改善精子运动能力的人精子体外培养液及其应用

技术领域

本发明涉及一种培养液，具体涉及一种改善体外培养精子运动能力的培养液及其应用。

背景技术

目前，不孕不育率约占到育龄夫妇的十分之一，其中男性因素不育约占一半，但是不育男性中超过85%均能够产生精子。男性不育临床上的一种重要表现是弱精子症，即精子运动能力低下，导致男性不育，提高精子的运动能力是治疗该类型男性不育的一种重要方法。这也说明精子的运动能力在精子正常功能中的重要性。

治疗不孕不育有多种辅助生殖手段，如人工授精(IUI)、体外受精—胚胎移植(IVF)和卵浆内单精子注射（ICSI）等，这些技术均涉及到精子的体外培养和操作，在体外培养和操作的过程中，维持甚至提高精子的功能对于提高辅助生殖的成功率有着重要的作用。

正常精子存在于精浆中，能量的主要来源是果糖。临床使用的培养液如BWW、HTF等使用葡萄糖作为能量来源。这两种类型的单糖在精子中被利用时均需转变成果糖6-磷酸（fructose 6-phosphate，F6P），最终代谢转换成ATP，为精子的运动提供能量。

在体外进行精液处理过程中，精子脱离了体内环境，处于人工配制的培养液中。除了需要合适的培养液pH和渗透压，精子的运动需要消耗大量的能量。高质量的精子培养液在生殖医学领域内有广泛而且重要的用途，尤其是随着辅助生育技术在临床上的开展，更是受到了足够的重视。如在人工授精时，具有良好运动能力的精子能迅速上游至输卵管与卵子受精；在体外受精时运动能力良好的精子具有穿透卵子的卵丘和透明带的足够动力，顺利进入卵质中完成受精。对于临床上常见的有运动能力异常精子，改善精子活力具有非常重要的治疗意义。所以制备能改善精子功能的精子培养液一直是生殖医学工作者的研究重点之一。传统的用于体外处理精子的培养液主要有Ham’s F10， Tyrode’s， BWW，Whitten’s等培养液，这些培养液的优点是经过长期临床应用证明对精子无毒性并对精子有一定的保护作用和营养作用。基本能满足临床上开展辅助生育技术中体外处理精子的应用。但显著的缺点是于精子运动能力的改善不够，人工授精的成功率一直不高 (约徘徊在10 %左右 )可能也与此有关。因此，开发一种能显著改善精子运动能力的精子培养液具有非常重要的临床意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种改善体外培养精子活动能力的培养液及其应用方法，对不同运动能力的人类精子培养结果表明，精子的运动能力均有显著的提高。

技术方案：改善人精子运动能力的体外培养液，含有果糖6-磷酸。

上述每升培养液含有以下组分：5.5-6.0g NaCl、2.0-2.5g NaHCO?、0.3-0.4g KCl、0.04-0.06g MgSO₄^.7(H₂O)、0.04-0.06g KH₂PO₄、0.035-0.04g丙酮酸钠、3.8-4.0g乳酸钠、0.28-0.35g CaCl₂^.2(H₂O)、0.5-1g F6P。

改善人精子运动能力的体外培养液的应用，培养时间在1-2h。所用精子为离体之后去除精浆的人精子。

有益效果：

1、本发明改善人精子运动能力的体外培养液，在精子培养液的成分中使用F6P，对离体后纯化的人精子进行培养，除了维持精子运动还能显著提高人精子的活力，为改进辅助生育技术提供了有意义的参考。

2、本发明中的F6P是直接用培养液稀释和培养的，不涉及乙醇或者DMSO等有机溶剂，避免了乙醇或者DMSO对精子的毒害作用。

3、本发明中，精子培养液中加入的F6P，能够显著提高临床弱精子症患者精子的活力，在重度弱精子症时活力改善程度最为明显，并且使部分培养的精子活力达到正常精子活力范围，其中对重度弱精子症改善程度最为明显。这充分说明F6P的使用具有改善弱精症患者精子运动能力低下的作用。

附图说明

图1 HTF-F6P培养液对不同运动能力的精子活力的作用图；

图示说明： X-轴是在不同培养液中精子培养时间，Y-轴是指精子活力（Motility = A + B，以百分比计数）。图A表示重度弱精子培养后精子活力的统计，图B表示中轻度弱精子症精子培养后活力数据的统计，图C表示正常活力精子培养后活力数据的统计。图中数据以均值±标准误差显示。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品，例如，实验中所使用的F6P可从SIGMA-ALDRICH，MO，USA 购买。

实施例1

1.样品准备

选择重度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的精液，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA），对精子参数（体积，精子计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。弱精子症被定义为A级精子数目<25％或A+B级精子数目<50％，（世界卫生组织，1999年），而所有其他参数都是正常。根据形态学观察排除含白细胞或者体细胞污染的标本。重度弱精子症精子的运动参数为(a+ b)级<25%，其中a级精子<5%。

2.精子体外培养

1）密度梯度离心从精液当中分选精子。

在试管内放置1mL 60%（v/v）的Percoll分离液，在其上铺上1mL-1.5mL的精液，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬精子悬液于2mL的HTF-S培养液（商业化HTF培养液，简称HTF-S），300g离心力离心5-10分钟，重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到的各种精子培养液中。

2）精子培养

合适数量的精子（5×10⁶左右）转移到各种精子培养液中之后，置于37℃，5% CO₂的培养箱中1-2小时。

所用的精子培养液为：商业化的HTF-S培养液和HTF-F6P培养液（配方见表1）。下同。

表1. HTF-F6P培养液配方

3.精子活动力的检测

根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA），对精子活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的精子数目不小于500个。

实施例2

1.样品准备

选择中轻度弱精子症患者的精子样本进行实验。手淫法排精，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的精液，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc. Beverly， MA， USA），对精子参数（体积，精子计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。根据1999年世界卫生组织的标准，中轻度弱精子症的精子运动参数为25%<(a+b)级<50%且a级精子<25%。

2.精子体外培养

1）密度梯度离心从精液当中分选精子。

在试管内放置1mL 60%（v/v）的Percoll分离液，在其上铺上1mL-1.5mL的精液，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬精子悬液于2mL的HTF-S培养液，300g离心力离心5-10分钟，重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到的各种精子培养液中。

2）精子培养

合适数量的精子（5×10⁶左右）转移到各种精子培养液中之后，置于37℃，5% CO₂的培养箱中1-2小时。

所用的精子培养液为：商业化的HTF-S培养液和HTF-F6P培养液（配方见表1）。下同。

3.精子活动力的检测

根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA），对精子活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的精子数目不小于500个。

实施例3

1.样品准备

选择健康男性的精子捐赠者的精子样本进行实验。手淫法排精，用特定的无菌容器收集禁欲2-7天的精子样本。将样品水浴保持22-37℃，液化后的精液，根据WHO1999年的评价标准，使用电脑辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA），对精子参数（体积，精子计数，活力和运动特性的百分比）进行评估。

2.精子体外培养

1）密度梯度离心从精液中分选精子。

在试管内放置1mL 60%（v/v）的Percoll分离液，在其上缓慢铺上1mL-1.5mL的精液，300g的离心力下离心5-10分钟，弃去上清液。重悬精子悬液于2mL的HTF-S培养液，300g离心力离心5-10分钟，重复该步骤一次。将精子悬液轻轻转移到实验所用到的各种精子培养液中。

2）精子培养

合适数量（5×10⁶左右）的精子转移到各种精子培养液中之后，置于37℃，5% CO₂的培养箱中1-2小时。

所用的精子培养液为：商业化的HTF-S培养液，HTF-F6P培养液（配方见表1）。

3.精子活动力的检测

根据WHO1999年的评价标准，使用计算机辅助精液分析仪CASA（IVOS; Hamilton-Thorn Research， Inc.Beverly， MA， USA），对精子活力进行评估。对于每个标本，选取6-10个视野，计数到的精子数目不小于500个。

实验结果表明：体外培养的精子在HTF-S培养液中培养1小时和2小时之后，活动力均没有产生显著性变化。重度弱精子症精子在HTF-F6P培养液中培养1小时之后之间活力升高有统计学差异(P<0.05)。中轻度弱精子症精子与正常精子在HTF-F6P培养1小时后活力升高无统计学差异。三种类型的精子在HTF-F6P培养液中培养2小时后精子活力与培养前相比均有明显升高。其中重度弱精子症精子活力培养后从13.25±2.96%(均值±标准误)上升至30.00±6.17%(P<0.001)，升高达到培养前的2.26倍；中轻度弱精子症精子活力培养后从34.19±1.68(均值±标准误)上升至48.31±3.40(P<0.001)，升高达到培养前的1.41倍；而正常精子活力从培养前54.88±1.27上升至63.38±2.03（P<0.001），详细实验数据见图1。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改活改进，均属本发明要求保护的内容。