法存在灵敏度不够高，操作比较繁琐，试剂消耗大等缺点。 砷斑法为半定量方法，已不适于现代发展的需要。原子荧光法也存在荧光转换效率低、散射光 干扰的缺陷，同时需要价格昂贵的仪器。

核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中 筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。但与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸 适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，已经用于核酸、蛋白、 无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。虽然Kim等人通过SELEX技术筛选到无机砷的核酸 适配体，但由于其序列较长，不适宜进行修饰，尽管适配体检测传感器的信号输出方法有荧光 比色等多种方式，但通过氯化血红素过氧化物催化比色用于检测还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种利用血红素辣根过氧化物酶催化比色检 测三价砷的方法，能够克服长链核酸适配体难于标记等缺陷，提供一种灵敏度高、选择性好、 成本低。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种三价砷光敏性的实现方法，通过将三价砷依次与砷核酸适配体母液和氯 化血红素混合，然后加入H₂O₂溶液和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液进行反应生成联苯醌， 实现联苯醌在442nm波长处的吸光度的变化量与三价砷浓度呈正向关系。

所述的反应中，三价砷含量维持在10-100ppb；其中：10-100ppb是指终浓度，也就是 直到进行吸光度检测时三价砷的浓度。

所述的砷核酸适配体母液中的砷核酸适配体序列为：

5’-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACC AACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’；其浓度为500μM。

所述的H₂O₂溶液的浓度为200mM；所述的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺的浓度为5mM。

本发明涉及一种利用血红素辣根过氧化物酶催化比色检测三价砷的方法，通过构建含有 已知三价砷浓度的检测体系后，采用多功能酶标仪计进行吸收光谱扫描得到吸光度变化量标准 曲线，然后将待测对象与超纯水，即对照样分别和氯化血红素混合后加入三价砷溶液，然后通 过加入H₂O₂溶液和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液进行反应，最后对两个反应产物在442nm 波长处的吸光度的差值对照吸光度变化量标准曲线得到待测对象中的三价砷浓度。

所述的检测体系通过以下步骤制备得到：

1)制备已知浓度的三价砷检测体系：取5支包含5μL浓度为500μM三价砷核酸适配体 和5μL不同浓度三价砷标准液的离心管，使得整个检测体系中的三价砷含量维持在10-100 ppb，在25℃条件下孵育30分钟；然后分别加入100μL氯化血红素并置于25℃条件下孵育10 min；在上述混合液中加入100μL200mM H₂O₂溶液和50μL 5mM3，3’，5，5’-四甲基联苯胺溶液 充分混匀后再将离心管置于25℃条件下孵育15min作为标准溶液留作以下测定用。

2)取一支离心管将三价砷标准溶液用5μL超纯水替代，其他按步骤1处理后作为空白 对照体系溶液。

所述的吸光度变化量标准曲线是指：采用多功能酶标仪计进行吸收光谱扫描得到442nm 处的吸光度，将不同浓度的标准溶液和空白对照体系溶液的吸光度差值作为纵坐标，三价砷混 合液的浓度作为横坐标得到的回归方程，即标准曲线。

所述的扫描进一步优选为采用96孔酶标板盛放检测体系，吸光度测定波长为442nm的 吸光度，全波长扫描范围为400-800nm。

本发明的原理在于：利用氯化血红素(Hemin)具有过氧化氢酶的活性，在H₂O₂的存在下， Hemin可以催化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)形成蓝色阳离子根，最终生成黄色的联苯醌。实 验中发现，核酸适配体(aptamer)加入后，aptamer可以和Hemin通过π-π堆积相互作用，抑制 Hemin的催化活性，底物被催化后，停留在中间产物阶段，呈蓝色；但当溶液中加入As(III)时， As(III)可以特异性与aptamer结合形成复合结构，从而使Hemin释放到溶液中，恢复了Hemin的 催化活性，进一步催化TMB变为黄色终产物，随着As(III)的加入量的增多，溶液逐渐由蓝色 变为黄色。体系在442nm处的紫外-可见吸光度与As(III)的加入量成正向关系，所以通过溶液 颜色的变化，就可以实现水体中As(III)的检测。

技术效果

与现有技术相比，本发明提供的检测方法不需要大型仪器设备，检测灵敏度高，选择性 好，操作简单，可用于检测饮用水中的三价砷含量是否超标。

附图说明

图1为本方法示意图。

图2为实施例中不同As(III)浓度下紫外-可见吸收光谱示意图。

图3为实施例中不同As(III)浓度下吸光度变化曲线及溶液颜色变化示意图。

图4为实施例中不同金属离子加入检测溶液后的吸光度信号变化量示意图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

如图1所示，本实施例包括以下步骤：

1)制备已知三价砷浓度的检测体系：取5支2mL刻度离心管，分别加入5μL浓度为500 μM砷核酸适配体母液(砷核酸适配体序列为：5’-GGTAATACGACTC ACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTT CTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’)和5μL不同浓度三价砷标准液，使得整个检测体系 中的三价砷含量维持在10-100ppb，充分混匀后将离心管置于25℃条件下孵育30min。将100 μL Hemin加入到上述溶液中，置于25℃条件下孵育10min。随后补加去离子水至350μL。最 后，加入100μL200mM H₂O₂溶液和50μL5mM TMB溶液充分混匀后再将离心管置于25℃ 条件下孵育15min，留作以下测定用。

2)另取1支按步骤1方法制备的检测溶液，加入5μL超纯水替代三价砷标准液，处理后 作为空白对照体系溶液。

3)分别取200μL步骤1和步骤2制备的标准溶液和空白对照液置于96孔酶标板中，用 多功能酶标仪计进行扫描测定信号。具体的扫描条件为：吸光度测定波长为442nm的吸光度， 全波长扫描范围为400-800nm，获得其吸收光谱。三价砷和空白对照液的在442nm处吸光度 分别为A和A₀，计算ΔA＝A-A₀。

4)以不同浓度三价砷(C_As)与对应的吸光度变化量ΔA作图，绘制标准曲线，其回归方程 为y＝0.0016x+0.11643。

5)制备样品检测体系：取5μL待测水样，按步骤1方法制备的检测溶液，充分混匀后取 200μL置于96孔酶标板中，按步骤3方法测定其吸光度变化量ΔA。

6)根据样品测得的ΔA，查标准曲线，可以求得样品中三价砷含量。

7)验证：用本方法测定4份含三价砷浓度分别为50ppb、200ppb、400ppb和600ppb 的多离子混合液各一份，得到的回收率为93.5％-113％，证明了本方法的可靠性。

8)本方法测定水体三价砷的浓度范围为10-100ppb，最低检测限为1ppb，即在低浓度 10到100ppb的范围内，As(III)浓度和吸光度呈良好的线性关系，拟合方程为y＝0.0016x+0.11643 (R²＝0.99)，通过3σ/k计算检出限为1ppb，其中：σ代表6次空白样品溶液标准偏差、k代表 直线拟合斜率。