一种银纳米粒子的制备方法及其促进黄瓜种子萌发、幼苗生长发育的方法

技术领域

本发明属于纳米材料制备和性能研究技术领域，即银纳米粒子的制备方法及其促进黄瓜种子萌发、幼苗生长发育的方法。 

背景技术

在过去的近二十年间，纳米科学和纳米技术受到了广泛的关注并得到了飞速的发展。在各种各样的纳米材料中，银纳米粒子一直是一个研究热点。这是因为银纳米粒子不仅具有一般纳米粒子所具有的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等性质，作为贵金属的一员，它具有独特的光、电、催化性质，可广泛用作催化剂、电池电极、低温导热和导电材料等。另外，银纳米粒子还有一个非常受关注的特性就是具有强大的杀菌抑菌作用，普通的抗生素一般一种只能杀灭6种病原体，而银纳米粒子可以在数分钟内杀死650多种细菌，这是因为银纳米粒子可以直接进入菌体与氧代谢酶结合，使菌体窒息而死，也正因为这样一个独特的作用机制，使得银纳米粒子具有了广谱的抗菌性能。而且由于纳米银属于非抗菌素杀菌剂，使得细菌无法产生耐药性，能够有效避免因耐药性而导致的反复发作久治不愈。而且银纳米粒子的安全性是国际医学界公认的，因为微量银元素本来就是人体必须的重要元素之一，纳米银离子不带电荷，不会与人体内多种生物活性物质结合而沉积，在毛孔中吸附并杀灭细菌，并会从体内完全排出，不会产生毒副作用。我国的《本草纲目》中记载：生银，无毒。美国公共卫生局1990年《关于银毒性的调查报告》中说明：银对人体无明显毒副作用；纳米银是局部用药，银含量少，是最安全的用药方式。经试验考察发现小鼠在口服最大耐受量925mg/kg，即相当于临床使用剂量的4625倍时，无任何毒性反应，在兔的皮肤刺激实验中，也没有发现任何刺激反应。 另外，银纳米粒子还能够促进伤口的愈合、细胞的生长及受损细胞的修复。因此纳米银是最新一代的天然抗菌剂，各种纳米银产品已渗入到人们生活的方方面面，诸如净水滤材、抗菌涂料、卫生用品系列、抗菌纤维布系列、各类清洁剂系列、新型抗菌敷剂系列等等。 

近几年的研究表明，纳米材料不仅能够对动物（包括人类）的生命活动产生影响，对植物的生理活动也有明显的作用。纳米材料在农业领域的保鲜、肥料增效、动物遗传育种和饲料开发等已经开始应用。例如，美国阿肯色大学的研究人员将西红柿种子暴露在碳纳米管环境下，结果发现，这些种子发芽速度要比普通种子快一倍，而且刚出芽的幼苗重量也要比普通幼苗重很多。他们认为碳纳米管可以“穿透”种子坚硬的外壳，从而大大提高种子的吸水能力。再如，有研究表明纳米二氧化钛能够促进藏茵陈和油菜种子的萌发，碳纳米管还能够干旱胁迫下促进大豆种子的萌发和生长等。 

虽然人们倾注了大量的精力在银纳米粒子的性能研究上，但基本都停留在器件制备和抗菌应用领域，对植物的影响情况以及作用机理却没有人进行研究。另外，应用于生物领域的银纳米粒子的制备过程也必须是生物相容性的，以避免由于制备而引入有毒物质影响了银纳米粒子的应用。 

本发明提出了一种绿色、无毒制备生物相容性银纳米粒子的方法，该方法低耗环保，所得纳米粒子尺寸均匀，易于实现批量生产。将此法所得的银纳米粒子对植物的种子（模型种子为黄瓜）进行处理后，种子萌发速度明显高于对照组，而且幼苗也明显较对照组粗壮。虽然纳米技术在作物浸种中的应用已有一些研究，但有关银纳米对黄瓜种子萌发的影响尚未见相关报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种绿色、无毒、制备尺寸均匀、生物相容性良好的银纳米粒子的制备方法。 

本发明的另一目的是提供一种利用这些银纳米粒子促进黄瓜种子萌发、幼苗生长发育的方法。 

本发明的方案是：一种银纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤如下： 

取AgNO₃水溶液，加入聚乙烯吡咯烷酮，待聚乙烯吡咯烷酮完全溶解后加入与AgNO₃水溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液，当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明时，纳米粒子已经生成并且尺寸较小，离心处理，所得上层清液重新收集回初始反应容器，在离心管底部得到的沉淀储存于去离子水，获得Ag纳米粒子溶液。

具体是，纳米粒子的制备方法，其特征在于步骤如下： 

（1）温度15－25℃条件下，分别配置浓度为0.05－0.2 mol·L^-1的AgNO₃水溶液和浓度0.05－0.2 mol·L^-1的具有还原性的氨基酸水溶液。此浓度范围制备出来的Ag纳米粒子在20-30 nm，尺寸均匀，分散度较好，浓度再低或者再高都会使得纳米粒子的尺寸范围扩大，不够均匀。虽然还有其他还原剂，如硼氢化钠、水合肼等可以使用，但这些还原剂都不同程度的存在毒性，使得纳米粒子的生物相容性降低。具有还原性的氨基酸优选为α-氨基丙酸。而α-氨基丙酸是一种氨基酸，本身就是生物相容的，制备出来的纳米粒子也自然具有的良好的生物相容性，有利于进行与动植物相关的实验研究。所述的具有还原性的氨基酸是指α-氨基丙酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种。

（2）量取5－20 mL的AgNO₃水溶液（体积可根据实际需要量来确定，需要的多则多量取，工业化生产可以按比例扩大），加入0.05－0.2 g的聚乙烯吡咯烷酮（以下简称为PVP），聚乙烯吡咯烷酮的用量根据反应物的实际用量来确定），保证PVP浓度在5－20 mg·mL^-1范围内；一般0.001 mol的AgNO₃使用0.05-0.2 g的聚乙烯吡咯烷酮为宜；待聚乙烯吡咯烷酮在搅拌下完全溶解后，加入与AgNO₃水溶液等体积的具有还原性的氨基酸水溶液，停止搅拌让反应体系处于静置状态；PVP也是一种生物相容性的大分子，本发明中采用PVP来稳定Ag纳米粒子的目的是保证粒子的生物相容性，没有生物毒性。所述的具有还原性的氨基酸是指α-氨基丙酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种。 

（3）当反应体系的颜色逐渐变为褐色且光学透明时（具体所需时间与反应进行时所处的环境温度有关），纳米粒子已经生成并且尺寸较小，离心处理，所得上层清液重新收集回初始反应容器，在离心管底部得到的沉淀储存于去离子水中待用。 

（4）所收集的离心上层清液在放置过程中会继续反应并再次达到褐色且光学透明状态，然后采用与步骤（3）相同的方法再次实现纳米粒子与反应母液的分离；此步骤可以反复进行多次直至离心上层液不再有反应进行（变为褐色）为止。 

（5）将历次分离所得的分散到去离子水中的沉淀集中起来，并定容至反应初始时所采用的AgNO₃水溶液的体积，即可获得浓度为0.05－0.2 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液（此时Ag纳米粒子的浓度与所采用的AgNO₃水溶液的初始浓度相同）。 

所述的聚乙烯吡咯烷酮浓度为5－20 mg·mL^-1。PVP的浓度太低，起不到分散和稳定纳米粒子的作用，用量太多，一是达到饱和之后不能再溶解，二是整个体系的粘度上升，后期离心处理较为麻烦，另外采用过多的PVP也不会进一步影响纳米粒子的最终尺寸，反而造成浪费。 

所述的离心处理是在离心机10000 rpm条件下进行10分钟左右离心（如8－15分钟）。离心时间小于8分钟，不能够把全部的纳米粒子离心出来，超过15分钟便是对仪器和能源的浪费。另外，离心转数太低，不能实现纳米粒子的完全分离，太高也没有必要。 

通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400或500 μmol·L^-1的Ag纳米粒子溶液。 

银纳米粒子促进种子萌发的方法，其特征在于步骤如下： 

（1）选择饱满、大小均一的黄瓜种子用蒸馏水冲洗干净、吸水备用；将冲洗干净的黄瓜种子分组，用不同质量浓度的银纳米粒子溶液处理，于室温下浸泡12 h；其中用蒸馏水处理作为对照；每一处理设置三次重复。

（2）将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养，培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸，并洒上水浸湿滤纸，于恒温箱27±1℃下培养；每天观察记录种子的萌发情况，并拍照记录。 

（3）黄瓜种子培养24 h、48 h、72 h时，统计种子的发芽个数，测量芽的长度；以计算其发芽势、发芽率。 

结果表明，银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发。 

具体是，银纳米粒子促进种子萌发的方法，其特征在于： 

（1）选择饱满、大小均一的黄瓜种子300粒，用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干备用；将冲洗干净的黄瓜种子分为6组，每组50粒，分别放入6个培养皿中并编号，再用质量浓度分别为0、100、200、300、400、500 μmol/L的银纳米粒子溶液处理，于室温下浸泡12 h；其中用蒸馏水处理作为对照；每一处理设置三次重复。

（2）将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养，培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸，并洒上水浸湿滤纸，于恒温箱27±1℃下培养；每天观察记录种子的萌发情况，并拍照记录。 

（3）黄瓜种子培养24 h、48 h、72 h时，统计种子的发芽个数，测量芽的长度；以计算其发芽势、发芽率。 

结果表明，银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发，并在银纳米粒子溶液浓度为300 μmol/L处理条件下，黄瓜种子的发芽势及发芽率最好。 

银纳米粒子促进种子萌发的方法过程中物质代谢变化影响的检测方法，其特征在于步骤如下： 

（1）银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中含水量的检测： 从各组中各取出20粒萌发后的种子，称鲜重W1，然后将其分别放在鼓风干燥箱中烘干再称重W2；

或（2）银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中蛋白质含量的检测： 取萌发种子0.2 g，用5 mL蒸馏水冰浴研磨成匀浆，移入离心管中，4℃下12000 rpm离心15 min，所得上清液即为可溶性蛋白液，取蛋白提取液1.0 mL，放入具塞试管中，每个样品重复两次，加入5 mL G-250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸光度，通过标准曲线查得蛋白质含量。

或（3）银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中过氧化物酶（POD）酶活性的检测： 取萌发种子0.5 g，用10 mL lmol.L^-1，pH8.0 Tris冰浴研磨成匀浆，移入离心管中，于超低温离心机中4℃下1500 rpm离心15 min，所得上清液即为酶提取液，取酶提取液1.0 mL，放入具塞试管中，每个样品重复两次，加入2 mL联苯胺醋酸－醋酸钠缓冲液，再置于28－32℃，水浴中保温3－5 min；测定时，加入l mL 0.1mol. L^-1H₂O₂，立即摇匀，并转入比色杯中，在470 nm下比色，测定吸光度，从加入H₂O₂时起计时，每15s读数一次，，计算酶活性。 

或（4）银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中可溶性总糖含量的检测： 

可溶性总糖的提取：取萌发种子0.5 g,加入5－10 mL蒸馏水，充分研磨，转入刻度试管中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，共2次，提取液过滤入25 mL容量瓶，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。

可溶性总糖的测定：取0.5 mL样品液于试管中，重复2次，加蒸馏水1.5 mL，向试管中加1 mL 9%苯酚溶液，摇匀，加入5 mL浓硫酸，比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30 min；显色，在485 nm波长比色测定。 

或（5）银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中总淀粉酶及α-淀粉酶活力的检测：采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS)。提取方法同步骤（3）中过氧化物酶；精确吸取步骤（3）提取酶液10 mL至两支干净的试管中，于40℃水浴中提取l h，其间不断的搅动，保温结束后，过滤于25 mL试管中，并用40℃温水淋洗滤渣，冷却后定容至刻度，于70℃恒温水浴中保温15 min，以钝化p-淀粉酶，获得α-淀粉酶粗提液；酶液贮存于4℃下备用。 

精确吸取2 mL酶液至干净试管中，将一支立即放入沸水浴中煮沸15 min，冷却到室温作为对照处理；然后向其他试管分别加入l ml 1%可溶性淀粉溶液，摇匀，于37℃恒温水浴中保温20 min;保温结束后，立即将两支试管转入沸水浴中煮15 min，停止反应；分别从各试管中取出l mL淀粉酶水解液，移入相应编号的空试管中，加2 mL DNS试剂，沸水浴中反应5 min，冷却，加蒸馏水7 mL，以先经水浴反应15 min的处理为对照，在520 nm处测定吸光值。 

与已有技术相比本发明具有如下优点： 

1. 采用了氨基丙酸作为还原剂制备银纳米粒子。由于氨基丙酸是一种氨基酸，本身就是一种生物分子，因此具有良好的生物相容性。另外在制备过程中氨基丙酸的还原速率较之于常用的硼氢化钠等强还原剂更为温和，容易实现分阶段控制。

2. 采用了PVP作为分散剂防止纳米粒子的聚集。PVP本身也是一种生物相容性良好的高聚物，经常被应用到护肤品甚至是食品当中。 

3. 整个制备对反应条件要求不高，也不需要特殊的仪器设备，因此更易于实现规模化生产。 

4. 考察银纳米粒子对种子萌发和植物生长的影响的研究工作尚属首次，对研究银纳米粒子在植物学应用方面具有一定的指导意义。 

5. 实验结果表明用银纳米粒子处理过的种子相对于对照组来说更容易萌发，植株更加粗壮，根系更加发达，特别值得一提的是抗虫害能力增强，说明本发明所提供的纳米粒子有望应用到农业生产中。 

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。 

具体实施方式

实施例1 

（1）在环境温度15℃条件下，量取20 mL，0.1 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.2 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.1 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置10分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（3）第一次离心分离所得的上层液静置30分钟左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（4）第二次离心分离所得的上层液静置1小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（5）第三次离心分离所得的上层液静置12小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（6）第四次次离心分离所得的上层液静置72小时左右使之完全反应，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（7）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液，在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。 

（8）选择饱满、大小均一的黄瓜种子300粒，用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干备用。将冲洗干净的黄瓜种子分为6组，每组50粒，分别放入6个培养皿中并编号，再用浓度分别为0、100、200、300、400、500 μmol/L的银纳米粒子溶液处理，于室温下浸泡12 h。其中用蒸馏水处理作为对照。每一处理设置三次重复。 

（9）将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养，培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸，并洒上适量的水(以浸湿滤纸宜)，于恒温箱27±1℃下培养。培养期间检查培养皿中的水份是否充足，给予一定的补充。每天观察记录种子的萌发情况，并拍照记录。 

（10）黄瓜种子培养24 h、48 h、72 h时，统计种子的发芽个数（以突破种皮为准），测量芽的长度。以计算其发芽势、发芽率，结果表明，银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发，并在300 μmol/L处理条件下，黄瓜种子的发芽势及发芽率最好（较好）。 

（11）分别取以清水及最佳浓度（300μmol/L）的银纳米粒子水溶液处理的萌发后的黄瓜种子，播种于营养钵内，每个营养钵播3粒种子，定期观察幼苗生长情况，待黄瓜长出4片真叶时，采用卷尺测量黄瓜的株高，用游标卡尺测量黄瓜茎粗；用硫酸纸称重法测量黄瓜叶面积，采用烘干法测量黄瓜叶片相对含水量和植株的干物质含量。 

本例中α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 

实施例2 

（1）在环境温度15℃条件下，量取20 mL，0.1 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.1 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.1 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置10分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（3）第一次离心分离所得的上层液静置30分钟左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（4）第二次离心分离所得的上层液静置1小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（5）第三次离心分离所得的上层液静置12小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（6）第四次次离心分离所得的上层液静置72小时左右使之完全反应，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（7）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液，在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。 

（8）选择饱满、大小均一的黄瓜种子300粒，用蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干备用。将冲洗干净的黄瓜种子分为6组，每组50粒，分别放入6个培养皿中并编号，再用浓度分别为0、100、200、300、400、500 μmol/L的银纳米粒子溶液处理，于室温下浸泡12 h。其中用蒸馏水处理作为对照。每一处理设置三次重复。上述α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 

（9）将浸泡好的黄瓜种子置于培养皿中培养，培养皿底部依次铺上脱脂棉和滤纸，并洒上适量的水(以浸湿滤纸宜)，于恒温箱27±1℃下培养。培养期间检查培养皿中的水份是否充足，给予一定的补充。每天观察记录种子的萌发情况，并拍照记录。 

（10）黄瓜种子培养24 h、48 h、72 h时，统计种子的发芽个数（以突破种皮为准），测量芽的长度。以计算其发芽势、发芽率，结果表明，银纳米粒子处理可以促进黄瓜种子的萌发，并在300 μmol/L处理条件下，黄瓜种子的发芽势及发芽率最好。 

（11）从各组中各取出20粒萌发后的种子，称鲜重W1，然后将其分别放在鼓风干燥箱中烘干再称重W2，然后计算出银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中含水量的影响。 

（12）取萌发种子0.2 g，用5 mL蒸馏水冰浴研磨成匀浆，移入离心管中，4℃下12000 rpm离心15 min，所得上清液即为可溶性蛋白液，取蛋白提取液1.0 mL，放入具塞试管中(每个样品重复两次)，加入5 mL G-250溶液，充分混合，放置2 min后在595 nm下比色，测定吸光度，通过标准曲线查得蛋白质含量，获得银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中蛋白质含量的影响数据。 

（13）取萌发种子0.5 g，用10 mL lmol.L^-1，pH8.0 Tris冰浴研磨成匀浆，移入离心管中，于超低温离心机中4℃下1500 rpm离心15 min，所得上清液即为酶提取液。取酶提取液1.0 mL，放入具塞试管中(每个样品重复两次)，加入2 mL联苯胺醋酸一醋酸钠缓冲液，再置于28-32℃，水浴中保温3-5 min。测定时，加入l mL 0.1mol. L^-1H₂O₂，立即摇匀，并转入比色杯中，在470 nm下比色，测定吸光度(从加入H₂O₂时起计时，每15s读数一次)，计算酶活性。获得银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中过氧化物酶（POD）酶活性的影响数据。 

（14）取萌发种子0.5 g,加入5-10 mL蒸馏水，充分研磨，转入刻度试管中，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，共2次，提取液过滤入25 mL容量瓶，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。 

取0.5 mL上述样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5 mL，向试管中加1 mL 9%苯酚溶液，摇匀，加入5 mL浓硫酸，比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30 min。显色，在485 nm波长比色测定。从而测定银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中可溶性总糖含量的影响。 

（15）采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS)。提取方法同过氧化物酶。精确吸取步骤（3）提取酶液10 mL至两支干净的试管中，于40℃水浴中提取l h，，其间不断的搅动，保温结束后，过滤于25 mL试管中，并用40℃温水淋洗滤渣，冷却后定容至刻度，于70℃恒温水浴中保温15 min，以钝化p-淀粉酶，获得α-淀粉酶粗提液。酶液贮存于4℃下备用。 

精确吸取2 mL酶液至干净试管中，将一支立即放入沸水浴中煮沸15 min，冷却到室温作为对照处理。然后向其他试管分别加入l ml 1%可溶性淀粉溶液，摇匀，于37℃恒温水浴中保温20 min;保温结束后，立即将两支试管转入沸水浴中煮15 min，停止反应。分别从各试管中取出l mL淀粉酶水解液，移入相应编号的空试管中，加2 mL DNS试剂，沸水浴中反应5 min，冷却，加蒸馏水7 mL，以先经水浴反应15 min的处理为对照，在520 nm处测定吸光值。得到银纳米粒子处理对黄瓜种子萌发过程中总淀粉酶及α-淀粉酶活力的影响数据。 

实施例3 

（1）在环境温度25℃条件下，量取20 mL，0.1 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.2 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.1 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置5分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（3）第一次离心分离所得的上层液静置15分钟左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（4）第二次离心分离所得的上层液静置0.5小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（5）第三次离心分离所得的上层液静置6小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（6）第四次次离心分离所得的上层液静置36小时左右使之完全反应，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（7）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液。在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。 

步骤（7）-（10）同实施例1（7）-（10）。上述α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 

实施例4 

（1）在环境温度25℃条件下，量取20 mL，0.1 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.1 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.1 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置5分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（3）第一次离心分离所得的上层液静置15分钟左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（4）第二次离心分离所得的上层液静置0.5小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（5）第三次离心分离所得的上层液静置6小时左右再次转化为深褐色光学透明溶液，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（6）第四次次离心分离所得的上层液静置36小时左右使之完全反应，采用与步骤（2）相同的步骤再次进行分离并再次获得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

（7）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液。在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。上述α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 

步骤（7）-（14）同实施例1（7）-（14）。 

实施例5 

（1）在环境温度15℃条件下，量取20 mL，0.2 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.4 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.2 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置10分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

步骤（3）—（5）与实施例1中步骤（3）—（5）相同。 

（6）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液。在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。 

步骤（7）-（10）同实施例1（7）-（10）。上述α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。 

实施例6 

（1）在环境温度15℃条件下，量取20 mL，0.1 mol·L^-1的AgNO₃水溶液，在搅拌状态下加入0.4 g PVP粉末并继续搅拌至完全溶解。量取20 mL，0.1 mol·L^-1的α-氨基丙酸水溶液在搅拌下加入以上溶液，然后停止搅拌，静置反应体系。

（2）静置10分钟后，反应体系逐渐转变为深褐色光学透明溶液，说明此时已经有小尺寸的纳米粒子形成。立刻将此溶液用高速离心机在1000rpm/min的转速下离心分离10分钟，将浅黄色的上层液倒回反应容器，在离心管底部可得尺寸在20纳米左右的银纳米粒子。 

步骤（3）—（5）与实施例1中步骤（3）—（5）相同。 

（6）将历次分离所得的沉淀分散到20 mL的去离子水中即可获得浓度为0.1 mol·L^-1的Ag纳米粒子溶液。在此基础上可通过稀释获得浓度分别为100、200、300、400、500 μmol/L的Ag纳米粒子溶液。 

步骤（7）-（14）同实施例1（7）-（14）。上述α-氨基丙酸可用组氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸中的任一种代替。