Anti-HBc 定量检测方法及其在监控慢性乙肝患者病情发展和预测治疗疗效中的用途

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)检测及乙型病 毒性肝炎临床诊断领域，更具体地涉及通过定量检测乙型肝炎病毒核心 蛋白抗体(Antibodies against hepatitis B core protein，Anti-HBc)， 监控慢性乙型肝炎患者病情进展，并有效预测慢性乙型病毒性肝炎 (Chronic hepatitis B)患者接受抗乙型肝炎病毒治疗(特别是基于 干扰素的治疗和基于核苷/核苷酸类似物抗HBV药物的治疗)的疗效， 从而指导病人进行合理药物选择的方法。

背景技术

乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性乙型肝炎病毒感染是全球最为重要 的公共卫生问题之一，目前全球约有超过3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感 染者。慢性乙型肝炎病毒感染可造成慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和原发性肝细 胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)等肝脏疾病，由慢性乙型肝 炎病毒感染及其所引起的相关疾病所导致的死亡，全球每年超过100万 人[1]。

当前针对慢性乙型肝炎病毒感染的治疗药物主要可分为干扰素 (Interferon，IFNs)和核苷/核苷酸类似物(nucleoside or nucleotide， NAs)两类。前者包括普通干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素 (Peginterferon，Peg-IFN，又称为长效干扰素)，主要通过整体增强 患者免疫能力，来达到抑制HBV和治疗CHB的效果；后者主要包括拉米 夫定(lamivudine，LMV)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)、 恩替卡韦(Entecavir，ETV)、替比夫定(Telbivudine，LdT)、替诺福韦 (Tenofovir)等5种，主要通过直接抑制HBV的聚合酶活性从而抑制HBV 复制。对慢性乙型肝炎病毒感染来说，采用上述药物进行慢性乙型肝炎 治疗的最终目标是患者患者达到乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)血清学阴转或血清学转换(HBsAg loss or HBsAg seroconversion)。但由于现有的上述药物实现HBsAg血清学阴 转或血清学转换的效果十分有限，常常需要持续治疗数年以上的时间。 而乙型肝炎病毒E抗原血清学转换(HBeAg seroconversion)是慢性乙 型肝炎病毒感染自然历史过程中的另一个重要的里程碑事件，通常伴随 着临床肝炎病情的缓解和良好的疾病预后，因此目前临床医生和研究者 常以“接受治疗后患者是否发生HBeAg血清学转换”作为判断治疗是否 有效的主要指标。除HBeAg血清学转换之外，持续病毒学应答(Sustained virological response，SVR)也是临床判断慢性乙型肝炎治疗疗效的 次要指标[2，3]。

以能使慢性乙型肝炎病人达到HBeAg血清学转换的为治疗终点来 看，IFNs类药物和NAs类药物在治疗疗效和药物可接受性上有较大区 别。IFNs类药物(主要指Peg-IFN或长效干扰素)疗效优于NAs类药物， 前者治疗1年(52周)可使得30-50％的HBeAg阳性的病人实现HBeAg 血清学转换，而后者通常只能使得10-30％的HBeAg阳性的的病人实现 HBeAg血清学转换。但IFNs类药物治疗的副作用较NAs类药物更大，受 试者常伴有发热、头疼、乏力、头发脱落、白细胞减少等不良反应，部 分患者常无法忍受这些副作用；相比而言，口服NAs类药物副作用很小， 可接受性较强。在价格方面，IFNs类药物(主要指Peg-IFN或长效干扰 素)治疗一年的药物费用约在15000RMB以上，而NAs类药物通常治疗 费用在10000RMB以下。鉴于两类治疗药物的上述区别，在患者治疗前 进行有效评估预测，进而选择最优药物进行慢性乙型肝炎治疗，具有十 分重要的意义。

由于患者能否获得实现HBeAg血清学转换，主要依赖于患者自身是 否具有足够的针对HBV的特异性免疫能力，或能否通过药物治疗获得足 够的针对HBV的特异性免疫能力。因此，定量测定慢性乙型肝炎患者针 对HBV特异性免疫能力能够预测慢性乙肝患者接受治疗时发现HBeAg血 清学转换几率的大小。长期以来，慢乙肝患者血清ALT水平被作为衡量 宿主抗HBV免疫能力的间接替代指标。这主要是因为慢性乙肝患者血清 ALT水平能反映其肝细胞炎症/坏死程度，而HBV是免疫致病病毒，其导 致肝脏炎症/肝细胞坏死是由于抗HBV T细胞介导的免疫反应，因此血 清ALT水平与宿主抗HBV免疫能力之间存在一定的相关性。一般认为， 血清ALT水平大于2倍正常值上限(The upper normal limit，ULN) 的患者抗HBV治疗的疗效(指通过治疗达到HBeAg血清转换的几率)要 显著高于那些没有肝炎反应，亦即血清ALT水平小于正常值上限的慢性 乙肝感染者，而血清ALT水平大于5倍正常值上限的患者抗HBV治疗的 疗效又要优于那些有肝炎反应但ALT水平较低的患者。但ALT水平的测 定，更多的是反应肝脏炎症的程度，ALT不是一个HBV特异性的指标， 易受其他因素的影响(如共发自身免疫性肝炎、酒精性肝病、感染HCV 等其它肝炎病毒)，而且其半衰期较短，其预测慢乙肝治疗疗效并非十 分可靠。除了血清ALT外，HBV特异性的T细胞免疫应答检测方法(如 体外刺激细胞因子释放试验)等可能也具有预测慢性乙肝治疗疗效的应 用价值，但其操作比较繁琐，临床实践推广十分困难，且对检测标本的 要求较高(需要检测新鲜全血标本)，应用前景有限。综上所述，本领 域目前尚缺乏有效的治疗前评估检测方法。

乙型肝炎病毒核心蛋白抗体(Antibodies against hepatitis B core protein，Anti-HBc)是最经典的HBV感染的血清学指标之一， Anti-HBc的定性检测(判断Anti-HBc是否阳性)迄今已在乙型肝炎病 毒感染的临床诊断中使用超过35年。血清Anti-HBc阳性指示受试者曾 经或正被HBV感染，同时该抗体在HBV感染者血清中常常持续终身存在。 目前已经发明的检测血清Anti-HBc抗体的方法主要是基于竞争或抑制 免疫检测原理，此类方法可较好地应用于Anti-HBc的定性检测，但受 技术原理限制，其检测动力学线性范围一般较窄(通常在1个数量级范 围内)，且检测稳定性较差，不能很好地应用于Anti-HBc的定量检测。 综述文献可知，在本发明公布以前，尚无有效的Anti-HBc定量检测方 法及试剂；同时尚不清楚Anti-HBc定量检测的临床价值和对应用途。

发明内容

由于乙型肝炎病毒核心蛋白的免疫原性极强，其血清抗体水平指示 着宿主个体特异性针对HBV的体液免疫反应能力(B cell immune response)，从而反映出宿主抗HBV的整体免疫能力。有鉴于此，本发 明的研究者认为，精确检测慢性乙肝患者血清Anti-HBc水平能指示患 者针对HBV的特异性免疫应答强弱，并能预测其接受药物(包括干扰素 类药物、核苷/核苷酸类似物等)治疗的最终疗效。本发明涉及一种能 精确定量检测乙型肝炎病感染者血清/血浆中Anti-HBc抗体水平的方 法，以及Anti-HBc定量检测在监控慢性乙型肝炎患者病情进展和预测 慢性乙型肝炎患者治疗疗效中的应用。

具体地，本发明涉及一种能精确定量检测血清Anti-HBc水平的免 疫学检测方法，该方法可以通过酶联免疫或者化学发光的检测方式加以 实现。

该方法的性能优势在于其单次检测的线性动力学范围在1.5个数量 级以上，亦即单次检测准确定量的上限值高于准确定量的下限值32倍 以上，这一特征是精确定量检测血清Anti-HBc水平的基础，是本发明 之前的Anti-HBc检测方法所不具备的。

使用该方法在慢性乙型肝炎病毒感染不同时期的病人标本及病人 病程自然进展的系列标本中所获得的结果表明，血清Anti-HBc的定量 水平与病人的肝炎活动性及宿主免疫状态高度相关，Anti-HBc的定量测 定值能有效分辨患者是否处于免疫活化或肝炎活动阶段。这说明在临床 上使用本发明公布的Anti-HBc定量检测方法或其他等效方法有助于对 慢性乙型肝炎患者疾病进展情况的监测和判断。

使用该方法对接受阿德福韦酯和长效干扰素治疗的慢性肝炎病人 队列标本中所获得的结果表明，基线Anti-HBc水平与患者的治疗应答 率呈正相关。这说明在临床上使用本发明公布的Anti-HBc定量检测方 法或其他等效方法，能在慢性乙型肝炎患者接受阿德福韦酯、长效干扰 素或其他基于类似原理的药物治疗前评估预期疗效，有利于指导治疗药 物和治疗时机的选择，进而提高治疗效率。

在另一方面，本发明涉及定量检测乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平 的试剂在制备用于监控慢性乙型肝炎患者的病情发展和/或在慢性乙型 肝炎患者接受抗乙型肝炎病毒治疗前有效预测其治疗效果的诊断剂中 的用途。

在一个具体实施方式中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的定量检测通 过如下方法中的一种或者几种方法来实现：酶联免疫吸附法、化学发光 免疫检测法、时间分辨荧光检测法、免疫比浊法、免疫层析法、免疫渗 滤法。

在一个具体实施方式中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平的单次检 测的线性动力学范围在1.5个数量级以上，亦即单次检测准确定量的上 限值高于准确定量的下限值32倍以上。

在一个具体实施方式中，乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的定量检测包 括以下步骤：

a)提供可与乙型肝炎病毒核心蛋白抗体特异性结合的乙型肝炎 病毒蛋白，该蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的全长氨基酸序列 (从第1位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包含乙型肝炎病毒 核心蛋白的主要免疫优势区的氨基酸序列(如从第1位氨基酸到第149 位氨基酸)，该蛋白被固相化于固相化载体上，作为固相抗原，用于捕 获血清样品中存在的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体；

b)提供可与被捕获到固相抗原上的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体 特异性结合的抗原标记物，该蛋白可以是包含乙型肝炎病毒核心蛋白的 全长氨基酸序列(从第1位氨基酸到第183位氨基酸)，也可以是只包 含乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫优势区的氨基酸序列(如从第1位 氨基酸到第149位氨基酸)，所标记的信号产生物可以是辣根过氧化物 酶、碱性磷酸酶或吖啶酯；

c)提供用于绘制定量标准曲线的已知浓度的定量标准品，通常为 3-6份含不同浓度的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体的样品组成。浓度的单 位可以是IU/mL，PEIU/mL，也可以是其他可以朔源的浓度或滴度单位；

d)样品(待测样品或定量标准品)与固相抗原相互接触，使得样 品中的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体，如果存在的话，被捕获，形成固相 抗原-乙型肝炎病毒核心蛋白抗体复合物；

e)使抗原标记物与步骤c)的产物，即固相抗原-乙型肝炎病毒 核心蛋白抗体复合物相互接触，从而形成固相抗原-乙型肝炎病毒核心 蛋白抗体-抗原标记物复合物；

f)使底物或能激发信号产生的溶液也步骤e)形成的固相抗原-乙 型肝炎病毒核心蛋白抗体-抗原标记物复合物相互接触，从而生产可测 量的信号，并以相应的测定仪器测定所产生的信号强度；

g)将测量得到的定量标准品(通常为3-6份)的信号，与其对应 的浓度值进行线性回归拟合，获得由测量信号计算样品浓度的数学公 式；

h)将待测样品测量得到的信号，引入步骤g)中得到的公式，从 而计算出待测样品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体浓度；

i)如果步骤h)中计算出的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体浓度高于 检测方法能准确定量的量值上限，则需对待侧样品进行稀释，重复步骤 a)到h)，直至测定的浓度值落在相应检测方法能准确定量的量值上限和 量值下限之间。待测样品含有的乙型肝炎病毒核心蛋白抗体浓度由稀释 后测量值×对应稀释倍数计算获得。

在一个具体实施方式中，本发明的诊断剂用于在接受不同治疗药物 的慢性乙型肝炎病人中，所述药物包括：长效干扰素(聚乙二醇化的干 扰素，Peginterferon)、普通干扰素(Interferon)、拉米夫定 (lamivudine，LMV)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil，ADV)、恩替 卡韦(Entecavir，ETV)、替比夫定(Telbivudine，LdT)、替诺福韦 (Tenofovir)或其他可用于慢性乙型肝炎治疗的药物。

在一个具体实施方式中，在治疗前预测病人治疗疗效的通常准则 是：治疗前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平高的病人治疗所 获疗效(应答率)高于治疗前患者血清中乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水 平低的病人；治疗疗效的判定标准可以是乙型肝炎病毒E抗原血清转换 (即接受治疗的慢性乙肝患者由HBeAg(+)/Anti-HBe(-)的状态改变为 HBeAg(-)/Anti-HBe(+))，也可以是病毒学应答(即慢性乙肝患者血清 HBV DNA载量降至1000Copies/mL以下)，还可以是其他能指示病情缓 解或良好预后的临床指标。

在一个具体实施方式中，监控慢性乙型肝炎患者病情进展的通常准 则是：乙型肝炎病毒核心蛋白抗体水平的异常升高指示病人肝脏炎症反 应的发生和宿主抗乙型肝炎病毒特异性免疫应答的活化。

在一个具体实施方式中，本发明涉及Anti-HBc用于制备用来评估 慢性乙型肝炎患者接受阿德福韦酯和聚乙二醇干扰素的治疗应答情况 的试剂盒的用途。

在一个具体实施方式中，本发明涉及Anti-HBc用于制备用来监控 慢性乙肝患者病情发展的试剂盒的用途。

在一个具体实施方式中，本发明涉及Anti-HBc用于制备用来预测 乙肝患者疾病阶段的试剂盒的用途。

附图说明

图1、Anti-HBc ELISA定量方法的动力学线性范围

图2、Anti-HBc ELISA定量方法的实验内(A)和实验间(B)精确性

图3、104份标本Anti-HBc ELISA定量检测结果的一致性

图4、Anti-HBcCLEIA定量方法的动力学线性范围

图5、Anti-HBcCLIA定量方法的动力学线性范围

图6、不同时期的HBV感染者血清Anti-HBc水平的分布情况

(A)、不同时期的HBV感染者血清Anti-HBc水平和ALT水平；

(B)、不同时期的HBV感染者血清HBV DNA水平和HBsAg水 平；

(C)、以血清Anti-HBc水平判别受试者免疫活化状态的ROC曲 线分析；

(D)、不同ALT分层病人的平均Anti-HBc水平；(E)血清Anti-HBc 水平与ALT水平的相关性分析。

缩写注释：PBI，既往感染者；IT，免疫耐受期病人；IC，免疫清 除期病人；LR，低复制期病人；ENH，HBeAg阴性的肝炎；LC，肝硬 化病人；HCC，原发性肝癌病人。

图7、慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中血清Anti-HBc、 ALT、HBV DNA及HBsAg水平的动态变化

图8、慢性乙肝病治疗前血清Anti-HBc水平预测治疗后HBeAg血 清学转换率

(A)、治疗前Anti-HBc水平预测慢性乙肝病人接受阿德福韦酯治 疗后HBeAg血清转换；

(B)、治疗前Anti-HBc水平预测慢性乙肝病人接受聚乙二醇干扰 素治疗后HBeAg血清转换；

(C)、以血清Anti-HBc水平高低预测病人接受阿德福韦酯治疗后 HBeAg血清转换发生率；

(D)、以血清Anti-HBc水平高低预测病人接受聚乙二醇干扰素治 疗后HBeAg血清转换发生率；

(E)在基线ALT水平不同分层的病人中治疗前Anti-HBc水平预 测HBeAg血清转换率。

图9、基线Anti-HBc水平不同分层的病人接受阿德福韦酯和聚乙 二醇干扰素治疗后HBeAg血清学转换发生率

图10、阿德福韦酯治疗过程中和停药后病人血清标志物量化水平的 动态变化

具体实施方式

除非另外定义，本文件中所用的技术和科学名词都表达的是在本发 明涉及领域的熟练技术人员所理解的通常含义。

在本发明的实施例1中，建立了Anti-HBc ELISA(酶联免疫分析， 微孔板法)定量检测方法，该方法能较为精确地确定样本血清中 Anti-HBc的含量，其单次检测能准确定量的线性动力学范围达1.8个数 量级(0.04-2.5IU/mL)，上述特征是已经公布的Anti-HBc检测方法 所不具备的[4，5]。

在实施例2中，建立Anti-HBc CLEIA(酶联化学发光免疫分析，微 孔板法)定量检测方法，该方法能较为精确地确定样本血清中Anti-HBc 的含量，其单次检测能准确定量的线性动力学范围达2.7个数量级(0.04 -20IU/mL)。该方法较实施例1中描述的Anti-HBc ELISA定量检测方 法显著提高了单次检测的线性动力学范围，使得Anti-HBc高值标本的 检测所需的稀释次数大大减少，提高了效率。

在实施例3中，建立Anti-HBc CLIA(直接化学发光免疫分析，微 粒子法)定量检测方法，该方法能较为精确地确定样本血清中Anti-HBc 的含量，其单次检测能准确定量的线性动力学范围达3.02个数量级 (0.02-20.8IU/mL)。该方法较实施例1中描述的Anti-HBc ELISA 定量检测方法显著提高了单次检测的线性动力学范围，使得Anti-HBc 高值标本的检测所需的稀释次数大大减少，提高了效率。该方法较实施 例2中描述的Anti-HBc CLEIA定量检测方法的区别在于采用单管式检 测，如配以全自动设备，在临床上便于实现随到随检。

在实施例4中，将上述Anti-HBc定量检测方法应用于评估不同时 期的HBV感染者血清Anti-HBc水平的分布情况。评估结果表明，在慢 性乙型肝炎感染者中，血清Anti-HBc水平高低与感染者的肝炎活动性 及宿主免疫状况相关。Anti-HBc水平可以用于判断慢性乙型肝炎感染者 是否处于免疫激活状态或肝炎活动状态，诊断准确性(AUROC)为0.918 (95％CI：0.888-0.948)，判断临界值为7400IU/mL。这一结果表明， 本发明公布的Anti-HBc定量检测方法所获检测结果有助于临床医生对 患者疾病阶段的判断。

在实施例5中，将上述Anti-HBc定量检测方法应用于评估慢性乙 型肝炎病毒感染者自然进展过程中Anti-HBc水平的动态变化及其与其 他指标的联系。评估结果表明，慢性乙型肝炎病毒感染者发生肝炎活动 时，Anti-HBc与ALT几乎同时升高，Anti-HBc峰值通常较ALT峰值晚 3-8周，但有时可能早于或与ALT峰值同时；在肝炎恢复期，ALT很快 复常，Anti-HBc则需晚12-20周才能回到基线水平。这一结果进一步表 明，采用发明公布的方法定量测定慢性乙型肝炎病毒感染者的Anti-HBc 水平，可作为ALT测量的补充指标，有助于临床医生判断患者是否正处 于肝炎活动期或在最近3-4个月时间内曾经有肝炎活动。

在实施例6中，将Anti-HBc定量检测方法应用于评估慢性乙型肝 炎患者接受阿德福韦酯和聚乙二醇干扰素的治疗应答情况。结果表明， 慢性乙型肝炎患者接受治疗前Anti-HBc水平高低与治疗后HBeAg血清 学转换率正相关：治疗前Anti-HBc水平高(在本实施例中为≥29000 IU/mL)的患者即使采用价格便宜副作用小但疗效较差的阿德福韦酯治 疗也能达至较为理想的效果；而治疗前Anti-HBc处于中等水平(在本 实施例中为9000-29000IU/mL)或低水平(在本实施例中＜9000IU/mL) 的患者，采用阿德福韦酯治疗疗效显著低于费用高副作用相对较大但强 效的长效干扰素。在治疗前Anti-HBc水平高(≥29000IU/mL)的患者 中，阿德福韦酯对病毒复制的抑制效果显著优于治疗前Anti-HBc水平 低(＜29000IU/mL)的患者。这一结果表明，采用发明公布的方法定量 测定慢性乙型肝炎病毒感染者接受治疗前的Anti-HBc水平，能够预测 其接受阿德福韦酯、长效干扰素或其他基于类似原理的药物治疗后的预 期疗效，有利于指导治疗药物和治疗时机的选择，进而提高治疗效率。

下面采用实施例对本发明进行进一步描述和说明。所述实施例旨在 以举例方式具体阐明本发明，各实施例中所用试剂、化学品或生物活性 材料浓度、所用病人队列和其他变量值等只是举例说明本发明的应用， 而不构成对本发明的限制。

实施例

1、双抗原夹心法Anti-HBc定量的酶联免疫检测(ELISA)方法

1.1固相化抗原及标记抗原的制备

本方法中采用的固相化抗原及标记抗原是能与样品中的Anti-HBc 抗体特异性结合的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)，该抗原可以是包 含HBcAg的全长氨基酸序列(Cp183)，也可以是只包含HBcAg的主要 免疫优势区的氨基酸序列(Cp149)。本发明采用的HBcAg抗原均是 E.Coli重组表达纯化所获得的。Cp149重组抗原的表达纯化方法参考 Adam Zlotnick等公布的方法进行制备[6]，Cp183重组抗原表达纯化方 法参考An Li等公布的方法进行制备[5]。在本发明中通常以Cp149重 组抗原作为固相化抗原，而以Cp183重组抗原作为标记抗原。

1.2反应板的制备

(1.2.1)将Cp149抗原用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO₃/Na₂CO₃缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为3μg/ml。

(1.2.2)在96孔酶标板每孔加入100μl的包被液，2～8℃包被 16～24小时后再37℃包被2小时。

(1.2.3)用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20) 洗涤1次。然后每孔加入200μl的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪 蛋白的pH值为7.4的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶液)，放入37℃ 封闭2小时；弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。

1.3Cp183抗原的HRP标记

采用改良过碘酸钠法。以标记10mg Cp183重组抗原为例：

(1.3.1)将浓度为2mg/L的Cp183重组抗原(5mL)装入透析袋， 对50mM CB缓冲液在4℃透析4小时，中途每2小时更换透析缓冲液1 次。

(1.3.2)准确称取HRP 40mg，溶解于2mL ddH2O，溶解后加入 20mg/mL的NaIO4溶液2ml，室温反应30分钟；加入乙二醇40uL，4℃ 反应30分钟后制成HRP活化溶液(10mg/mL，4mL)。

(1.3.3)将经1.3.2步骤制成的HRP活化溶液，加入装有Cp183 重组抗原的透析袋，混匀后继续对50mM CB缓冲液在4℃避光条件下进 行透析，中途每2小时更换透析缓冲液1次，透析6-8小时。

(1.3.4)配制NaBH4溶液(5mg/mL)0.4mL，加入完成1.3.3步骤 的标记反应溶液，并混匀，置于4℃避光条件下反应2小时。

(1.3.5)完成1.3.4步骤后，再次将标记反应溶液装入新的透析 袋，对PBS缓冲液在4℃透析4小时。

(1.3.6)完成1.3.5步骤后，用GE公司生产的Sephacryl S-300HR 层析柱进行纯化，分离出Cp183-HRP标记物。

(1.3.7)将经1.3.6步骤分离纯化出的Cp183-HRP标记物浓缩至 2mg/mL，并按照体积比1∶1加入甘油，混匀后-20℃保存备用。

(1.3.8)将经1.3.7步骤制得的Cp183-HRP标记物，按体积比 1/4000稀释至酶标记物稀释缓冲液(含有20％小牛血清、1％酪蛋白、10％ 蔗糖、0.05％氨基比林的pH值为7.4的20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液溶 液)，制成酶标记物反应液，混匀后2-8℃保存备用。

1.4定量标准品

Anti-HBc定量检测的定量标准品为含不同浓度的乙型肝炎病毒核 心蛋白抗体的系列样品组成。浓度的单位可以是IU/mL，PEIU/mL，也可 以是其他可以朔源的浓度或滴度单位。在本发明中使用通行的国际单位 (IU/mL)为Anti-HBc定量的单位，以NIBSC公布的Anti-HBc WHO标 准品(Code：95/522，50IU/ampoule)[7]，倍比稀释至40IU/mL，20IU/mL， 10IU/mL，5IU/mL，2.5IU/mL，1.25IU/mL，0.625IU/mL，0.3125 IU/mL，0.156IU/mL，0.078IU/mL，0.039IU/mL，0.02IU/mL，0.01 IU/mL共13种不同浓度。稀释标准品用的基质溶液可以为Anti-HBc阴 性的健康献血者血浆或血清，也可以是含20％新生牛血清的PBS溶液。

1.5Anti-HBc的ELISA定量检测

选取1份慢性乙型肝炎患者的血清(编号P1)按照下列步骤进行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血清Anti-HBc水平通常 较高，我们将该标本以含20％新生牛血清的PBS溶液稀释成1∶500、1∶ 2500、1∶12500、1∶62500共4个稀释度进行定量ELISA检测。

(1.5.1)样品反应：取已包被的酶标板一块，每孔加入90μL样 品稀释液，每孔再加入10μL标本或者标准品，震荡混匀后，置于37℃ 温箱反应30分钟。

(1.5.2)酶标记物反应：完成1.5.1步骤后，将酶标板用PBST洗 液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100 μL如1.3.8步骤制备的酶标记物反应液，置于37℃温箱反应30分钟。

(1.5.3)显色反应：完成1.5.2步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(由 北京万泰生物药业股份有限公司提供)各50μL，置于37℃温箱反应15 分钟。

(1.5.4)终止反应及读值测量：完成1.5.3步骤后，在反应完的 酶标板中每孔加入终止液(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)50 μL，并于酶标仪上检测各孔的OD_450/630值。

(1.5.5)定量标准曲线的绘制：完成1.5.4步骤后，对13个定量 标准品的测量值及其对应浓度进行线性回归，绘制出如图1的定量标准 曲线。由图1可知，Anti-HBc ELISA方法能准确定量的上限值为2.5 IU/mL，下限值为0.04IU/mL，其线性动力学范围为1.8个数量级。由 OD_450/630测量值计算Anti-HBc浓度的公式为：Conc._anti-HBc(IU/mL)＝ 1.2104×OD_450/630-0.011。

(1.5.6)待测样品Anti-HBc浓度的获得：P1血清的系列稀释样本 经1.5.1-1.5.5的步骤测量后，其1∶500稀释的OD_450/630测量值为3.899、 1∶2500稀释的OD_450/630测量值为3.801、1∶12500稀释的OD_450/630测量值 为2.988、1∶62500稀释的OD_450/630测量值为0.301；将上述测量值代入 步骤1.5.5中获得的Anti-HBc浓度计算公式，其中1∶500测得的浓度 值为4.71IU/mL，1∶2500测得的浓度值为4.59IU/mL，1∶12500测 得的浓度值为3.61IU/mL，1∶62500测得的浓度值为0.35IU/mL。1∶ 62500稀释度测得的浓度值落在本ELISA方法能准确定量的线性动力学 范围(0.04-2.5IU/mL)内，因此该样本的原始Anti-HBc浓度为0.35 ×62500＝22083IU/mL。

(1.5.7)检测方法的试验内(Intra-assay)精确性评价：取已知 浓度的6份标本，其Anti-HBc定量值分别为5IU/mL，2.5IU/mL，1.25 IU/mL，0.625IU/mL，0.3125IU/mL，0.156IU/mL，在同次实验中， 每份样本按照1.5.1-1.5.4的步骤重复检测16孔，检测完后分别计算 各样品OD_450/630测量值的试验内变异系数，如图2A所示，6份样本的试 验内变异系数在2.8％-10.1％之间。

(1.5.8)检测方法的试验间(Inter-assay)精确性评价：取已知 浓度的6份标本，其Anti-HBc定量值分别为5IU/mL，2.5IU/mL，1.25 IU/mL，0.625IU/mL，0.3125IU/mL，0.156IU/mL。对上述6份样品 按照1.5.1-1.5.4的步骤进行16次独立的检测实验，完成全部检测后 分别计算各份样品OD_450/630测量值的试验间变异系数，如图2B所示，6 份样本的试验间变异系数在4.4％-10.5％之间。

(1.5.9)Anti-HBc定量检测的重现性评估：随机选择104份慢性 乙型肝炎患者血清标本(Anti-HBc水平在2.23log₁₀IU/mL至5.37 log₁₀IU/mL之间)，按照1.5.1-1.5.6的步骤进行Anti-HBc的定量测 定，独立重复测量2次，并对两次测量结果进行回归分析，如图3所示， 两次测量结果高度一致，R²＝0.988。

2、双抗原夹心法Anti-HBc定量的化学发光酶联免疫检测 (CLEIA)方法

2.1固相化抗原及标记抗原的制备

按照本发明中实施例1第1.1节所述的方法进行。

2.2化学发光反应板的制备

按照本发明中实施例1第1.2节所述的方法进行，但采用化学发光 反应板作为抗原固相化载体。

2.3Cp183抗原的HRP标记

按照本发明中实施例1第1.3节所述的方法和步骤进行。

2.4定量标准品

同本发明实施例1第1.4节所述。

2.5Anti-HBc的CLEIA定量检测

选取1份慢性乙型肝炎患者的血清(编号P1)按照下列步骤进行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血清Anti-HBc水平通常 较高，我们将该标本以含20％新生牛血清的PBS溶液稀释成1∶500、1∶ 2500、1∶12500共3个稀释度进行定量CLEIA检测。

(2.5.1)样品反应：取已包被的化学发光反应板一块，每孔加入 90μL样品稀释液，每孔再加入10μL标本或者标准品，震荡混匀后， 置于37℃温箱反应30分钟。

(2.5.2)酶标记物反应：完成2.5.1步骤后，将化学发光反应板 用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每 孔加入100μL如1.3.8步骤制备的酶标记物反应液，置于37℃温箱反 应30分钟。

(2.5.3)发光反应和测量：完成2.5.2步骤后，将化学发光反应 板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍， 每孔加入Pierce公司生产的PICO Chemiluminescent Substrate 100 μL，立即采用Orin II化学发光检测仪读取各反应孔发光值(RLU)。

(2.5.4)定量标准曲线的绘制：完成2.5.3步骤后，对13个定量 标准品的测量值及其对应浓度进行线性回归，绘制出如图4的定量标准 曲线。由图4可知，Anti-HBc CLEIA方法能准确定量的上限值为20IU/mL， 下限值为0.04IU/mL，其线性动力学范围为2.7个数量级。由RLU测量 值计算Anti-HBc浓度的公式为：Conc.anti-HBc(IU/mL)＝ 10^{(Log10(RLU)×0.9337-5.3006)}。

(2.5.4)待测样品Anti-HBc浓度的获得：P1血清的系列稀释样本 经2.5.1-2.5.4的步骤测量后，其1∶500稀释的RLU测量值为12115100、 1∶2500稀释的RLU测量值为5067890、1∶12500稀释的RLU测量值为 889610；将上述测量值代入步骤2.5.4中获得的Anti-HBc浓度计算公 式，其中1∶500测得的浓度值为20.56IU/mL，1∶2500测得的浓度值 为9.114IU/mL，1∶12500测得的浓度值为1.795IU/mL，其中1∶2500 和1∶12500两个稀释度的测量值落在本CLEIA方法能准确定量的线性 动力学范围(0.04-20IU/mL)。据此如以1∶2500的测量值计算，该 样本的原始Anti-HBc浓度为9.114×2500＝22784IU/mL；而如以1∶12500 的测量值计算，该样本的原始Anti-HBc浓度为1.795×12500＝22442 IU/mL。两个测量值的平均浓度为22613IU/mL，该浓度值与采用ELISA 方法测得的该标本的浓度值22083IU/mL的误差为2.4％，属于正常偏差 范围内。

3、双抗原夹心法Anti-HBc定量的管式微粒化学发光检测(CLIA) 方法

3.1固相化抗原及标记抗原的制备

按照本发明中实施例1第1.1节所述的方法进行。

3.2化学发光反应板的制备

(3.2.1)取1mg磁珠，用1mL活化缓冲体系(50mM MES 5.0)洗 涤2遍，弃上清。加入1mg EDC和1mg NHS试剂(均用50mM MES 5.0 配置成10mg/mL)，混匀后，室温振荡活化20分钟；

(3.2.2)将活化好的磁珠用1mL活化缓冲体系(50mM MES 5.0) 洗涤2遍，弃上清。加入Cp149抗原25μg，混匀后，室温振荡反应3h；。

(3.2.3)用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20) 洗涤3次。然后每孔加入2500μl的保存液(20mM PB7.4、0.1％BSA、 100mM Gly、0.05％TW-20、0.1％Proclin)，2-8℃保存备用。

3.3Cp183抗原的吖啶酯标记

(3.3.1)取50μg蛋白Cp183，加入到300μl标记缓冲体系(50mM 磷酸盐缓冲液，PH8.0)中，加入8μL吖啶酯(5mM NHS-SAE)，避光室 温反应30min。

(3.3.2)在步骤(3.3.1)中反应好的标记物中加入100μL终止 缓冲液(含100mM甘氨酸的磷酸盐缓冲液，PH8.0)，避光室温反应30min。

(3.3.3)将经过步骤(3.3.2)的标记物装入透析袋，用透析缓冲 液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)在4℃避光条件下进行透析，中途每 2小时更换透析缓冲液1次，透析6-8小时。

(3.3.4)将步骤(3.3.3)所得标记物移入保存管，加入2％BSA和 50％甘油，-20℃保存备用。

(3.3.5)将经3.3.4步骤制得的Cp183-SAE标记物，按体积比1/500 稀释至吖啶酯标记物稀释缓冲液(含有20％小牛血清、1％酪蛋白、10％ 蔗糖、0.05％氨基比林的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液 溶液)，制成发光记物反应液，混匀后2-8℃保存备用。

3.4定量标准品

取已知浓度的Anti-HBc高浓度样本P1(Anti-HBc＝22083IU/mL)， 以含20％新生牛血清的PBS溶液进行系列稀释，分别稀释至4000IU/mL， 1333IU/mL 333IU/mL，83.3IU/mL，20.8IU/mL，5.21IU/mL，1.30 IU/mL，0.33IU/mL，0.08IU/mL，0.02IU/mL，0.005IU/mL作为CLIA 方法的定量标准品。

3.5Anti-HBc的CLEIA定量检测

选取1份慢性乙型肝炎患者的血清(编号P2)按照下列步骤进行 Anti-HBc的定量检测。鉴于慢性乙型肝炎患者血清Anti-HBc水平通常 较高，我们将该标本以含20％新生牛血清的PBS溶液稀释成1∶500、1∶ 2500共2个稀释度进行定量CLIA检测。P2标本经实施例1所述的 Anti-HBc ELISA定量方法检测，确定其Anti-HBc浓度为8069IU/mL。

(3.5.1)样品反应：取50μL磁珠试剂加入反应管，每孔再加入 10μL标本或者标准品，震荡混匀后，置于37℃温箱反应15分钟。

(3.5.2)发光标记物反应：完成3.5.1步骤后，将化学发光反应 管用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍， 每孔加入50μL如3.3.5步骤制备的发光标记物反应液，置于37℃温箱 反应10分钟。

(3.5.3)发光反应和测量：完成3.5.2步骤后，将化学发光反应 板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍， 用Sirius-L单管式化学发光检测仪通过原位进样注入激发液，同时进 行光强检测。

(3.5.4)定量标准曲线的绘制：完成3.5.3步骤后，对11个定量 标准品的测量值及其对应浓度进行线性回归，绘制出如图5的定量标准 曲线。由图5可知，Anti-HBc管式微粒化学发光检测(CLIA)方法能准 确定量的上限值为20.8IU/mL，下限值为0.02IU/mL，其线性动力学范 围为3.02个数量级。由RLU测量值计算Anti-HBc浓度的公式为： Conc.anti-HBc(IU/mL)＝10^{(Log10(RLU)×1.1409-5.861)}。

(3.5.5)待测样品Anti-HBc浓度的获得：P2血清的系列稀释样本 经3.5.1-3.5.4的步骤测量后，其1∶500稀释的RLU测量值为1571400、 1∶2500稀释的RLU测量值为380560；将上述测量值代入步骤3.5.4中 获得的Anti-HBc浓度计算公式，其中1∶500测得的浓度值为16.16 IU/mL，1∶2500测得的浓度值为3.204IU/mL，均落在本CLIA方法能 准确定量的线性动力学范围(0.02-20.8IU/mL)。据此如以1∶500的 测量值计算，该样本的原始Anti-HBc浓度为16.16×500＝8078IU/mL； 而如以1∶2500的测量值计算，该样本的原始Anti-HBc浓度为3.204 ×2500＝8010IU/mL。两个测量值的平均浓度为8044IU/mL，该浓度值 与采用ELISA方法测得的该标本的浓度值8069IU/mL的误差为3.1％， 属于正常偏差范围内。

4、不同时期的HBV感染者血清Anti-HBc水平的分布情况

4.1横断面病人血清标本的选择

本发明中，为研究不同时期的HBV感染者血清Anti-HBc水平的分布 情况，共收集350例既往HBV感染恢复的健康人血清标本和488例慢性 乙肝携带的病人血清标本，所有血清标本均分离血清后，储存于-80℃。 488例病人中，109例为原发性肝癌病人，63例为肝硬化病人，其余316 例为单纯的慢性乙肝病人，所有的病人均排除了同时伴有丙型肝炎病毒 (HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病 毒(HEV)感染的可能性，也无同时伴有自身免疫性或代谢性肝脏疾病的 临床医学证据。

依据欧洲肝脏病协会2009年慢性乙肝临床管理指南，将316例单纯 的慢性乙肝病人划分为不同感染阶段。其中52例病人处于免疫耐受期 (immune tolerance phase，IT)，其特征是年龄小于35岁，HBeAg阳 性，血清HBV DNA载量大于5×10⁷copies/mL，ALT水平在过去12个月 的时间内的检测均小于正常值上限(ULN，在本发明中指40U/L)；104 例病人处于免疫清除期(immune clearance phase，IC)，其特征是HBeAg 阳性，血清HBV DNA载量大于1×10⁴copies/mL，ALT水平大于2倍ULN； 75例病人处于低复制期(low-replicative phase，LR)，其特征是HBeAg 阴性，血清HBV DNA载量小于1×10⁴copies/mL，ALT水平在过去12个 月的时间内的检测均小于ULN；85例病人处于HBeAg阴性的肝炎期，其 特征是HBeAg阴性，血清HBV DNA载量大于2×10⁴copies/mL，ALT水 平大于2倍ULN。

4.2临床检验方法

病人血清ALT水平和其他肝功能生化指标在标本采集后24小时后 测定；血清HBV DNA载量和HBV基因型检测采用文献报告的方法进行； HBsAg定量采用北京万泰生物药业公司的HBsAg化学发光定量试剂盒； HBeAg，Anti-HBe的测定采用美国雅培公司的Architect化学发光全自 动检测系统。

4.3病人血清标本的Anti-HBc定量

采用如本发明实施例1、或实施例2、或实施例3中所述的方法进 行。

4.4统计学方法

分组连续变量的比较采用unpaired t-test或Kruskal-Wallis ANOVA，分类变量的组间比较采用Mantel-Haenszel χ2test或Fisher 确切概率，Pearson test用于相关分析。诊断精确性分析采用受试者工 作曲线(Receiver operating characteristic，ROC)并计算诊断效能 (ROC曲线下面积，AUROC)。P值小于0.05被视为具有显著的统计学差 异。

4.4病人队列的基本特征

4.1节中描述的HBV既往感染者及慢性HBV携带者的人口统计学、 临床病毒学及血液生物化学背景数据如表1所示。

4.5不同时期的HBV感染者血清Anti-HBc水平

图6A/B展现了横断面病人的血清Anti-HBc水平、ALT水平、HBsAg 水平及HBV DNA载量在不同疾病时期的分布状况。既往感染者的血清 Anti-HBc水平显著低于慢性HBV携带者(中位值：0.4vs.4.1log₁₀IU/mL，p＜0.001，低超过1000倍)；在处于不同感染时期的单纯的慢 性乙肝病人中，血清Anti-HBc的水平显著不同。处于免疫耐受期的病 人血清Anti-HBc水平的中位值为3.4log₁₀IU/mL，处于免疫清除期的 病人血清Anti-HBc水平的中位值为4.4log₁₀IU/mL，处于低复制的病 人血清Anti-HBc水平的中位值为3.3log₁₀IU/mL，处于HBeAg阴性肝 炎期的病人血清Anti-HBc水平的中位值为4.4log10IU/mL。从以上数 据分析可知，处于免疫清除期和HBeAg阴性肝炎期的病人血清Anti-HBc 水平显著高于处于免疫耐受期和低复制的病人(p＜0.001)；免疫清除 期和HBeAg阴性肝炎期病人的血清Anti-HBc水平无统计学差异 (p＞0.05)，免疫耐受期和低复制病人的血清Anti-HBc水平也无统计 学差异(p＞0.05)。上述结果表明慢性乙肝病人血清Anti-HBc水平与 宿主免疫状态高度相关。高水平的Anti-HBc指示病人处于Anti-HBV的 免疫活化状态，如以Anti-HBc水平来判别受试个体是否处于免疫活化 状态(免疫清除期或HBeAg阴性肝炎期)，经过ROC曲线分析(如图6C 所示)，诊断效能(AUROC，曲线下面积)为0.918(95％置信区间： 0.888-0.948)。当以ROC曲线计算出的最优Cutoff值7400IU/mL为 临界值时，诊断灵敏度为87.3％，诊断特异性为83.5％。

分析乙肝肝硬化病人和乙肝原发性肝细胞癌病人的血清Anti-HBc 水平，结果如图6A/B所示。在乙肝肝硬化病人中，ALT≥ULN的39例病 人(LC-b组)血清Anti-HBc水平显著高于ALT＜ULN的24例病人(LC-a 组)(中位值为：4.2log₁₀vs.3.8log₁₀IU/mL，p＝0.016)；而在乙 肝原发性肝细胞癌病人中，ALT≥ULN的80例病人(HCC-b组)血清 Anti-HBc水平也显著高于ALT＜ULN的29例病人(HCC-a组)(中位值 为：4.1log₁₀vs.3.8log₁₀IU/mL，p＝0.006)。上述结果进一步证明 了慢性乙肝感染者血清Anti-HBc水平与ALT水平及宿主免疫状态存在 显著关联。

4.6慢性乙型肝炎病毒携带者Anti-HBc水平与ALT水平的相关性

分析在全部488例慢性慢性乙型肝炎病毒携带者中(包括单纯的慢 性乙肝患者、乙肝肝硬化患者和乙肝原发性肝细胞癌患者，n＝488)，不 同ALT分层病人的Anti-HBc水平，结果如图6D所示。患者平均Anti-HBc 水平在ALT≤5×ULN的病人中，随ALT水平的增强而逐渐升高 (ptrend＜0.001)；当ALT达到5×ULN后，Anti-HBc水平达到最高值而 不再继续升高(ptrend＝0.63)。相关分析显示(图6E)，在平均Anti-HBc 水平在ALT≤5×ULN的病人(n＝328)中，Anti-HBc水平与ALT水平呈 现正相关(单因素分析：r＝0.52，p＜0.001；多因素分析：R＝0.53，p＜0.001)， 而与HBV DNA水平(p＝0.25)或HBsAg水平(p＝0.33)不具有相关性。 在ALT≤5×ULN的病人，Anti-HBc水平与ALT水平的定量相关性无论在 男性患者(r＝0.53，p＜0.001)或女性(r＝0.43，p＜0.001)患者；在感染HBV 基因型B的患者(r＝0.49，p＜0.001)或感染HBV基因型C的患者(r＝0.53， p＜0.001)；在HBeAg阳性的患者(r＝0.57，p＜0.001)或HBeAg阴性的患者 (r＝0.50，p＜0.001)中均成立。在ALT＞5×ULN(n＝160)，Anti-HBc水平 与ALT水平不具有统计显著的相关性(p＝0.43)，也不与HBV DNA水平 (p＝0.63)或HBsAg水平相关(p＝0.43)。

5、慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中Anti-HBc水平的动 态变化及其与其他指标的联系

5.1病人队列

本实施例中一共研究了9例未接受Anti-HBV治疗的病人自然进展 的纵向观察系列血清标本，平均观察时间为103±38周(57-168周)， 随访5-17次，共计77份血清样本。

5.2临床检验方法

按实施例4中4.2节的描述进行。

5.3病人血清标本的Anti-HBc定量

按实施例4中4.3节的描述进行。

5.4统计学方法

纵向数据分析采用广义回归方程(Generalized estimating equations，GEE)，其余统计分析方法按实施例4中的描述进行。

5.5慢性乙型肝炎病毒携带者自然进展过程中血清标志物的动态变 化和彼此间的相互联系

9例病人(A-G)在随访观察期间的Anti-HBc水平、ALT水平、HBsAg 水平和血清HBV DNA载量动态变化情况如图7所示。病人A在随访观察 期间处于免疫耐受期，其血清HBV DNA载量，HBsAg一直处于很高的水 平，同时ALT水平和Anti-HBc水平一直处于很低的水平。除病人A外， 其他病人(B-G)在随访观察期间均经历了1次或更多的肝炎活动。通 过对这些病人的观察发现，Anti-HBc水平的升高总是伴随着ALT水平的 升高，亦即伴随着肝炎的发生。多数情况下，肝炎急性发作时，病人血 清Anti-HBc水平一般比ALT水平晚3-8周达到峰值(图7，如病人C， 病人D的第一时段，病人F的第一时段，病人G和I的情况所示)；在 某些情况下，病人血清Anti-HBc水平也可能早于或与ALT同时达到峰 值(图7，如病人B，病人D、病人F和病人H的第二时段，病人E的情 况所示)。在肝炎恢复期，Anti-HBc的下降比ALT复常更为缓慢， Anti-HBc通常在ALT复常后12-20周方能回到基线水平。

总体而言，多因素纵向数据分析显示血清Anti-HBc水平与ALT水 平独立相关(β＝0.65，p＜0.001)，而与血清HBV DNA载量(β＝-0.006， p＝0.98)和HBsAg水平无统计显著的相关性(β＝-0.034，p＝0.45)。

6、Anti-HBc定量水平能预测慢性乙型肝炎病人的抗病毒治疗疗 效

6.1病人队列

病人队列A：HBeAg阳性病人49例，所有患者均接受adefovir dipivoxil(阿德福韦酯，10mg/天)，共治疗96周，停药后随访12周。

病人队列B：HBeAg阳性病人48例，所有患者均接受Peginterferon alpha-2a(长效干扰素α-2a，180μg/week)，共治疗24周，停药后 随访24周。

上述病人治疗前临床指征均符合APASL慢性乙肝临床管理指南推荐 的治疗适应症：HBsAg阳性持续1年以上，均为HBeAg阳性Anti-HBe 阴性，血清ALT水平高于2倍ULN；均排除了同时伴有丙型肝炎病毒 (HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝 炎病毒(HEV)感染的可能性，也无同时伴有自身免疫性或代谢性肝脏 疾病的临床医学证据。

6.2临床检验方法

按实施例4中4.2节的描述进行。

6.3病人血清标本的Anti-HBc定量

按实施例4中4.3节的描述进行。

6.4治疗终点的定义

主要治疗终点定义为随访终点发生HBeAg血清学转换。

6.5统计学方法

所有统计分析方法按实施例4中的描述进行。

6.6病人队列的基本特征

如表2所示。

表2.接受阿德福韦酯(队列A)和PEG干扰素(队列B)治疗的HBeAg阳性的慢性 乙型肝炎病人的基线特征.

注.^a全部病人均为HBeAg阳性且在治疗前筛选阶段ALT水平大于 2×ULN，在开始治疗时，有11例病人(队列A有5例，队列B中有6 列)的ATL水平下降至2×ULN以下。ADV，阿德福韦酯；Pegasys，聚 乙二醇干扰素α-2a；ULN，正常值上限.

6.7基线Anti-HBc水平与治疗后HBeAg血清学转换的发生率相关

完成治疗及随访观察后，队列A的49例病人(接受阿德福韦酯治 疗)中有9例随访终点发生HBeAg血清学转换，治疗有效率为18.4％(95％ CI：8.8 32.0％)；队列B的48例病人(接受长效干扰素治疗)中有23 例截止随访终点时发生了HBeAg血清学转换，治疗有效率为47.9％(95％ CI：33.3 62.8％)。

分析两个队列中治疗有效的病人和无效的病人在接受治疗前的各 临床指标，结果如表3。无论阿德福韦酯治疗的病人，还是长效干扰素 治疗的病人，治疗有效者和无效者的年龄、男女性别比、ALT水平、血 清HBV DNA载量、HBsAg水平和Anti-HBc-IgM水平均无统计学显著的 区别。但治疗有效者的基线Anti-HBc水平显著高于治疗无效者：队列A 中，4.58±0.28vs.4.15±0.42log10IU/mL，p＝0.005；队列B中， 4.32±0.66vs.3.81±0.68log10IU/mL，p＝0.011。这一结果提示治 疗前Anti-HBc水平可能预测患者的预期治疗疗效。ROC分析显示，基线 Anti-HBc水平预测随访终点HBeAg血清学转换的AUROC值在队列A中为 0.810，(95％CI：0.6750.948，p＝0.004，如图8A)，最优Cutoff值 为29000IU/mL，此时诊断灵敏度为77.8％，诊断特异性为77.5％；AUROC 在队列B中为0.710(95％CI：0.5640.855，p＝0.013，如图8B)，最 优Cutoff值为9000IU/mL，此时诊断灵敏度为69.6％，诊断特异性为 60.0％。

6.8基线Anti-HBc水平预测治疗后HBeAg血清学转换的发生率

6.7节中计算出的Cutoff值可用于在治疗前预测病人接受治疗后 HBeAg血清学转换的发生率。在队列A中，如图8C所示，基线Anti-HBc 水平大于29000IU/mL的16例病人有7个病人发生随访终点HBeAg血 清学转换(有效率：43.8％)，而基线Anti-HBc水平小于29000IU/mL 的33例病人只有2例病人发生随访终点HBeAg血清学转换(有效率： 6.1％)，Anti-HBc高低两组间HBeAg血清转换的发生率比(Risk Ratio， RR)为7.22(95％CI：1.69 30.9，p＝0.006)。在队列B中，如图8D 所示，基线Anti-HBc水平大于9000IU/mL的25例病人有16个病人发 生随访终点HBeAg血清学转换(有效率：64.0％)，而基线Anti-HBc水 平小于9000IU/mL的23例病人只有7例病人发生随访终点HBeAg血清 学转换(有效率：30.4％)，Anti-HBc高低两组间HBeAg血清转换的发 生率比(Risk Ratio，RR)为2.10(95％CI：1.06 4.17，p＝0.006)。

进一步分析基线Anti-HBc在不同ALT水平的病人中预测治疗后 HBeAg血清学转换的作用，结果如图8E所示，在两个队列中无论在基线 ALT水平≤5×ULN或＞5×ULN的病人亚组中，基线Anti-HBc水平高的 病人治疗后血清转换的发生率均高于基线Anti-HBc水平低的亚组。将 接受阿德福韦酯和长效干扰素治疗的病人进行合并分析，并按照病人基 线Anti-HBc水平分为高(≥29000IU/mL)、中(9000-29000IU/mL)、 低(＜9000IU/mL)三组，分析三组病人治疗后HBeAg血清学转换率， 如图9所示。在基线Anti-HBc水平≥29000IU/mL的病人中，接受阿德 福韦酯治疗的16例病人治疗后有9例发生HBeAg血清学转换，应答率 为43.8％，这一比例在接受长效干扰素治疗的15例病人中为66.7％ (10/15)，两者间无统计学显著的差异(p＝0.82)；对基线Anti-HBc 水平在9000-29000IU/mL的病人，接受阿德福韦酯治疗的19例病人治 疗后仅有2例发生HBeAg血清学转换，应答率为10.5％，而这一比例在 接受长效干扰素治疗的10例病人中为60.0％(6/10)，两者间具有统计 学显著的差异(p＝0.018)；对基线Anti-HBc水平＜9000IU/mL的病人， 接受阿德福韦酯治疗的16例病人治疗后无HBeAg血清学转换发生，而 23例接受长效干扰素治疗的病人中尚有7例发生HBeAg血清学转换 (30.4％)，两者间具有统计学显著的差异(p＜0.001)。

6.9阿德福韦酯治疗过程中及停药后病人Anti-HBc水平的动态变化

依据阿德福韦酯治疗病人在治疗过程中及停药后血清Anti-HBc的 动态变化(图10A)，可将整个治疗及观察过程分为三个阶段：(1)基 线至治疗后60周，在这个阶段，病人血清Anti-HBc平均水平随治疗的 延续呈线性下降(r＝0.99，p＜0.001)，每12周下降0.20±0.05log₁₀IU/mL；(2)治疗后60周至治疗终点(96周)，病人血清Anti-HBc 平均水平到达平台期，不再随治疗的延续而下降(p＝0.87)；(3)停 药后(108周)，病人血清Anti-HBc平均水平相比于治疗终点(96周) 有明显反弹，平均上升0.29log10IU/mL(p＜0.001)。总体上看，治 疗过程中Anti-HBc水平的下降较ALT水平、HBV DNA水平和HBsAg水平 下降的更缓慢，前者在治疗60周以后到达平台期，而后面三者治疗后 24周即达到平台期。多因素纵向分析显示，Anti-HBc水平与ALT水平 独立相关(β＝0.830，p＜0.001)，而与HBV DNA水平(β＝0.003，p＝0.94) 或HBsAg水平无统计显著的相关性(β＝-0.061，p＝0.52)。

依据本实施例6.7节划定的临床Cutoff值，将全部接受阿德福韦酯 治疗的病人划分为≥29000IU/mL(n＝16，HBc-High)和＜29000IU/mL (n＝33，HBc-Low)两组，比较两组病人在治疗过程中和停药后血清 Anti-HBc、HBV DNA、ALT、HBsAg水平的动态变化差异，结果显示如图 10B。HBc-High和HBc-Low两组病人治疗前HBV DNA水平(7.61±1.15vs. 7.50±1.22log₁₀copies/mL，p＝0.77)和HBsAg水平(4.34±0.31vs. 4.38±0.69log₁₀IU/mL，p＝0.83)无统计差异；而HBc-High组基线ALT 水平高于HBc-Low组，但差异尚不及统计学显著水平。在治疗过程中， 两组患者的ALT水平和Anti-HBc水平的下降曲线无论在每个监测点分析 或在纵向分析中均无显著差异，但是停药后，HBc-Low组的Anti-HBc向 比HBc-High组有明显反弹(p＝0.039)，ALT的情况也是如此，尽管尚不 及统计学显著水平(p＝0.09)。对HBV DNA水平来说，HBc-High组病人 无论在治疗过程中还是停药后(除基线外)血清HBV DNA水平均显著低 于(p＜0.05)HBc-Low组。在随访终点时，HBc-High组病人HBV DNA平 均水平比治疗前下降了3.48±2.24log₁₀copies/mL；而HBc-Low组病 人HBV DNA平均水平比治疗前下降了1.69±2.05log₁₀copies/mL (p＝0.008)。两组病人的HBsAg水平变化无明显差异。

参考文献

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