芽孢杆菌属的砂纸突变体及其用于增进植物生长、促进植物健康及控制疾病和害虫的方法

技术领域

本发明涉及细菌突变株及其增进植物生长、促进植物健康及控制植物疾病和害虫的能力的领域。

现有技术

芽孢杆菌属（Bacillus）包含多种形成内孢子的细菌，这些细菌在农业及动物营养领域（和其它领域）具有无数用途。芽孢杆菌的数种菌株目前被市场销售用作为植物生长促进剂和/或对昆虫害虫和疾病的生物控制剂（见例如Masaaki Morikawa,“Beneficial BiofilmFormation by Industrial Bacteria Bacillus subtilis and RelatedSpecies,”Journal of Bioscience and Bioengineering（2006）101（1）:1-8、Kloepper,et al.,“Induced Systemic Resistanceand Promotion of Plant Growth by Bacillus spp.,”Phytopathology（2004）94（11）:1259-1266）。这些有机、环境友善的替代物已被农业及园艺业界广泛接受，因为它们能有效地作为植物生长促进剂及作为生物农药。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是革兰氏阳性土壤细菌，其通常见于植物根际。枯草芽孢杆菌类似许多细菌菌种，可呈现二种不同的生长模式，即自由游动的浮游性生长模式，和固着性的生物膜模式，其中细胞聚集体分泌胞外基质以彼此附着和/或附着至表面（Branda,et al.,“Fruiting Body Formation by Bacillussubtilis,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA（2001）98:11621-11626;Hamon and Lazazzera,“The Sporulation Transcription FactorSpo0A is Required for Biofilm Development in Bacillussubtilis,”Mol.Microbiol.（2001）52:847-860）。细菌诸如枯草芽孢杆菌用于建立生物膜的途径极其不同，其在不同的菌种之间及不同的环境条件下差异极大（Bais,et al.,“Biocontrol ofBacillus subtilis Against Infection of ArabidopsisRoots byPseudomonas syringae is Facilitated by Biofilm Formation andSurfactin Production,”Plant Physiol.（2004）134:307-319;Lemonet al.,“Biofilm Development with an Emphasis on Bacillussubtilis,”（2008）Current Topics in Microbiology and Immunology（2008）322:1-16）。最近多少发现，由枯草芽孢杆菌的特定菌株及相关菌种所形成的生物膜可能有助于控制植物病原体引起的感染（Morikawa（2006），同上）。

生物膜的形态及化学组成随着菌种及菌株而异。发生在野生型枯草芽孢杆菌株的粘液型菌落形态及γ聚谷氨酸的生产已被发现与增强的生物膜形成有关，然而发生在培养型（或实验室）菌株的扁平、干燥的菌落形态与减少的生物膜形成有关。见Stanley,N.andLazazzera,B.“Defining the Genetic Differences Between Wildand Domestic Strains of Bacillus subtilis that AffectPoly-γ-DL-GlutamicAcid Production and Biofilm Formation,”Molecular Microbiology（2005）57（4）:1143-1158的1145页。布兰达（Branda）的文献（同上，2001）描述缺乏生物膜的非粘液型菌落形态，诸如扁平、小型、干燥的菌落，这些菌落向侧边生长最后彼此融合，导致缺乏气生结构（aerial structures）的小型菌落。然而史丹利（Stanley）的文献描述一种在swrA基因座具有功能丧失性突变的枯草芽孢杆菌杂合株，该菌株形成扁平、干燥的菌落且显示增强的生物膜形成。（该杂合株是培养株与源自野生株的负责粘液型菌落形态的DNA的中板集合制成的组合（a congression-madecombination））。申请人发现在swrA基因座具有功能减弱或丧失性突变的野生型芽孢杆菌菌株产生扁平、干燥的菌落，其形成坚固的生物膜，另外由这种细胞组成的所形成的发酵产物增进植物健康，相较于含有野生型swrA基因的菌株导致更坚固的根部定殖，并控制植物疾病和害虫诸如线虫。

经济农业及家庭园艺均可得益于不同及改善来源的芽孢杆菌菌株的使用，以增进植物生长、促进植物健康、控制植物害虫和疾病、及提供化学杀线虫剂的替代物品。本发明提供这种细菌菌株的新类型并通过操控生物膜的形成以改善它们的使用方法。

发明内容

本发明提供包含产芽孢细菌变体的组合物，其中相较于含有野生型swrA基因的菌株，该变体在swrA基因处具有造成损害群聚能力及增进植物健康促进的突变，该突变亦可能引起下列特征：由扁平、干燥、高度致密且非常粗糙的细胞或菌落组成的砂纸细胞或菌落形态；更坚固的根部定殖；和/或在早期指数期期间在液体培养物中形成长链细胞。该突变在此处被称为swrA突变，具有这种swrA突变的细胞被称为swrA^-细胞。

在这种产芽孢细菌变体的组合物中，swrA^-细胞占该组合物的总细胞的至少约3.5％，且至少70％的所述swrA^-细胞是孢子。本发明还提供这种组合物，其中所述swrA^-细胞占该组合物的总细胞的至少10％，或占该组合物的总细胞的至少50％，或占该组合物的总细胞的100％。本发明还提供这种组合物，其中在组合物中至少约80％、至少约85％、或至少约90％的swrA^-细胞和/或总细胞是孢子。

在一些实施形式中，所述产芽孢细菌来自芽孢杆菌属。在其它实施形式中，这些细菌来自枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种（见图6）。在另一些其它实施形式中，所述菌种选自短小芽孢杆菌（B.pumilus）、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）或地衣芽孢杆菌（B.Licheniformis）。在另一些其它实施形式中，所述芽孢杆菌菌种是枯草芽孢杆菌QST713。

本发明提供包含swrA^-细胞的组合物，其中丧失swrA功能可为任何扰乱、干扰、或以其它方式不利影响其功能的突变的结果。这种突变的实例包括但不限于在swrA的起始密码子中的至少一个核酸碱基对改变、和/或swrA中的至少一个核酸碱基对删除、和/或swrA中的至少一个核酸碱基对插入、和/或扰乱swrA启动子或swrA的其它控制元件、和/或任何其它造成失去swrA功能的基因或基因类型的事件（例如转座子、过表达、显性失活突变体、RNAi、反义、基因敲除、基因敲入等）。

本发明涉及使用包含在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞的组合物，其中相较于不具有所述突变的等基因细菌细胞，该突变减弱所述细菌细胞的群聚能力。在一实施形式中，所述群聚能力通过在非液体表面上的生长来测量。

所述在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞可以来自枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种。在一实施形式中，所述产芽孢细菌细胞是野生型。在另一实施形式中，所述芽孢杆菌菌种选自短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

所述在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞相较于不具有所述突变的等基因细菌细胞具有多项特征，包括下列的至少一项：（i）形成更坚固的生物膜、（ii）更平、更干及更厚的生物膜、及（iii）在液体培养物中应对剪切力（产生高涡流环境）形成长链。

在其它实施形式中，所述更坚固的生物膜相较于不具有所述突变的等基因细胞还包含下列特征的一项或多项：（i）具有至少约1.5倍的较大直径的营养细胞、（ii）具有额外的细胞衣的细胞、（iii）当以透射电子显微镜观察时可见大型白色（电子透明）区域、（iv）出现如图12、13或14所示的AQ30002的生物膜、及（v）在液体培养物中形成长链的细胞。

在一实施形式中，所述swrA同源基因与包含该突变的细菌细胞相同的芽孢杆菌菌种的swrA野生型基因具有至少约90％的同一性。在另一实施形式中，所述swrA同源基因与具有所述突变的细菌细胞相同的芽孢杆菌菌种的swrA野生型基因具有至少约95％的同一性、至少约96％的同一性、至少约97％的同一性、至少约98％的同一性、或至少约99％的同一性。在另一实施形式中，与swrA同源基因具有至少约99％的序列同一性的野生型swrA基因来自与具有所述突变的细菌细胞相同的菌株。在又另一实施形式中，所述swrA同源基因与如SEQ ID NO:1及5至10所提供的swrA核苷酸序列中的任一个具有至少约90％的同一性。

在另一实施形式中，所述swrA同源基因中的突变位于对应如SEQID NO:1所示的swrA基因的位置26至34的一或多处的位置或位于对应如SEQ ID NO:1所示的swrA基因的位置1至3的一或多处的位置。在一变化形式中，所述突变为插入或删除。

在一实施形式中，上述的产芽孢细菌细胞的组合物占该组合物中总细菌细胞的至少3.5％的，和/或该组合物中至少约70％的产芽孢细菌细胞是孢子。

在另一实施形式中，本发明包括含有产芽孢细菌的swrA^-细胞的组合物，其中所述swrA^-细胞占该组合物中总细菌细胞的至少3.5％，和/或其中至少约70％的产芽孢细菌细胞是孢子。在一些实施形式中，swrA活性已通过该swrA基因的突变以外的方式被减弱。swrA活性可通过各种试剂减弱，所述试剂包括小分子、药物、化学品、化合物、siRNA、核酶、反义寡核苷酸、swrA抑制抗体、swrA抑制肽、适体或镜像适体。在一实施形式中，所述swrA^-细胞中的swrA基因的突变位于对应如SEQ ID NO:1所示的swrA基因的位置26至34的一或多处的位置或位于对应如SEQ ID NO:1所示的swrA基因的位置1至3的一或多处的位置。在一变化形式中，所述突变为插入或删除。在另一方面中，swrA^-细胞是所述swrA基因的基因敲除的结果。

在一实施形式中，本发明的产芽孢细菌细胞是在swrA基因处具有突变的枯草芽孢杆菌QST713细菌细胞及其组合物。在一方面中，所述枯草芽孢杆菌QST713细菌细胞包含在起始密码子中至少一个核酸碱基对的改变和/或在swrA基因中至少一个核酸碱基对的插入或删除。在其它方面中，在swrA基因中的插入或删除发生在SEQ ID NO:1的位置26至34的一个或多个碱基对。在另一方面中，所述枯草芽孢杆菌QST713的swrA^-细胞选自分别为保藏编号NRRL B-50421和NRRLB-50455的菌株AQ30002（aka QST30002）和菌株AQ30004（akaQST30004）。在本发明的又一方面中，所述具有swrA基因突变的枯草芽孢杆菌QST713是野生型epsC、sfp及degQ。在另一方面中，具有所述突变的枯草芽孢杆菌QST713除了所述突变以外与枯草芽孢杆菌QST713为等基因细胞。在一些实施形式中，所述组合物中具有所述突变的枯草芽孢杆菌QST713细胞占该组合物中总细菌细胞的至少约3.5％。

本发明提供包含一或多种枯草芽孢杆菌菌株的组合物，该枯草芽孢杆菌菌株选自分别为保藏编号NRRL B-50421和NRRL B-50455的菌株AQ30002（aka QST30002）和菌株AQ30004（aka QST30004）。

在一实施形式中，在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞来自枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种且包含野生型sfp同源基因。在另一实施形式中，这些细菌细胞还包含野生型degQ同源基因及野生型epsC同源基因。在一方面中，所述sfp同源基因、degQ同源基因及epsC同源基因分别各与来自下列细菌中任一个的sfp基因、degQ基因及epsC基因具有至少约90％的序列同一性：短小芽孢杆菌（B.pumilus）、萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、地衣芽孢杆菌（B.Licheniformis）、嗜气芽孢杆菌（B.aerophilus）、同温层芽孢杆菌（B.stratosphericus）、沙福芽孢杆菌（B.safensis）、高海拔芽孢杆菌（B.altitudinus）、死谷芽孢杆菌（B.vallismortis）、耐盐芽孢杆菌（B.halotolerans）、莫海威芽孢杆菌（B.mojavensis）、索诺拉沙漠芽孢杆菌（B.sonorensis）、或空气芽孢杆菌（B.aerius）。在另一方面中，所述至少约90％的序列同一性是相对于枯草芽孢杆菌（B.subtilis）菌株3610、解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）菌株FZB42、短小芽孢杆菌（B.pumilus）SAFR-032、地衣芽孢杆菌（B.Licheniformis）菌株14580或萎缩芽孢杆菌（B.atrophaeus）菌株1942中任一个的sfp基因、degQ基因及epsC基因。在又一方面中，所述sfp同源基因与SEQ IDNO:11具有至少约90％的序列同一性，所述epsC同源基因与SEQ IDNO:12具有至少约90％的序列同一性，及所述degQ同源基因与SEQ IDNO:13具有至少约90％的序列同一性。在另一方面中，此段所描述的序列同一性是至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

本发明进一步提供还包含配制惰性剂或其它配制成分的本发明的任何产芽孢细菌或组合物，所述配制惰性或其它配制成分诸如多糖（淀粉、麦芽糊精、甲基纤维素）、蛋白质（诸如乳清蛋白、肽、胶）、糖类（乳糖、海藻糖、蔗糖）、脂肪（卵磷脂、植物油、矿物油）、盐类（氯化钠、碳酸钙、柠檬酸钠）、及硅酸盐（粘土、非晶硅石、气相/沉淀硅石、硅酸盐）。在一些实施形式中，诸如其中所述组合物被施用于土壤的这些实施形式中，本发明的组合物包含有利于该组合物纳入土壤当中的载体，诸如水或矿物或有机材料诸如泥煤。在一些实施形式中，诸如其中所述组合物被用于种子处理或作为根部浸剂的这些实施形式中，所述载体是有利于该组合物附着于种子或根部的结合剂或粘结剂。在另一其中所述组合物被用来作为种子处理的实施形式中，所述配制成分是色素。在其它组合物中，所述配制成分是保藏剂。

本发明还提供除了所述swrA^-细胞之外进一步包含至少一种其它活性成分或试剂的任何本发明的组合物。这种其它活性成分或试剂可为化学物质或另一种细菌菌种。适当的活性成分或试剂的实例包括但不限于除草剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、植物生长调节剂、植物生长刺激剂及肥料。

本发明还提供组合物，其中所述swrA^-细胞在该组合物中包含约1×10²cfu/g至约1×10¹⁰cfu/g。本发明还提供这种组合物，其中所述swrA^-细胞包含至少1×10⁶cfu/g、或包含至少1×10⁷cfu/g、或包含至少1×10⁸cfu/g、或包含至少1×10⁹cfu/g。

本发明包括本发明的产芽孢细菌的发酵产物及包含该发酵产物的组合物。在一方面中，这些发酵产物包括产芽孢细菌细胞、它们的代谢物及残留的发酵液。在其它方面中，所述发酵产物的产芽孢细菌细胞大部分是孢子。在另一方面中，所述包含发酵产物的组合物还包含如在此描述的配制惰性剂及配制成分。在一些实施形式中，所述经浓缩的发酵液经由例如渗滤过程清洗，以移除残留发酵液及代谢物以使该发酵产物大部分是孢子。

本发明还提供处理植物以增进植物健康（诸如通过促进植物健康、增进对非生物性压力的抗性、或提高植物活力）和/或控制植物疾病和/或控制植物害虫的方法，其中所述方法包括施用一或多种本发明的组合物或本发明的产芽孢细菌至植物、植物的部分和/或植物周围的所在地，诸如植物的生长介质。因此，例如，本发明还提供这种其中本发明的组合物被施用于土壤的方法。例如，该组合物可在植物或植物部分接触土壤之前、接触期间、或接触之后被施用。如同其它实例，本发明的方法包括但不限于利用诸如土壤表面浇淋、长柄插入、注射、化学灌溉或犁沟施用的使用方法施用所述组合物。

本发明的方法可被用于任何植物部分。这种植物部分的实例包括但不限于种子、根、球茎、块茎、鳞茎、插条（slip）及根茎。

本发明的组合物及产芽孢细菌的可用于控制植物寄生性线虫，诸如举例来说根结线虫、包囊线虫、根腐线虫及环形线虫，包括根结线虫属（Meloidogyne spp.）、异皮线虫属（Heterodera spp.）、球皮线虫属（Globodera spp.）、短体线虫属（Pratylenchus spp.）及小环线虫属（Criconemella spp.）。在一些实施形式中，所述标靶是根结线虫，诸如南方根结线虫（M.incognita）（棉花根结线虫）、爪哇根结线虫（M.javanica）（爪哇根结线虫）、北方根结线虫（M.hapla）（北方根结线虫）、及花生根结线虫（M.arenaria）（花生根结线虫）。在一些实施形式中，症状和/或线虫减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。

在另一方面中，相较于未经处理的植物、作物、水果或蔬菜，在此描述的用途、方法、在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌、及组合物增加作物产量约10％至约20％、约10％至约30％、约10％至约40％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％、约40％至约60％、或约5％或更多、约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、或约90％或更多。在另一方面中，相较于未经处理的植物、作物、水果或蔬菜，在此描述的方法及组合物增加作物产量约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％。

可利用本发明的组合物处理的代表性植物包括但不限于下列单子叶植物及双子叶植物：鳞茎蔬菜；禾谷类（诸如小麦、大麦、米）；玉米（玉蜀黍）；柑橘属水果（诸如葡萄柚、柠檬及橙子）；棉花及其它纤维作物；瓜类；果菜类蔬菜；叶菜类蔬菜（诸如芹菜、结球莴苣、散叶莴苣、及菠菜）；豆类（诸如大豆、青豆、鹰嘴豆、扁豆）；油籽作物；花生；仁果类水果（诸如苹果及梨）；核果类水果（诸如杏仁、美洲山核桃及胡桃）；根茎蔬菜；块茎蔬菜；球茎蔬菜；烟草、草莓及其它莓类；甘蓝类蔬菜（诸如花椰菜、包心菜）；葡萄；用于生物质生产的植物（诸如细叶芒、竹）、凤梨；及开花植物、花坛植物及观赏植物（诸如蕨类植物及玉簪属植物）。本发明的组合物亦可被用于处理多年生植物，包括种植作物诸如香蕉及这些存在于森林、公园或美化环境者。

当用来作为种子处理时，本发明的组合物是以大约1×10²至约1×10⁹cfu/种子的施用率施用，取决于该种子的大小而定。在一些实施形式中，所述施用率是1×10³至约1×10⁷cfu/种子。

当用来作为土壤处理时，本发明的组合物及产芽孢细菌细胞可经施用以用于土壤表面浇淋、长柄插入、注射、和/或施用于犁沟或与灌溉用水混合。浇淋土壤处理可在种植、播种期间、播种之后、移栽之后、或植物生长的任何阶段施用，施用率是约每亩（acre）4×10¹¹至约8×10¹²cfu。在一些实施形式中，所述施用率是约每亩1×10¹²至约6×10¹²cfu。在种植时施用于犁沟处理的施用率是约每1000行英尺（row feet）2.5×10¹⁰至约5×10¹¹cfu。在一些实施形式中，所述施用率是约每1000行英尺6×10¹⁰至约4×10¹¹cfu。本领域的技术人员将知道如何调整施用率以用于撒施处理（以较低施用率但较常采用的施用）及其它较不常用的土壤处理。

本发明的组合物及产芽孢细菌细胞可与其它化学及非化学添加剂、佐剂和/或处理混合，其中这种处理包括但不限于化学及非化学杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂及类似物。

本发明提供自不同细胞种类的混合物分离的砂纸细胞的实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物。举例来说，本发明提供这种实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物，其中所述不同细胞种类的混合物是保藏编号NRRL B21661的QST713。本发明提供实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物的保藏编号分别为NRRL B-50421和NRRLB-50455的枯草芽孢杆菌菌株AQ30002（aka QST30002）和AQ30004（aka QST30004）。

本发明提供具有保藏编号分别为NRRL B-50421和NRRL B-50455的枯草芽孢杆菌菌株AQ30002（aka QST30002）和AQ30004（akaQST30004）的所有生理及形态特征的枯草芽孢杆菌菌株的实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物。

本发明还提供本发明的培养物中的任一个的后代的实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物，其中所述培养物具有保藏编号分别为NRRL B-50421和NRRL B-50455的枯草芽孢杆菌菌株AQ30002（akaQST30002）和AQ30004（aka QST30004）的所有生理及形态特征。

本发明还提供组合物，其包含一种或多种本发明的swrA^-细胞的实质上纯的培养物和/或生物上纯的培养物。

附图说明

图1显示生长在营养琼脂板上的QST713野生型和QST713砂纸变体的菌落形态的对比。与野生型菌落不同的是，砂纸变体的菌落形态是高度致密及高度疏水性的。

图2显示在液体培养物中指数生长期的AQ30002swrA^-和QST713野生型swrA⁺细胞的影像。

图3显示在承受剪切力的液体培养物中的AQ30002swrA^-（“30002”）和QST713野生型swrA⁺细胞（“713”）的影像。上方影像显示放大40倍的无吸量管尖端插入培养基中的细胞生长，下方影像显示放大10倍的有吸量管尖端插入培养基中的细胞生长。

图4显示在的代表性商用批量中砂纸菌落的定量。

图5A显示包含预期的swrA转录物的各种swrA基因组DNA的比对。Bsub_168＝枯草芽孢杆菌菌株168；Bsub_3610＝枯草芽孢杆菌菌株3610；QST713＝QST713野生型；AQ30002和AQ30004＝本发明的代表性菌株；Bamy_FZB42＝解淀粉芽孢杆菌菌株FZB42；Bpum_SAFR-032＝短小芽孢杆菌菌株SAFR-032；及Blic_14580＝地衣芽孢杆菌菌株14580。

图5B显示包含预期的swrA转录物的各种swrA基因组DNA的比对。缩写与图5A中的意义相同，且Batr_1942＝萎缩芽孢杆菌菌株1942及Bpum_2808＝短小芽孢杆菌菌株2808。

图5C显示得自它们的预期swrA转录物的各种swrA蛋白质的比对。缩写与图5A及5B中的意义相同，且Bpum_7061＝短小芽孢杆菌7061。

图6显示枯草芽孢杆菌进化枝内的菌种（即枯草芽孢杆菌及通过16S rDNA对比评估的所有近亲）的系统树以及包括在树根的较远的相关菌种。具有完整基因组序列的菌种以星号标示。一个星号（“*”）还标示该菌种缺乏swrA同源基因，然而以二个星号（“**”）标示的菌种包含swrA同源基因。在枯草芽孢杆菌分支内的其它未经标示的菌种根据它们的靠近的亲源关系而推定为具有swrA同源基因，但是这些菌种的基因组序列资料目前尚无法公开地取得。

图7显示QST713swrA⁺（“QST713”）、AQ30002swrA^-（“AQ30002”）及各种基于这些菌株的构建体的0.7％LB琼脂群聚试验板影像。

图8显示QST713swrA⁺（“QST713”）、AQ30002swrA^-（“AQ30002”）及各种基于这些菌株的构建体的平均根部定殖评定，其中在AQ30002swrA^-细胞中补充野生型swrA降低根部定殖能力。

图9显示以数码光学显微镜捕捉的根部生物膜影像，其中AQ30002_endoPro_swrA_ICE（补充菌株）和QST713swrA⁺（“QST713”）的生物膜具有相似性，AQ30002_pPen_swrA_ICE（部分补充）和AQ30002swrA^-（“AQ30002”）具有相似性。

图10显示QST713野生型swrA⁺和AQ30002swrA^-砂纸型的各二复制株于30℃猪肉汤培养基中的生长结果。

图11显示QST713野生型swrA⁺（“713wt”）和AQ30002swrA^-（“AQ30002”）培养的各二复制株的菌膜强度试验结果。

图12显示枯草芽孢杆菌AQ30002swrA^-（“AQ30002”）和QST713野生型swrA⁺（“QST713wt”）的根部定殖影像。

图13显示枯草芽孢杆菌QST713野生型swrA⁺（“QST713”）和AQ30002swrA^-（“AQ30002”）生物膜覆盖的根表面的扫描式电子显微镜（SEM）影像。

图14显示经水、枯草芽孢杆菌QST713野生型swrA⁺（“QST713”）和AQ30002swrA^-（“30002”）处理的根部的薄和厚切片的光学显微镜影像。

图15显示测量植物生长促进的温室试验的结果，其中玉米经AQ30002swrA^-（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它芽孢杆菌菌株的处理。图中所示为种子经处理后2周种植的玉米，该施用率经标准化至相当于用于实验性生产的CFU率的64oz/英亩。

图16显示测量植物生长促进的温室试验的结果，其中小麦经AQ30002swrA^-（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它芽孢杆菌菌株的处理。图中所示为种子经种子浇淋处理后2周种植的小麦，该施用率经标准化至相当于用于实验性生产的CFU率的64oz/英亩。

图17显示测量植物生长增进的温室试验的结果，其中番茄经AQ30002swrA^-（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它利用基于大豆的培养基所生产的芽孢杆菌菌株的处理。图中所示为种子经种子浇淋处理后2周种植的番茄，该施用率经标准化至相当于用于实验性生产的CFU率的64oz/英亩。

图18显示测量玉米的根和枝条的干重量的温室试验的结果，其中所述玉米经AQ30002（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它利用基于大豆的培养基所生产的芽孢杆菌菌株的处理。

图19显示测量小麦的根和枝条的干重量的温室试验的结果，其中所述小麦经AQ30002（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它利用基于大豆的培养基所生产的芽孢杆菌菌株的处理。

图20显示测量番茄的根和枝条的干重量的温室试验的结果，其中所述番茄经AQ30002（“AQ30002”）、QST713（“QST713”，其为野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）或其它利用基于大豆的培养基所生产的芽孢杆菌菌株的处理。

图21显示测量加工用番茄产量的大田试验的结果，该加工用番茄产自经枯草芽孢杆菌菌株QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）或AQ30002swrA^-（“AQ30002”）单独或与植物生长刺激剂（PGS）组合处理的植物。菌株利用基于大豆的培养基生产。实验在加州爱斯卡隆（Escalon,California）进行。标示为“Exp”的处理代表备选的实验条件。利用方差分析（ANOVA）具有相同字母的测量在P＝0.05不具统计学差异性。

图22显示测量玉米植株的倒伏（自穗以下的茎断裂）百分比的大田试验，该玉米植株经枯草芽孢杆菌菌株QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）或AQ30002swrA^-（“AQ30002”）单独或与植物生长刺激剂（PGS）组合处理。菌株利用基于大豆的培养基生产。实验在明尼苏达州佩恩斯维尔（Paynesville,Minnesota）进行。标示为“Exp”的处理代表备选的实验条件。利用方差分析（ANOVA）具有相同字母的测量在P＝0.10不具统计学差异性。

图23显示大豆根部的影像，该大豆根部来自在种植时经AQ30002swrA^-（“QRD154”）且在犁沟中细菌接种处理的植物。

图24显示来自未经处理的植物的大豆根部影像。

图25显示测量枯草芽孢杆菌菌株QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）或AQ30002swrA^-（“AQ30002”）的单独或与植物生长刺激剂（PGS）组合处理在控制玉米腐霉茎腐病的大田试验结果。实验在明尼苏达州佩恩斯维尔（Paynesville,Minnesota）进行。标示为“Exp”的处理代表备选的实验条件。利用方差分析（ANOVA）具有相同字母的测量在P＝0.05不具统计学差异性。

图26显示对比QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）与AQ30002swrA^-（“AQ30002”）抗终极腐霉及立枯丝核菌所造成的猝倒病的活性的温室试验的结果。每条柱代表四次测量值的平均值，误差柱表示标准差。

图27显示在8天期间的温室试验中，QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）与AQ30002swrA^-（“AQ30002”）对抗辣椒疫霉所造成的椒枯萎的活性的时间进程。注意该未感染对照（“UIC”）与化学杀真菌剂的曲线重迭。

图28显示经渐增剂量的AQ30002swrA^-（“AQ30002”）和QST713（野生型swrA⁺与砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）处理的番茄植物。

图29显示经渐增剂量的AQ30002swrA^-（“AQ30002”）和QST713（野生型swrA⁺及砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）处理的番茄植物的个别叶子对比。

图30显示经渐增剂量的AQ30002swrA^-（“AQ30002”）和QST713（野生型swrA⁺及砂纸swrA^-细胞以中的比例的混合物，见例如实施例3及图4）（“QST713”）处理的番茄植物的叶绿素含量。

图31表示经3610WT和3610swrA^-（在图中以3610swrA表示）处理的植株的（五次重复的）平均的叶表面积。

图32显示经3610WT和3610swrA^-（在图中以3610swrA标示）处理的植株的叶绿素读数。结果为五株随机选择的番茄幼苗的第一片真叶的叶绿素量的平均值。

图33显示3610WT和3610swrA^-（在图中以3610swrA标示）对抗椒类的辣椒疫霉的活性。

图34显示以AQ30002swrA^-（“AQ30002”）全发酵液处理受到根结线虫感染根部的虫瘿（galling）的效果。

图35显示以不同比率的AQ30002swrA^-（“AQ30002”）处理受到根结线虫感染的幼苗的效果。特别地，结果显示形成根瘿的程度及对线虫穿透及发育的影响。

图36表示在经不同批次的AQ30002swrA^-（“AQ30002”）处理后相较于未经处理的植株（在图中以UTC标示）每植株的根结线虫虫卵。

本发明的详细说明

以如同各个公开资料或专利申请被特别地且个别地被指出以参照方式并入的程度，在此以参照方式并入所有公开资料、专利及专利申请（包括任何图式及附录）。

下列说明包括有助于理解本发明的信息。并不是承认此处所提供的任何信息是现有技术或是与本申请请求的发明有关，或任何特别地或暗示地参照的公开资料是现有技术。

制品（美国国家环境保护局登记编号69592-12）包含独特的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（菌株QST713）专利菌株及许多不同的脂肽，它们协同作用以破坏疾病病原体并提供优异的抗微生物活性。该制品被用于保护植物，诸如蔬菜、水果、坚果及蔓生作物，以抵抗疾病例如火疫病、灰霉病、酸腐病、锈病、核盘菌病、白粉病、细菌性斑点病及白霉病。该制品有液体或干燥配制剂的规格，其可被施用作为叶面和/或土壤处理。美国国家环境保护局（U.S.EPA）核准的制品（包括ASO、MAX及SOIL）的产品标示的副本可经由美国农药信息检索系统USEPA/OPP农药产品标示系统（PPLS）公开取得。

（有机水性悬浮液）包含1.34％的干燥QST713作为活性成分及98.66％的其它成分。是经配制为包含最少1×10⁹cfu/g的QST713，然而QST713的最大含量已被测定为3.3×10¹⁰cfu/g。的替代性商用名称包括及DISEASE。其它信息可见U.S.EPA于2010年1月4日核准的的产品标示及的产品标示，它们各自以参照方式全文纳入此处。

包含14.6％的干燥QST713作为活性成分及85.4％的其它成分。是经配制为包含最少7.3×10⁹cfu/g的QST713，然而QST713的最大含量已被测定为7.9×10¹⁰cfu/g。其它信息可见U.S.EPA核准的的产品标示，其以参照方式全文纳入此处。

野生型枯草芽孢杆菌QST713、其突变株、其上清液、其脂肽代谢物及其用于控制植物病原体及昆虫的方法完整描述于美国专利号6,060,051、6,103,228、6,291,426、6,417,163及6,638,910中，这些专利各自特别地且完整地以参照方式将它们所有的教导纳入于此处。在这些美国专利中，所述菌株被称为AQ713，其与QST713同义。枯草芽孢杆菌QST713已于1997年5月7日遵照布达佩斯条约有关国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的规定以保藏标号B21661保藏于NRRL。任何在本说明书中所指涉的QST713指如同存在于制品中的枯草芽孢杆菌QST713（即AQ713），其以保藏编号NRRL B21661保藏，或于生物反应器中在刺激制品的生产的条件下制备。

在1998年提出对应上述专利的美国专利申请09/074,870的申请时，该菌株根据传统生理学、生化学及形态学的方法被命名为枯草芽孢杆菌。自此之后芽孢杆菌属菌种的分类学不断演进，尤其是因为基因学及测序技术的进步，使得现在菌种命名大部分是根据DNA的序列而非在1998年使用的方法。在比对源自解淀粉芽孢杆菌FZB42、枯草芽孢杆菌168和QST713的蛋白质序列之后，大约95％在解淀粉芽孢杆菌FZB42中发现的蛋白质与QST713中发现的蛋白质具有85％或更高的同一性；然而只有35％的枯草芽孢杆菌168中的蛋白质与QST713中的蛋白质具有85％或更高的同一性。然而，即使更加依赖基因学，在相关的科学文献及法规文件中仍存有分类模糊性，显示在过去15年来处于变化中的对芽孢杆菌属分类学的理解。举例来说，基于枯草芽孢杆菌菌株FZB24的农药制品和FZB24一样与QST713的关系密切，在U.S.EPA的文件中被分类为枯草芽孢杆菌液化淀粉变种（B.subtilis var.amyloliquefaciens）。由于这些命名上的复杂性，此特定芽孢杆菌属根据文献被各自命名为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌液化淀粉变种。因此，我们保留QST713的枯草芽孢杆菌命名，而不是将名称改成若仅根据目前的序列对比及推断的分类学将预期的解淀粉芽孢杆菌。

如此处更详细地解释，由于本发明的结果，我们现在理解QST713的培养物实际上是野生型细胞与相当少量的变异细胞株的混合物，我们将该变体命名为“砂纸细胞”。因此，根据本发明，我们现在知道在制品中的QST713或在生物反应器中生长的QST713细胞由野生型细胞及砂纸细胞的混合族群组成，这种细胞的混合比例和制品中的细胞比例相同或类似（见例如图4）。如此处的详细描述，我们称这种变体为“砂纸”细胞是根据它们的菌落的形态学，如图1所示。砂纸细胞在营养琼脂上形成菌落，这种菌落在形态学及生理学上似乎高度致密、疏水、平坦、干燥及非常“粗糙”，且非常难以从琼脂上移除。细胞粘附可被定性观察，或可通过Stanley等人（同上）所描述的结晶紫染色测量。除了在营养琼脂上形成此独特的菌落形态以外，砂纸细胞在诸如根部的表面形成紧致的生物膜（或更坚固的生物膜），如图12、13及14中经30002处理的根部影像。在一实施形式中，所述砂纸细胞具有增强的薄膜强度，可如实施例8所述进行测试。在另一实施形式中，砂纸细胞在早期指数期的液体培养物中除了一些单一细胞及短链之外，还形成长链的细胞，如图2所示，但不会在液体培养物中聚集成块或形成生物膜。在又一实施形式中，砂纸细胞显示增强的生物膜发展，甚至在液体培养物中也应对剪切力而开始形成生物膜。在另一实施形式中，砂纸细胞具有额外的细胞衣，如实施例9所述及图14中的30002定殖根部的影像所示。在一实施形式中，观察是基于与具有野生型swrA基因的等基因细胞的对比。在另一实施形式中，观察是基于与具有形成生物膜所需的野生型基因或其同源基因的相同菌种的细胞的对比，所述野生型基因或其同源基因是，即sfp、swrA、epsC及degQ。此处所使用的术语“等基因的”是指具有相同基因型的任二种细胞或个体（例如菌株）。基于本发明，我们现在知道在制品中的QST713（见例如实施例1、图1及图2）或在生物反应器中生长的QST713细胞是由野生型细胞及砂纸细胞的混合族群组成，这种细胞的混合比例和中的细胞比例相同或类似（见例如实施例3及图4）。

群聚运动是能让细菌在固体表面上快速且集体移动的活性机理（J.Henrichsen,“Bacterial Surface Translocation:A Survey and aClassification,”Bacteriol.Rev.（1972）36:478-503）。数种不同基因及操纵子已被发现与芽孢杆菌属的群聚能力有关。金恩斯等人（Kearns,et al.）（“Genes Governing Swarming in Bacillussubtilis and Evidence for a Phase Variation MechanismControlling Surface Motility,”Molecular Microbiology（2004）52（2）:357-369）发现枯草芽孢杆菌的实验室菌株168及相关实验室菌株PY79各具有导致群聚运动受损的基因读框移位突变，他们将该基因命名为swrA。swrA在科学文献中的替代性名称包括yvzd及swrAA。在这二种实验室菌株中的swrA突变（即swrA^-）是在核苷酸34处的八个A:T碱基对的同聚物片段中插入一个A:T碱基对（所有swrA核苷酸序列的编号是根据我们在图5中的编号）。此插入被预期通过造成读框移位突变及截短的蛋白质而扰乱基因功能。该野生型（功能性；即swrA⁺）序列（即不含插入）可见于未经驯化的菌株3610及已重新获得群聚能力的菌株。申请人确立该QST713的砂纸细胞在swrA基因中具有突变，如实施例5中的详细讨论。这些swrA^-细胞具有受损的群聚能力。意外的是，当施用于植物或土壤时，它们促进植物健康。

其它基因，sfp、epsC、swrA、degQ及称为rapP的质粒基因亦与生物膜形成有关。见McLoon,A.,et al.,“Tracing theDomestication of a Biofilm-Forming Bacterium”Journal ofBacteriology,Apr.20112027-2034。命名为168的培养型枯草芽孢杆菌菌株形成受损的生物膜及平滑、浅薄的菌落，且不具有群聚能力。此处用以描述细菌菌株的术语“培养型”是指经筛选具有使它们适用于实验室试验的特性的衍生的突变菌株，例如高度适于输入及嵌入基因材料、营养缺陷型、缺乏群聚或薄膜形成。相反地，此处用以描述细菌菌株的术语“野生型”是指已从自然界分离但尚未经主动筛选以利于实验室操作的菌株。麦隆（McLoon）的文献描述用以修复菌株168的生物膜形成及群聚能力的实验。首先修复sfp突变，接着修复epsC突变，再来修复swrA突变，然后修复degQ突变。在各步骤中，生物膜形成被逐渐修复，变成几乎等同于在命名为3610的野生型枯草芽孢杆菌菌株中的生物膜形成。最后，在质粒上的rapP基因被插入该否则完全修复的菌株，导致与3610的生物膜形成无法区别的生物膜形成。麦隆（McLoon）等人在第2032页中提到，“我们的结论是，带有sfp、epsC及swrA的野生型等位基因的菌株相较于带有swrA突变的对应菌株具有更为坚固的生物膜形成，因此swrA亦有助于坚固的生物膜形成”。令人意外的是，根据本发明，缺乏swrA功能的菌株相较于具有野生型swrA的亲代菌株形成更坚固的生物膜，与麦隆的发现相反。麦隆等人并未描述其中唯一的突变生物膜形成基因是swrA的细胞，因此并未描述此处所说明的该增强的生物膜表型。

“野生型”是指在自然界中存在和/或以被命名为“野生型”的已知分离形式存在的典型形式的菌种的表型。在此处所谓“野生型（wildtype）”的同义字包括“野生型（wildtype）”、“野生型（wild-type）”、“+”及“wt”。所述野生型通常被认为是在一或多个基因座处的特定基因的标准、“正常”等位基因的产物，相对于由非标准、“突变”或“变异”等位基因所产生的。一般且如此处所使用的，特定芽孢杆菌菌株或分离株的最常见的等位基因（即具有最高频率的基因）被认为是野生型的等位基因。此处所使用的“QST713野生型”或“QST713野生型swrA⁺”及其同义字（例如“QST713swrA⁺”、“QST野生型”、“QST713wt”等）是指具有能表现该经编码的swrA蛋白质的功能性swrA基因（即swrA⁺）的枯草芽孢杆菌QST713。因此，这些术语是指100％swrA⁺的野生型QST713细胞株。野生型QST713对于在文献中识别为与生物膜形成有关的其它基因：epsC、degQ、及sfp也是野生型的。SEQ ID NO:11是野生型QST713中的sfp基因的核苷酸序列。SEQID NO:12是野生型QST713中的epsC基因的核苷酸序列。SEQ ID NO:13是野生型QST713中的degQ基因的核苷酸序列。

在此描述的微生物及特定菌株除非另外特别说明，否则皆为从自然界分离且于此处所述的人工条件下生长，诸如培养或放大规模的制造过程诸如发酵。

本申请所附的序列表提供各种芽孢杆菌菌种及菌株的序列，亦如图5A、5B及5C所示。下表1列出SEQ ID NO与对应的菌株。所有序列皆为核苷酸序列，但SEQ ID NO:2除外为氨基酸序列。

表1

本发明涉及具有swrA基因的产芽孢细菌的，更特别地涉及在该swrA基因处具有一或多种突变的这种细菌的变体，该突变导致无法表现经编码的swrA蛋白质和/或无法编码功能性swrA蛋白质的非功能性swrA基因，其中所述突变及具有所述突变的变体在此处被称为swrA^-。本发明还包含其中swrA活性已通过除了所述swrA基因突变以外的方式被减弱的产芽孢细菌的，诸如从活化该swrA基因的转录、转录该swrA基因、转录后讯息处理、转译swrA mRNA、转译后蛋白质处理、到实际蛋白质活性的进展中的其它点抑制swrA活性。任何可抑制swrA活性的试剂或系统皆被本发明考虑，包括小分子、药物、化学品、化合物、siRNA、核酶、反义寡核苷酸、swrA抑制性抗体、swrA抑制性肽、显性失活突变、适体或镜像适体。其中swrA活性已通过除了所述swrA基因突变以外的方式被减弱的细胞亦被称为swrA^-。本发明的swrA^-细胞相较于具有野生型swrA基因的细胞具有受损的群聚能力及促进植物健康的能力。在一些实施形式中，swrA^-细胞失去全部或实质上全部群聚能力。在一些实施形式中，群聚能力相较于在swrA同源基因不具有突变的等基因细菌细胞的群聚能力是减弱的。在一些实施形式中，群聚能力减少至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。群聚能力可通过实施例7中所描述的方法测定，及通过测量在中央接种的“群聚琼脂”板上的细菌生长直径加以定量对比。见图7。

在其它实施形式中，除了具有上述特征之外，swrA^-细胞相较于具有野生型swrA基因的细胞具有下列特征的一项或多项：砂纸细胞或菌落形态学（如上所述）；在表面诸如根部上形成紧密贴附的生物膜；及在早期指数生长期间，在液体培养物中形成一些长链的细胞，缺乏聚集成块或生物膜形成，这显示应对形成生物膜的环境信号（即暴露至固体表面）的能力。swrA^-细胞在表面诸如根部上形成紧密生物膜，且对于非液体表面诸如根部具有增强的附着性，在此处称为“更坚固的生物膜”。在一方面中，所述非液体表面是固体表面；在其它方面中其为半固体表面。根部的相对附着性可通过在无生物膜扰乱时加以分析，如实施例9中所述使根部在琼脂中生长、自该琼脂中移出并以光学显微镜观测。在另一实施形式中，所述更坚固的生物膜包含当以透射电子显微镜观测时具有额外的细胞衣和/或大型白色（电子透明）区域的细胞。见图14中30002的影像。在此实施形式的一方面中，在该更坚固的生物膜中的细胞的平均直径是相较于不具有该swrA突变的细胞的平均直径的大于至少约1.5倍或大于至少约2倍。见图14中30002的影像。在一些实施形式中，在非液体表面（诸如根部）上形成的生物膜的细胞形态学是通过实施例9中所描述的方法分析的。在又一实施形式中，当暴露于液体培养物中的剪切力时，swrA^-细胞亦可具有增强的生物膜发展。这种剪切力于实施例1中描述。用来作为对照细胞以对比该swrA^-细菌细胞的特征的适当细菌细胞可以是不同的。举例来说，在一实施形式中，上述特征的对比在具有所述突变的细菌细胞与不具有所述突变的等基因细菌细胞之间进行。在另一实施形式中，所述对比在具有所述突变的细菌细胞与不具有该突变但亦包含该生物膜形成基因sfp、epsC及degQ的野生型等位基因的相同菌种的细菌细胞之间进行。

在一些实施形式中，这些swrA^-产芽孢细菌的属于芽孢杆菌科。在其它实施形式中，它们来自芽孢杆菌属。在该实施形式中，产芽孢细菌细胞或具有该swrA突变的芽孢杆菌可（i）来自枯草芽孢杆菌分支，如下述定义，（ii）具有一或多种在swrA同源基因中的突变，及（iii）具有受损的群聚能力及增强的植物健康促进能力，及任选地一或多种在前述段落中所描述的其它特征。此处所使用的术语“枯草芽孢杆菌分支”在图6中被部分描述，其包括已被完全测序且被判定为可能具有swrA同源基因的菌种，以及这些目前尚无基因组序列资料但基于它们的密切亲源关系而假设具有swrA同源基因的菌种。除此之外，该术语“枯草芽孢杆菌分支”包含这些此处未识别但通过本领域的技术人员所广为周知的分析（包括交互式最佳BLAST匹配方法）得知包含swrA同源基因的芽孢杆菌菌种。

同源性序列若是由物种形成事件分开，则它们是同源基因：当一物种分成二个不同的物种，在该形成物种中的单一基因的分开副本被称为同源基因。同源基因是不同物种中彼此类似的基因，因为这些基因通过垂直传递起源于最后共同祖先的单一基因。二个类似基因为同源基因的最强烈的证据是该基因系的亲缘关系分析的结果。在同一分支内发现的基因是同源基因，且包含起源于共同祖先的基因的同源基因群。同源基因通常但不一定总是具有相同功能。交互式最佳BLAST匹配方法是最常使用以识别可能的同源基因对的策略。此方法假设若源自二个物种的二种类似的蛋白质于彼此的蛋白质粒中交互产生最佳的BLAST匹配，则它们为同源基因对。见Rivera,M.C.,et al.,“Genomic Evidence for Two Functionally Distinct Gene Classes,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA（95）:6239-44（May1998）。举例来说，申请人的交叉物种的swrA对分析显示于枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌及短小芽孢杆菌中的swrA产生交互式最佳BLAST匹配，即使在二个物种（解淀粉芽孢杆菌及短小芽孢杆菌）之间的swrA蛋白质的整体同一性百分比仅为70％。

在一实施形式中，在枯草芽孢杆菌分支中的菌种包括但不限于短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、高海拔芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、空气芽孢杆菌及（ii）在该swrA基因中具有一或多种突变的枯草芽孢杆菌QST713野生型swrA⁺的变体及菌株。

本发明的swrA突变包括但不限于一或多种核酸碱基对插入、一或多种核酸碱基对删除、一或多种核酸改变（包括起始密码子改变）、一或多种转座子插入、野生型swrA基因的基因减弱和/或基因敲除。本领域的技术人员将理解该基因包括调节区域，诸如启动子、转录区及其它功能性序列区。

产芽孢细菌的族群可被筛选出在swrA同源基因中具有突变的天然发生的细胞，如实施例24所描述。或者，一些基因学及分子生物学的技术可被使用以降低swrA于转录及转译上的表现以产生具有减少群聚能力及坚固生物膜形成的swrA^-细胞。在一些实施形式中，这种swrA^-细胞可能具有一或多种其它如上所述的特性（在液体培养物中形成一些长链但不聚集成块或形成生物膜，及根部生物膜中经改变的细胞形态学）。反义RNA、RNAi及核酶可经工程化处理及导入该细胞中以减少swrA或其它作为正调节子的基因（诸如σD及σA）的表现。已知这些转录因子可辨识及直接与该swrA启动子结合（Calvio,etal.,“Autoregulation of swrAA and Motility in Bacillussubtilis,”Journal of Bacteriology（2008）190:5720-5728）。swrA的负调节子亦可被使用以减少swrA表现。举例来说，FlgM（一种σD特异性抗σ因子（Fredrick and Helmann,“FlgM is a primaryregulator of sigmaD activity,and its absence restores motilityto a sinR mutant,”Journal of Bacteriology（1996）178:7010-7013））可被过度表达以减少swrA的表现。另一策略是使用反效等位基因突变或显性失活突变。由于swrA可能以二聚体或多聚体作用（Dan Kearns,personal communication,2011），由经突变及野生型swrA单位组成的异二聚体swrA可能不再具有功能。用于减少swrA表现的基因工程技术的实例是列于实施例25。

当依照本发明使用时，术语“位置”是指在此处所述的核酸序列内的核苷酸或氨基酸序列内的氨基酸的位置。术语“对应”是用于此处以表示位置不限于由该在前的核苷酸或氨基酸的编号决定。举例来说，在本发明中可能被删除的给定核苷酸的位置可能不一，因为不在swrA基因处诸如在5′-非转译区（UTR）包括启动子和/或任何其它调节序列或基因的删除或额外的核苷酸。因此，此处所使用的“对应位置”或“对应于”核苷酸序列或氨基酸序列的特定位置“的位置”是指当有问题的序列通过标准方法与例如SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列（例如该参照序列）比对时，与该所示位置或有时与SEQ ID NO:1的核苷酸序列或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的部分展现显著同源性的位置。举例来说，芽孢杆菌属的不同菌种虽然具有类似的swrA基因和/或swrA蛋白质的核苷酸序列，但与该参照序列不同，特别是相较于该参照序列可能包含不同、较少或较多的核苷酸或氨基酸。举例来说，类似SEQ ID NO:1或2的有问题的序列片段可轻易地通过标准的电脑比对技术使用已建立的软件测定，例如使用参数设定为“标准”或“预设”的ClustalW。

在一些实施形式中，产芽孢细菌变体中的swrA突变发生在造成氨基酸改变的核苷酸位置，所述氨基酸改变对应于SEQ ID NO:2所示的下列保守蛋白质位置中的至少一个：位置1至17、位置19至20、位置22、位置25至29、位置31至33、位置36至39、位置41至48、位置50至51、位置53、位置56、位置58、位置60、位置61、位置64至65、位置67至69、位置71至86、位置88、位置95、位置97、位置99至113、及位置116。这些保守位置在图5C中的比对是以星号表示的。在另一些其它实施形式中，所述突变发生在造成氨基酸改变的核苷酸位置，所述氨基酸改变对应于下列保守蛋白质位置的至少一个的改变：位置1至17、位置71至86、及位置99至113。此外，所述核苷酸改变（成为swrA突变）应损害该细胞的群聚能力和/或相较于具有该野生型swrA基因的细胞增进它们促进植物健康的能力。在一些实施形式中，所述突变亦将导致下列不同于野生型细胞的特征：砂纸细胞形态、更坚固的根部定殖和/或在液体培养物中形成长链但无不聚集成块，如上所述。

在其它实施形式中，所述swrA突变发生在对应SEQ ID NO:1及5至10中任一个的位置1至100、1至50、1至40、或7至40的位置。

在一些实施形式中，所述swrA^-细胞具有与SEQ ID NO:1的swrA基因至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％的同一性的swrA基因。在特定的实施形式中，所述与SEQ IDNO:1具有至少约60％至约95％的序列同一性的swrA^-细菌的野生型版本具有与SEQ ID NO:2是同源基因的swrA蛋白质。

在一实施形式中，微生物在对应如SEQ ID NO:1所示的swrA基因的位置26至34（8个A:T碱基对的同聚物片段）或位置1至3（起始密码子）的一个或多个位置具有突变。在一些实例中，所述突变是插入或删除。删除位置26至34的实例是如SEQ ID NO:3所示的经突变的swrA基因。在一突变实例中起始密码子经突变成为非起始密码子，其产生的供转译的非功能性swrA转录物如SEQ ID NO:4所示。

在另一实施形式中，所述swrA^-细胞具有swrA^-基因，其具有与相同芽孢杆菌菌种和在一些实施形式中的相同菌株的swrA野生型基因至少约85％、至少约90％、或至少约95％的序列同一性。在一些实施形式中，所述swrA^-细胞具有与这种相同芽孢杆菌菌种的swrA野生型基因序列同一性的swrA^-基因，且这种芽孢杆菌菌种属于枯草芽孢杆菌分支。在一些实施形式中，这种芽孢杆菌菌种是短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜气芽孢杆菌、同温层芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌、高海拔芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌或空气芽孢杆菌。在另一些其它实施形式中，所述swrA^-细胞具有与如SEQ ID NO:1及5至10所示的序列中的一个或多个至少约85％、至少约90％、或至少约95％的序列同一性的突变swrA基因。

在一实施形式中，在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞（包括在枯草芽孢杆菌分支内的那些）包含野生型sfp同源基因。在其它实施形式中，这种产芽孢细菌细胞亦包含野生型degQ及epsC同源基因。在另一些其它的实施形式中，源自上述实施形式中任一个的产芽孢细菌细胞是枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。源自野生型QST713的sfp、epsC及degQ基因分别以SEQ ID NO:11、12及13提供于此处。源自其它菌种，包括swrA核苷酸序列已提供于此处（序列表和/或图5A、B及C）的芽孢杆菌菌种及菌株的同源基因sfp、epsC及degQ基因可经由GenBank及各种文献（包括如上引用的McLoon文献）公开取得。在一实施形式中，所述野生型degQ、epsC及sfp同源基因分别与解淀粉芽孢杆菌FZB42、短小芽孢杆菌SAFR-032、枯草芽孢杆菌3610、萎缩芽孢杆菌1942及地衣芽孢杆菌14580中的degQ、epsC及sfp基因之一具有至少约90％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％的序列同一性。在测定序列同一性的方面中，在swrA同源基因中具有突变的产芽孢细菌细胞与该上述参照菌株之一的菌种相同。

在本发明的特定组合物中的swrA^-细胞的百分比将依照使用该组合物的特定目的及施用方法而异。本发明的组合物及方法中的总细胞可包括不同细胞类型（例如细菌与非细菌细胞的组合），或可包括二或多种菌种的细菌细胞，或可包括二或多种芽孢杆菌菌种的芽孢杆菌细胞，或可为二或多种不同基因型或菌株的枯草芽孢杆菌细胞，或可为二或多种不同基因型或菌株的解淀粉芽孢杆菌，或为具有一或多种不同swrA^-突变的细胞。

在一些实施形式中，本发明的组合物及方法中的总细胞中的swrA^-细胞的百分比将为至少3.5％、或至少3.6％、或至少3.7％、或至少3.8％、或至少3.9％、或至少4％、或至少5％、或至少6％、或至少7％、或至少8％、或至少9％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少98％、或至少99％、或为100％。在本发明的一些实施形式中，所有存在于特定组合物中或用于特定方法中的细胞全部皆为swrA^-细胞（即100％swrA^-细胞）。

在一些实施形式中，本发明的组合物及方法中的总细胞中的swrA^-细胞的百分比将为约3.5％至约99.9％。在另一实施形式中，所述百分比将为约5％至约99％。在另一实施形式中，所述百分比将为约10％至约99％。

在一些实施形式中，本发明的组合物及方法中的swrA^-细胞的每克（g）的菌落形成单位数量（cfu）将为至少1×10⁷cfu/g、或至少1×10⁸cfu/g、或至少1×10⁹cfu/g、或至少2×10⁹cfu/g、或至少3×10⁹cfu/g、或至少4×10⁹cfu/g、或至少5×10⁹cfu/g、或至少6×10⁹cfu/g、或至少7×10⁹cfu/g、或至少8×10¹⁰cfu/g、或至少8.5×10¹⁰cfu/g、或至少9×10¹⁰cfu/g、或至少9.5×10¹⁰cfu/g、或至少1×10¹¹cfu/g、或至少2×10¹¹cfu/g、或至少3×10¹¹cfu/g、或至少4×10¹¹cfu/g、或至少5×10¹¹cfu/g、或至少6×10¹¹cfu/g、或至少7×10¹¹cfu/g、或至少8×10¹¹cfu/g、或至少9×10¹¹cfu/g、或至少1×10¹²cfu/g、或至少1×10¹³cfu/g、或至少1×10¹⁴cfu/g。

在其它实施形式中，本发明的组合物及方法中的swrA^-细胞的总量基于该总组合物中swrA^-细胞的相对或实际干燥基重。

在一些实施形式中，本发明的组合物及方法中的swrA^-细胞的总量基于该组合物中swrA^-细胞的cfu/g。

本发明还包含促进植物健康、增进植物生长和/或控制植物害虫和疾病的方法，该方法通过施用一或多种所述产芽孢细菌的新颖变体及菌株（包括如上述的芽孢杆菌）、或它们的非细胞制剂、或它们的代谢物至植物或植物部分（诸如种子、根、根茎、球茎、鳞茎或块茎），或通过施用至植物或植物部分生长的所在地（诸如土壤）。

此处所使用的“植物健康”是指植物的状态，该状态由许多方面单独判断，或由各方面组合判断。植物状态的一项重要指标是作物产率。“作物”及“果实”被认为是在收成后被进一步利用的任何植物产品，例如一般认知的水果、蔬菜、坚果、谷类、种子、木材（例如以林业为例）、花（例如以园林、园艺业为例）等，也就是由植物所生产的任何具有经济价值的。植物状态的另一项指标是植物活力。植物活力亦可在多方面显示，其中某些为外观可见，例如叶子颜色、果实颜色及外观、死亡基生叶的量和/或叶片大小、植物重量、植物高度、植物倾倒的程度（倒伏）、分蘗的数量、强度及生产力、圆锥花序长度、根系统范围、根强度、结节程度（特别是根瘤菌结节）、发芽、出苗、开花、谷物成熟和/或老化的时间点、蛋白质含量、糖分含量及类似指标。植物状态的另一指标是植物对生物性及非生物性压力因素的耐受性或抗性。

根据本发明，植物特别是农业、林业和/或园艺植物的“增加的产率”是指个别植物的产物的产率相较于植物在相同但未施用本发明的组合物的条件下产生的相同产物的产率所增加的可测量的量。根据本发明，较佳的是该产率相较于适宜的对照增加至少0.5％、或至少1％、或至少2％、或至少4％、或至少5％、或至少10％。

在另一较佳的实施形式中，本发明提供使用本发明的组合物以增加植物例如农业、林业和/或园艺植物的产率和/或促进活力的用途。

本发明还提供增加植物的产率和/或促进活力的方法，该方法包含以本发明的组合物或产芽孢细菌的处理植物、植物生长或预期生长的所在地（即植物所在地）和/或植物自其生长的繁殖体。在一些实施形式中，在经处理的植物所在地生长的该经处理的植物是生长于对于该生长的植物具生理压力的环境中。这种条件可为寒冷气温（例如15℃或更低）、干旱条件、低土壤营养（例如氮和/或钾和/或磷酸盐或其它无机微营养素的含量低）和/或增加、非理想的土壤盐度。根据本发明，“增进植物活力”是指某些作物特征相较于植物在相同但未施用本发明的组合物的条件下所产生的相同因子被增加或增进可测量或可注意的量。增进植物活力可尤其具有下列经增进的植物特征：（a）增进植物的活力、（b）增进植物和/或植物产物的品质，例如增进蛋白质含量、（c）增进视觉外观、（d）延迟老化、（e）增进根部生长和/或发育更良好的根部系统（例如由根部的干质量测定）、（f）增进结节（特别是根瘤菌结节）、（g）更长的圆锥花序、（h）更大的叶片、（i）更少的死亡基生叶、（j）增加的叶绿素含量、（k）延长的光合作用活性期、（l）增加或增进的植物林分密度、（m）较少的植物倾倒（倒伏）、（n）增加的植物重量、（o）增加的植物高度、（p）分蘗增加、（q）更强壮和/或更具生产力的分蘗、（r）较少不具生产力的分蘗、（s）增进的光合作用活性和/或增进的色素含量及因此更绿的叶面颜色、（t）更早和/或增进的发芽、（u）促进和/或更一致和/或更早的出苗、（v）增加的茎生长、（w）更早开花、（x）更早结果、（y）更早谷物成熟、（z）需要较少肥料、（aa）需要较少种子。

本发明的组合物亦可用于控制植物病原体，诸如植物病原性真菌，包括例如各种土源性和/或种子源性病原体，诸如螺壳状丝囊霉（Aphanomyces cochlioides）、寄生帚梗柱孢菌（Cylindrocladiumparasiticum）、燕麦镰孢（Fusarium avenaceum）、黄色镰孢（Fusariumculmorum）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、樟疫霉（Phytophthoracinnamomi）、终极腐霉（Pythium ultimum）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小核盘菌（Sclerotinia minor）、齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）、大麦坚黑粉病（Ustilago hordei）、颖枯壳多胞菌（Stagonosporanodorum）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、大丽花轮枝孢（Verticillium dahliae）、Tapesia yallunde、链格孢（Alternariaalternate）和扩展青霉（Penicillium expansum）。在一实施形式中，所述可被控制的土源性病原体是辣椒疫霉、齐整小核菌及寄生帚梗柱孢菌。

本发明的组合物亦可用于控制植物害虫，包括植物寄生性线虫，诸如举例来说根结线虫、包囊线虫、根腐线虫及环形线虫，包括根结线虫属（Meloidogyne spp.）、异皮线虫属（Heterodera spp.）、球皮线虫属（Globodera spp.）、短体线虫属（Pratylenchus spp.）及小环线虫属（Criconemella spp.）。组合物亦可用于控制柑桔垫刃线虫（Tylenchulus semipenetrans）、毛刺线虫属（Trichodorusspp.）、长针线虫属（Longidorus spp.）、肾状线虫属（Rotylenchulusspp.）、剑线虫属（Xiphinema spp.）、刺线虫属（Belonolaimus spp.）（诸如长尾刺线虫（B.longicaudatus））、轮线虫属（Criconemoidesspp.）、矮化线虫属（Tylenchorhynchus spp.）、纽带线虫属（Hoplolaimus spp.）、盘旋线虫属（Rotylenchus spp.）、螺旋线虫属（Helicotylenchus spp.）、穿孔线虫属（Radopholus spp.）（诸如柑橘穿孔线虫（R.citrophilis）及类似穿孔线虫（R.similis））、茎线虫属（Ditylenchus spp.）及其它植物寄生性线虫。在一些实施形式中，所述标靶为包囊线虫，诸如大豆异皮线虫（Heterodera glycines）（大豆包囊线虫）、甜菜异皮线虫（Heteroderaschachtii）（甜菜包囊线虫（beet cyst nematode））、燕麦异皮线虫（Heterodera avenae）（禾谷包囊线虫（Cereal cyst nematode））、南方根结线虫（Meloidogyne incognita）（棉花（或南方）根结线虫）、马铃薯黄金线虫（Globodera rostochiensis）及马铃薯白色包囊线虫（Globodera pallida）（马铃薯包囊线虫）。在其它实施形式中，所述标靶是根结线虫，诸如南方根结线虫（M.incognita）（棉花根结线虫）、爪哇根结线虫（M.javanica）（爪哇根结线虫）、北方根结线虫（M.hapla）（北方根结线虫）、及花生根结线虫（M.arenaria）（花生根结线虫）。

此处所使用的术语“控制”是指杀灭或抑制微生物的生长，或对植物害虫（诸如线虫）来说是指杀灭、减少数量和/或减少生长、进食或正常生理发育，包括以根结线虫为例穿透根部及在根部内发育的能力。有效量是能够可测量的减少下列的量：（i）微生物的生长、或（ii）对植物害虫来说，害虫生长、进食、运动、生殖能力、或（iii）特别地对植物寄生性线虫害虫而言，根部穿透、根部的成熟、和/或线虫感染导致的一般正常生理发育及症状。在一些实施形式中，症状和/或植物病原体或植物害虫（诸如线虫）减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％。

本发明的芽孢杆菌属的新颖变体及菌株可以孢子（其为休眠状态）、以营养细胞（其为生长中）、以过渡期细胞（其是自生长期过渡成孢子形成期）、或以所有这些类型的细胞的组合存在于本发明的组合物中。在一些实施形式中，所述组合物主要包含孢子。在一些实施形式中，所述系孢子的swrA^-细胞的百分比至少约70％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约95％。

本发明的芽孢杆菌属的新颖变体及菌株的代谢物包括脂肽类，诸如伊枯草菌素（iturin）、表面活性肽（surfactin）、披巴斯他汀（plipastatin）、丰原素（fengycin）及阿瓜斯他汀（agrastatin），及其它具有抗菌特性的化合物。QST713的脂肽代谢物是详细描述于美国专利号6,291,426及6,638,910中。亦见Marc Ongena and PhilippeJacques,“Bacillus Lipopeptides:Versatile Weapons for PlantDisease Biocontrol,”Trends in Microbiology（March1,2008）Volume16,Issue3,115-125。

本发明的组合物可通过以本领域熟知的方法培养该芽孢杆菌属的新颖变体及菌株而获得，包括使用如美国专利第6,060,051号中所描述的培养基及其它方法。惯用的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵、或液体表面培养。在发酵即将结束时，由于营养被耗尽，芽孢杆菌细胞开始从生长期转变成孢子形成期，因此该发酵的终产物大部分是孢子、代谢物及残余发酵培养基。孢子形成是芽孢杆菌细胞（包括枯草芽孢杆菌）的天然生命周期的部分，通常是由于该细胞应对营养限制而开始。调配发酵以获得高量的芽孢杆菌菌落形成单位并促进孢子形成。在培养基中由发酵产生的细菌细胞、孢子及代谢物可被直接使用或通过惯用的工业方法浓缩，诸如离心、切向流过滤、深层过滤及蒸发。发酵液及发酵液浓缩物在此均称为“发酵产物”。本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施形式中，所述经浓缩的发酵液是经由例如渗滤过程清洗，以移除残留发酵液及代谢物。

所述发酵液或发酵液浓缩物可在有或无添加载体时利用惯用的干燥技术或方法加以干燥，诸如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流体化床干燥、滚筒干燥、或蒸发。

所述形成的干燥产品可通过诸如研磨或造粒的进一步处理，以达到特定颗粒大小或物理格式。如下所述的载体液可在干燥后被添加。

本发明的芽孢杆菌属的新颖变体及菌株的发酵液的无细胞制剂可通过本领域已知的任何方法获得，诸如萃取、离心和/或过滤发酵液。本领域的技术人员将理解所谓的无细胞制剂不是完全不含细胞，而是大部分无细胞或实质上无细胞，依据用于移除该细胞的技术（例如离心速度）而定。所形成的无细胞制剂可与有助于其施用至植物或植物生长培养基的成分一起被干燥和/或配制。上述用于发酵液的浓缩方法及干燥技术亦可被用于无细胞制剂。

枯草芽孢杆菌的代谢物可根据如美国专利第6,060,051号中所述的方法获得。此处所使用的术语“代谢物”是指半纯及纯的或实质上纯的代谢物，或指尚未自枯草芽孢杆菌分离的代谢物。在一些实施形式中，在通过离心发酵液以制备无细胞制剂之后，该代谢物可通过大小排除过滤加以纯化，诸如Sephadex树脂包括LH-20、G10、G15和G25，以根据分子量阀值将代谢物分成不同组分，诸如小于约2000道尔顿、小于约1500道尔顿、小于约1000道尔顿等的分子量，因为脂肽类是介于800道尔顿至1600道尔顿。

上述用于配制发酵液的浓缩方法及干燥技术亦可被应用于代谢物。

本发明的组合物可包括添加于包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中的配制惰性剂，以促进效果、稳定性和利用性，和/或有利于加工、包装及终端使用应用。这种配制惰性剂及成分可包括载体、稳定剂、营养素或物理性质调整剂，它们可被个别或组合添加。在一些实施形式中，所述载体可包括液体材料诸如水、油及其它有机或无机溶剂及固体材料诸如矿物质、聚合物或经生物衍生或通过化学合成的聚合物复合物。在一些实施形式中，所述载体是有利于该组合物粘附至植物部分诸如种子或根的结合剂或粘着剂。见例如Taylor,A.G.,et al.,“Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments”Annu.Rev.Phytopathol.28:321-339（1990）。该稳定剂可包括防结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或保藏剂。该营养素可包括碳、氮、及磷的来源诸如糖类、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸及磷酸盐。该物理性质调整剂可包括增量剂、润湿剂、增稠剂、pH调整剂、流变改性剂、分散剂、佐剂、界面活性剂、抗冻剂或色素。在一些实施形式中，所述由发酵的生产的包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物可不加任何其它配制制剂而直接与作为稀释剂的水或不与水一起使用。在一些实施形式中，所述配制惰性剂是在浓缩发酵液之后及在干燥期间和/或干燥之后添加。

在一些实施形式中，本发明的组合物用于处理广泛种类的农业和/或园艺作物，包括这些为了种子、生产、造景而生长的作物及这些为了生产种子而生长的作物。可利用本发明的组合物处理的代表性植物包括但不限于下列：芸苔属、鳞茎蔬菜、谷物类、柑橘、棉花、瓜类、果菜类蔬菜、叶菜类蔬菜、豆类、油籽作物、花生、仁果类水果、根茎蔬菜、块茎蔬菜、球茎蔬菜、核果类水果、烟草、草莓及其它莓类、及各种观赏植物。

本发明的组合物可作为叶面喷洒、作为种子/根/块茎/根茎/鳞茎/球茎/插条处理和/或作为土壤处理施用。该种子/根/块茎/根茎/鳞茎/球茎/插条可在种植前、种植期间或种植后处理。当用来作为种子处理时，本发明的组合物以大约1×10²至约1×10⁷cfu/种子的施用率施用，取决于该种子的大小而定。在一些实施形式中，所述施用率是约1×10³至约1×10⁶cfu/种子。当用来作为土壤处理时，本发明的组合物可经施用以用于土壤表面浇淋、长柄插入、注射、和/或施用于犁沟或与灌溉用水混合。浇淋土壤处理可在种植、播种期间、播种之后、移栽之后、或植物生长的任何阶段施用，该施用率是约每亩（acre）4×10¹¹至约8×10¹²cfu。在一些实施形式中，所述施用率是约每亩1×10¹²至约6×10¹²cfu。在一些实施形式中，所述施用率是约每亩6×10¹²至约8×10¹²cfu。在种植时施用于犁沟处理的施用率是约每1000行英尺（row feet）2.5×10¹⁰至约5×10¹¹cfu。在一些实施形式中，所述施用率是约每1000行英尺6×10¹⁰至约4×10¹¹cfu。在其它实施形式中，所述施用率是约每1000行英尺3.5×10¹¹至约每1000行英尺5×10¹¹cfu。本领域的技术人员将知道如何调整施用率以用于撒施处理（其中施用率较低但较常施用）及其它较不常用的土壤处理。

本发明的组合物可与其它化学及非化学添加剂、佐剂和/或处理混合，其中这种处理包括但不限于化学及非化学杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂及类似物。在一些实施形式中，本发明的组合物还包含杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂及类似物。在其它实施形式中，本发明的组合物与其它处理轮流施用，例如作为喷洒程序的一部分。在还有的其它实施形式中，本发明的组合物与其它处理在相同的时间施用至植物。

在其中所述组合物用于控制植物疾病和/或促进植物健康的一些实施形式中，所述组合物与含有至少一种杀菌剂的处理程序混合、还包含含有至少一种杀菌剂的处理程序、或与含有至少一种杀菌剂的处理程序同时施用、或作为含有至少一种杀菌剂的处理程序的一部分施用。常用的杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞素类、羧酰胺类、磺酰替苯胺类、苯基磺酰胺类、唑类、氮杂环类、二羧酰亚胺类、邻苯二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、甲脒类、抗生素、芳香族类、胍类、有机氯化合物类、有机金属类、有机磷化合物类、硝苯基化合物类、硫杂环基化合物类、脲类、无机物类及其它（例如苯并丙烯酸（benzamacril）、香芹酮（carvone）、植物精油提取物、雪松叶油、苦楝油、氯化苦、DBCP、肼菌酮、敌磺钠（fenaminosulf）、梅兹式隆（metzoxolon）、奥索利酸（oxolinic acid）、螺环菌胺（spirox胺）、霜脲氰（cymoxanil）、苯菌酮（metrafenone）、调环酸钙（prohexadione calcium），噻菌腈（thicyofen）、狄森（dithane）、百菌清（chlorothalanil）、双氯酚（dichlorophen）、氯硝胺（dicloran）、酞菌酯（nitrothal-isopropyl）、溴硝醇（bronopol）、二苯胺、米多霉素（mildiomycin）、喹啉铜（oxin-copper）、环氟菌胺（cyflufenamide）（例如N-（环丙基甲氧亚氨基-（6-二氟甲氧基-2,3-二氟苯基）-甲基）-2-苯基乙酰胺）、UK-2A（自链霉菌517-02分离的抗生素）、RANMAN^TM（石原产业株式会社），和基于微生物的制品包括但不限于基于枯草芽孢杆菌的制品、基于短小芽孢杆菌的制品（诸如这些基于短小芽孢杆菌QST2808^TM的制品，它们可购自AgraQuest公司为或）及基于链霉菌的制品（诸如基于链霉菌AQ4800^TM的制品）。AQ4800^TM（AgraQuest）、及（AgraQuest）的详细信息可见于美国专利第6,524,577、6,852,317、6,245,551、6,586,231及6,635,245号。此处所引用的各个专利、专利公开资料以参照方式整体纳入此处，包括为它们的一部分的所有图式/照片。

嗜球果伞素类包括但不限于嘧菌酯（azoxystrobin）、醚菌胺（dimoxystrobin）、烯肟菌酯（enestroburin）、氟嘧菌酯（fluoxastrobin）、醚菌酯（kresoxim-methyl）、苯氧菌胺（metominostrobin）、啶氧菌酯（picoxystrobin）、唑菌胺酯（pyraclostrobin）、唑菌酯（pyroxastrobin）、肟菌酯（trifloxystrobin）、肟醚菌胺（orysastrobin）、甲基（2-氯-5-[1-（3-甲基苯甲基氧基亚氨基）-乙基]苯甲基）-氨基甲酸酯、甲基（2-氯-5-[1-（6-甲基吡啶-2-基甲氧基亚氨基）乙基]苯甲基）氨基甲酸酯、甲基2-（邻-（2,5-二甲基苯氧基亚甲基）苯基）-3-甲氧基丙烯酸酯、2-（2-（6-（3-氯-2-甲基-苯氧基）-5-氟-嘧啶-4-基氧基）苯基）-2-甲氧基亚氨基-N-甲基-乙酰胺3-甲氧基-2-（2-（N-（4-甲氧基苯基）-环丙烷羧亚胺酰基硫烷基甲基）-苯基）-丙烯酸甲酯。

羧酰胺类包括但不限于羧酰苯胺类（例如拜赛芬（bixafen）、啶酰菌胺（boscalid）、萎锈灵（carboxin）、环酰菌胺（fenhexamid）、呋吡菌胺（furametpyr）、吡唑萘菌胺（isopyrazam）、亚汰尼（isotianil）、噻菌胺（metsulfovax）、氧化萎锈灵（oxycarboxin）、吡喃灵（pyracarbolid）、吡噻菌胺（penthiopyrad）、噻达新（sedaxane）（消旋顺式及反式异构物）、噻氟菌胺（thifluzamide）、噻酰菌胺（tiadinil）、N-（4′-溴联苯-2-基）-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-羧酰胺、N-（4′-三氟甲基-联苯-2-基）-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-羧酰胺、N-（4′-氯-3′-氟联苯-2-基）-4-二氟-甲基-2-甲基噻唑-5-羧酰胺、N-（3′,4′-二氯-4-氟联苯-2-基）-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、N-（2-（1,3-二甲基丁基）-苯基）-1,3-二甲基-5-氟-1H-吡唑-4-羧酰胺、N-（4′-氯-3′,5-二氟联苯-2-基）-3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑,-4-羧酰胺、N-（4′-氯-3′,5-二氟联苯-2-基）-3-三氟甲基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酰胺、N-（3′,4′-二氯-4-氟联苯-2-基）-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、N-（4′-（3,3-二甲基丁炔-1-基）-1,1′-联苯-2-基）-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、N-（4′-（3,3-二甲基丁炔-1-基）-1,1′-联苯-2-基）-3-三氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、N-（4′-（3,3-二氟丁炔-1-基）-1,1′-联苯-2-基）-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、N-（4′-（3,3-二氟丁炔-1-基）-1,1′-联苯-2-基）-3-三氟甲基-1-甲基吡唑-4-羧酰胺、2-氯-N-（4′-（3,3-二甲基丁炔-1-基）-1,1′-联苯-2-基）-3-吡啶羧酰胺、N-（2-氰基苯基）-3,4-二氯异噻唑-5-羧酰胺、N-（顺式-2-双环丙基-2-基-苯基）-3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酰胺、N-（反式-2-双环丙基-2-基苯基）-3-二氟甲基-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酰胺、苯霜灵（benalaxyl）、甲霜灵（metalaxyl）、精甲霜灵（mefenoxam）、呋酰胺（ofurace）及噁霜灵（oxadixyl））、羧酰基吗啉（例如烯酰吗啉（dimethomorph）及氟吗啉（flumorph））、苯甲酰胺类（例如苯并异羟肟酸，氟酰菌胺（flumetover）、氟吡菌胺（fluopicolide）、氟吡菌酰胺（fluopyram）、替欧斯密（tioxymid）、水杨菌胺（trichlamide）、氰菌胺（zarilamide））、N-丙酮基苯甲酰胺类（包括苯酰菌胺（zoxamide）及其它于美国专利第5,304,572号中所描述和/或主张权利的相关化合物、及N-（3-乙基-3,5-5-三甲基-环己基）-3-甲酰基-氨基-2-羟基苯甲酰胺）、苯甲酰苯胺类（例如麦锈灵（benodanil）、氟酰胺（flutolanil）、邻酰胺（mebenil）、灭绣胺（mepronil）、水杨苯胺（salicylanilide）及叶枯酞（tecloftalam））、糠苯胺类（furanilide）（例如甲呋酰胺（fenfuram）、呋霜灵（furalaxyl）、二甲呋酰胺（furcarbanil）、及呋菌胺（methfuroxam））、呋喃甲酰胺类（furamide）（例如环菌胺（cyclafuramid）、及拌种胺（furmecyclox））、烟酰胺类（例如2-氯-N-（1,1,3-三甲基-二氢茚-4-基）-烟酰胺、N-（1-（5-溴-3-氯-吡啶-2-基）乙基）-2,4-二氯-烟酰胺、2-氨基-4-甲基-噻唑-5-羧酰胺、及N-（（5-溴-3-氯吡啶-2-基）-甲基）-2,4-二氯-烟酰胺）、磺酰胺（例如N-（4-氯-2-硝苯基）-N-乙基-4-甲基-苯磺酰胺）、吡噻菌胺（penthiopyrad）、吡唑萘菌胺（isopyrazam）、1-甲基-吡唑-4-基羧酰胺、及其它羧酰胺类（例如双胺灵（chloraniformethan）、环丙酰菌胺（carpropamid）、环氟苄酰胺（cyflufenamid）、双氯氰菌胺（diclocymet）、噻唑菌胺（ethaboxam）、稻瘟酰胺（fenoxanil）、双炔酰菌胺（mandipropamid）、硅噻菌胺（silthiofam）、N-（2-（4-[3-（4-氯苯基）丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基）乙基）-2-甲烷磺酰氨基-3-甲基-丁酰胺、氧四环素、N-（2-（4-[3-（4-氯苯基）丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基）乙基）-2-乙烷-磺酰氨基-3-甲基丁酰胺、N-（6-甲氧基-吡啶-3-基）环丙烷羧酸酰胺）。

磺酰替苯胺包括但不限于磺菌胺类（flusulfamides）。

苯基磺酰胺类包括但不限于抑菌灵（dichlofuanid）及甲苯氟磺胺（tolyfluanid）。

唑类包括但不限于三唑类（例如阿扎康唑（azaconazole）、联苯三唑醇（bitertanol）、糠菌唑（bromuconazole）、环丙唑醇（cyproconazole）、苯醚甲环唑（difenoconazole）、烯唑醇（diniconazole）、达克利（diniliconazole-M）、恩康唑（enilconazole）、氟环唑（epoxiconazole）、乙环唑（etaconazole）、腈苯唑（fenbuconazole）、氟硅唑（flusilazole）、三氟苯唑（fluotrimazole）、氟喹唑（fluquinconazole）、粉唑醇（flutriafol）、呋菌唑（furconazole）、呋醚唑（furconazole-cis）、己唑醇（hexaconazole）、亚胺唑（imibenconazole）、种菌唑（ipconazole）、叶菌唑（metconazole）、腈菌唑（myclobutanil）、多效唑（paclobutrazol）、戊菌唑（penconazole）、丙环唑（propiconazole）、丙硫菌唑（prothioconazole）、氯苯喹唑（quinconazole）、硅氟唑（simeconazole）、戊唑醇（tebuconazole）、四氟醚唑（tetraconazole）、三唑醇（triadimenol）、三唑酮（triadimefon）、叶锈特（triazbutil）、灭菌唑（triticonazole）、烯效唑（uniconazole）、1-（4-氯苯基）-2-（[1,2,4]三唑-1-基）-环庚醇、及吲唑磺菌胺（amisulbrom））、咪唑类（例如咪菌酮（climbazole）、克霉唑（clotrimazole）、氰霜唑（cyazofamid）、咪菌腈（fenapanil）、果绿啶（glyodin）、抑霉唑（imazalil）、恶咪唑（oxpoconazole）、稻瘟酯（pefurazoate）、咪鲜胺（prochloraz）、咪唑嗪（triazoxide）、氟菌唑（triflumizole）、及2-氯-5-（（4-氯-2-甲基-5-（2,4,6-三氟苯基））咪唑-1-基）吡啶）、苯并咪唑类（例如苯菌灵（benomyl）、多菌灵（carbendazim）、氯苯咪唑（chlofenazole）、氰菌灵（cypendazole）、咪菌威（debacarb）、麦穗宁（fuberidazole）、苯并威（mercarbinizid）、烯丙异噻唑（rabenazole）、及噻苯达唑（thiabendazole））、唑并嘧啶类（例如5-氯-7-（4-甲基-哌啶-1-基）-6-（2,4,6-三氟苯基）-[1,2,4]-三唑并-[1,5a]-嘧啶、6-（3,4-二氯苯基）-5-甲基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、6-（4-叔丁基苯基）-5-甲基[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-甲基-6-（3,5,5-三甲基己基）[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-甲基-6-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-乙基-6-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-2,7-二胺、6-乙基-5-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-乙基-6-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-乙基-6-（3,5,5-三甲基己基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、6-辛基-5-丙基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、5-甲氧甲基-6-辛基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、6-辛基-5-三氟甲基-[1,2,4]-三唑并[1,5-a]-嘧啶-7-基胺、5-三氟甲基-6-（3,5,5-三甲基己基）-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶-7-基胺、及2-丁氧基-6-碘-3-丙基色-4-酮）、及其它唑类（例如苯噻菌脲（bentaluron）、土菌灵（etridiazole）及噁霉灵（hymexazole））。

氮杂环类包括但不限于吡啶类（例如丁硫啶（buthiobate）、双吡硫翁（dipyrithone）、氟啶胺（fluazinam）、啶菌腈（pyridinitril）、啶斑肟（pyrifenox）、吡氯灵（pyroxychlor）、氯吡呋醚（pyroxyfur）、2,3,5,6-四氯-4-甲磺酰基吡啶、3,4,5-三氯-吡啶-2,6-二-腈、及3-[5-（4-氯苯基）-2,3-二甲基异恶唑啶-3-基]吡啶）、嘧啶类（例如乙嘧酚磺酸酯（bupirimate）、嘧菌环胺（cyprodinil）、氟嘧菌胺（diflumetorim）、二甲嘧酚（dimethirimol）、乙嘧酚（ethirimol）、嘧菌腙（ferimzone）、氯苯嘧啶醇（fenarimol）、嘧菌胺（mepanipyrim）、氟苯嘧啶醇（nuarimol）、嘧菌醇（triarimol）、及嘧霉胺（pyrimethanil））、哌嗪（例如嗪胺灵（triforine））、哌啶类（例如苯锈啶（fenpropidin）及病花灵（piperalin））、吡咯类（例如咯菌腈（fludioxonil）及拌种咯（fenpiclonil））、吗啉类（例如十二吗啉（aldimorph）、抑菌啉（benzamorph）、十二环吗啉（dodemorph）、丁苯吗啉（fenpropimorph）、及十三吗啉（tridemorph））、三氯甲基吡啶（nitrapyrin）、喹啉类（例如乙氧喹啉（ethoxyqquin）、丙烯酸喹啉酯（halacrinate）、8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline sulfate）、喹烯酮（quinacetol）、及苯氧喹啉（quinoxyfen））、醌类（例如醌肟腙（benquinox）、四氯对醌（chloranil）、二氯萘醌（dichlone）、及二氰蒽醌（dithianon））、喹喔啉类（quinoxaline）（例如灭螨猛（chinomethionat）、四氯喹恶啉（chlorquinox）、及克杀螨（thioquinox））、及其它氮杂环类（例如活化酯（acibenzolar-S-methyl）、敌菌灵（anilazine）、哒菌清（diclomezine）、咪唑菌酮（fenamidone）、氟噻菌净（flutianil）、辛噻酮（octhilinone）、烯丙苯噻唑（probenazole）、丙氧喹啉（proquinazid）、咯喹酮（pyroquilon）、氟噻亚菌胺（thiadifluor）、三环唑（tricyclazole）、N,N-二甲基-3-（3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基）-[1,2,4]三唑磺酰胺、3-（4-氯苯基）-1-（2,2,2-三氟乙基）-1,2,4-三嗪-6（1H）-酮、3-（4-氯苯基）-1-（2,2,2-三氟乙基）-4,5-二氢-1,2,4-三嗪-6（1H）-酮、6-（4-氯苯基）-2-（2,2,2-三氟乙基）-1,2,4-三嗪-3（1H）-酮、6-（4-氯苯基）-2-（2,2,2-三氟乙基）-4,5-二氢-1,2,4-三嗪-3（1H）-酮。

二甲酰亚胺类包括但不限于乙菌利（chlozolinate）、菌核利（dichlozoline）、异菌脲（iprodione）、异酰菌酮（isovaledione）、甲菌利（myclozolin）、腐霉利（procymidone）、乙烯菌核利（vinclozolin）、恶唑菌酮（famoxadone）、及氟氯菌核利（fluoroimide）。

邻苯二甲酰亚胺类包括但不限于敌菌丹（captafol）、克菌丹（captan）、灭菌磷（ditalimfos）、灭菌丹（folpet）、及硫氯苯亚胺（thiochlorfenphim）。

氨基甲酸酯类包括但不限于乙霉威（diethofencarb）、苯噻菌胺（flubenthiavalicarb）、异丙菌胺（iprovalicarb）、霜霉威（propamocarb）、呋甲硫菌灵（furophanate）、甲基硫菌灵（thiophanate methyl）、3-（4-氯苯基）-3-（2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基氨基）-丙酸酯、4-氟苯基N-（1-（1-（4-氰苯基）乙烷磺酰基）-丁-2-基）氨基甲酸酯、及3-碘-2-丙炔基丁基氨基甲酸酯（爱得宝（iodocarb））。

硫代氨基甲酸酯类包括但不限于磺菌威（methasulfocarb）及硫菌威（prothiocarb）。

二硫代氨基甲酸酯类包括但不限于阿斯福美双（azthiram）、吗菌威（carbamorph）、硫杂灵（cufraneb）、福美铜氯（cuprobam）、棉隆（dazomet）、双硫仑（disulfuram）、福美铁（ferbam）、代森锰锌（mancozeb）、代森锰（maneb）、代森环（milneb）、代森联（metiram）、威百亩（metam）、代森钠（nabam）、丙森锌（propineb）、福美双联（tecoram）、塞仑（thiram）、代森锌（zineb）、及福美锌（ziram）。

甲脒类包括但不限于N′-（4-（4-氯-3-三氟甲基-苯氧基）-2,5-二甲基苯基）-N-乙基-N-甲基甲脒、N′-（4-（4-氯-3-三氟甲基苯氧基）-2,5-二甲基-苯基）-N-乙基-N-甲基甲脒、N′-（2-甲基-5-三氟甲基-4-（3-三甲基-硅烷基-丙氧基）苯基）-N-乙基-N-甲基甲脒、及N′-（5-二氟甲基-2-甲基-4-（3-三甲基-硅烷基丙氧基）苯基）-N-乙基-N-甲基甲脒。

抗生素包括但不限于金色制霉素（aureofungin）、灭瘟素（blasticidin-s）、灰黄霉素（griseofulvin）、春雷霉素（kasugamycin）、那他霉素（natamycin）、多抗霉素（polyoxin）、保粒霉素（polyoxorim）、链霉素（streptomycin）、及有效霉素（validamycin A）。

芳香族类包括但不限于联苯（biphenyl）、地茂散（chloroneb）、及甲酚（cresol）。

胍类包括但不限于多果定（dodine）、双胍辛胺乙酸盐（iminoctadine triacetate）、双八胍盐（iminoctadine tris（albesilate））、及双胍辛乙酸盐（guazatine acetate）。

有机氯化合物类包括但不限于硫氯酚（bithionol）、百菌清（chlorothalonil）、四氯苯酞（phthalide）、六氯苯（hexachlorobenzene）、戊菌隆（pencycuron）、五氯酚（pentachlorophenol）、全氯环己-2-烯-1-酮、及五氯硝基苯（quintozene）（PCNB）。

有机金属类包括但不限于三苯锡（fentin）盐类、癸磷锡（decafentin）、及三丁基氧化锡。

有机磷化合物类包括但不限于氨丙磷酸（ampropylfos）、敌瘟磷（edifenphos）、种衣酯（fenitropan）、三乙膦酸（fosetyl）、三乙膦酸铝（fosetyl-aluminum）、己硫磷（hexylthiofos）、异稻瘟净（iprobenfos）、氯瘟磷（phosdiphen）、威菌磷（triamphos）、吡菌磷（pyrazophos）、甲基立枯磷（tolclofos-methyl）、亚磷酸及其盐类。

硝苯基化合物类包括但不限于乐杀螨（binapacryl）、氯二硝基萘、氯硝胺（dichloran）、二硝巴豆酸酯（dinocap）、消螨通（dinobuton）、敌螨普（meptyldinocap）、二硝酯（dinocton）、硝戊酯（dinopenton）、硝辛酯（dinosulfon）、硝丁酯（dinoterbon）、DNOC、戊苯砜（sultropen）、及四氯硝基苯（tecnazene）（TCNB）。

硫杂环基化合物类包括但不限于稻瘟灵（isoprothiolane）及二氰蒽醌（dithianon）。

脲类包括但不限于戊菌隆（pencycuron）及奎纳斯米（quinazimid）。

无机物杀真菌剂包括但不限于波尔多液（Bordeaux）混合物、醋酸铜、氢氧化铜、氧化铜、王铜、碱式硫酸铜、硫、碳酸氢钠、及碳酸氢钾。

在一些其中所述组合物被用于促进植物健康的实施形式中，所述组合物与至少一种肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂及类似物混合或另外包含上列的至少一个，该组合物在以下被称为植物健康组合物。

植物健康组合物/化合物包含一或多种能维持和/或促进植物健康的天然或合成的物质或生物有机体的组合物/化合物。该组合物/化合物可促进植物健康、活力、生产性、花及果实的品质、和/或刺激、维持或增进植物对生物和/或非生物性刺激/压力的抗性。

传统的植物健康组合物和/或化合物包括但不限于植物生长调节剂（即植物生长刺激剂、植物生长调节组合物、植物生长调节剂、植物生长调节物）及植物活化剂（即植物活化剂、植物增强剂、害虫控制剂）。在本发明中的植物健康组合物可为天然或合成的。

植物生长调节剂包括但不限于肥料、除草剂、植物激素、细菌接种剂及其衍生物。

肥料是通常提供不同比例的三种主要植物营养素（氮、磷、钾，通常缩写为N-P-K）、或次要植物营养素（钙、硫、镁）、或在植物或动物营养上有作用的微量元素（或微量营养素）（硼、氯、锰、铁、锌、铜、钼及（在一些国家中）硒的组合物。肥料可为有机或无机。天然发生的有机肥料包括但不限于粪肥、蚯蚓粪、泥煤苔、海草、污水及鸟粪。覆盖作物亦作为绿肥生长以经由在根上的细菌根瘤的大气固氮作用富集土壤以及土壤的（经由营养转移）磷含量。天然来源的加工有机肥料包括堆肥（绿色废弃物）、血粉及骨粉（来自有机肉生产场）及海草提取物（藻酸盐及其它）。肥料亦可根据它们在植物干燥物质中的浓度被分成多量元素及微量元素。多量元素在植物组织中被大量消耗且通常以整数或数十百分比（的干燥物质重量基础）存在，包括氮（N）、磷（P）及钾（K）三种主要成分（当元素被故意地混合时被称为N-P-K肥料或复合肥）。有许多种微量元素，所需的浓度介于5至100百万分之一（ppm）的质量。植物微量元素包括铁（Fe）、锰（Mn）、硼（B）、铜（Cu）、钼（Mo）、镍（Ni）、氯（Cl）、及锌（Zn）。

植物激素（即植物激素）及其衍生物包括但不限于诱抗素（abscisic acid）、植物生长素、细胞激活素（cytokinins）、赤霉素（gibberellins）、油菜素内酯（brassinolides）、水杨酸、茉莉酮酸酯、植物肽激素、多胺、一氧化氮及独角金内酯（strigolactones）。

植物活化剂是可刺激、维持或增强植物对生物和/或非生物刺激/压力的抗性的天然或合成物质，包括但不限于活化酯（acibenzolar）、烯丙苯噻唑（probenazole）、异噻菌胺（isotianil）、水杨酸、壬二酸（azelaic acid）、恶霉灵（hymexazol）、油菜素内酯（brassinolide）、调吡脲（forchlorfenuron）、苯并噻二唑（benzothiadiazole）（例如50WG）、微生物或源自微生物的激发子。更多植物活化剂描述于美国专利号6,849,576、5,950,361、6,884,759、5,554,576、6,100,092、6,207,882、6,355,860、5,241,296、6,369,296、5,527,783、及6,987,130中。

微生物或源自微生物的化学化合物及肽/蛋白质（例如激发子）亦可被用来作为植物活化剂。非限制性示范的激发子：分支-β-聚葡萄糖、几丁质寡聚体、溶果胶酶、与酶活性无关的激发子活性（例如内切木聚醣酶、激发素、PaNie）、avr基因产物（例如AVR4、AVR9）、病毒蛋白质（例如病毒胞衣蛋白、过敏素（Harpin））、鞭毛素、蛋白质或肽毒素（例如维多利素）、糖蛋白、转化酶的糖肽片段、丁香交酯、Nod因子（脂质几丁寡糖）、FAC（脂肪酸氨基酸共轭物）、麦角甾醇、细菌毒素（例如冠菌素）、及二氢神经鞘胺醇类似物霉菌毒素（例如伏马毒素B1）。更多激发子描述于Howe et al.,PlantImmunity to Insect Herbivores,Annual Review of Plant Biology,2008,vol.59,pp.41-66、Stergiopoulos,Fungal EffectorProteins Annual Review of Phytopathology,2009,vol.47,pp.233-263、及Bent et al.,Elicitors,Effectors,and R Genes:TheNew Paragigm and a Lifetime Supply of Questions,Annual Reviewof Plant Biology,2007,vol.45,pp.399-436。

更多非限制性示范的植物健康组合物/化合物描述于下列美国专利：4,751,226、4,889,551、4,456,467、5,763,366、4,219,351、4,394,151、4,913,725、RE33976、4,959,093、6,645,916、4,152,429、4,462,821、4,704,160、3,979,201、4,505,736、4,422,865、5,919,448、4,431,442、4,824,473、4,185,990、5,837,653、4,701,207、4,717,732、4,716,174、4,720,502、4,717,734、6,261,996、4,701,463、4,728,657、4,636,514、4,717,733、4,731,372、5,168,059、4,261,730、5,861,360、4,066,435、4,210,439、5,006,148、4,906,280、4,160,660、4,439,224、5,123,951、4,094,664、4,902,815、4,036,629、4,534,785、4,212,664、4,880,622、4,144,047、4,336,060、4,308,054、4,515,618、4,525,200、4,579,582、5,554,580、4,840,660、4,268,299、4,534,786、5,589,438、4,596,595、5,468,720、6,083,882、6,306,797、4,226,615、4,509,973、RE29439、4,025,331、6,242,381、4,326,878、4,259,104、5,518,994、5,446,013、3,713,805、4,75,5213、4,397,678、4,762,549、6,984,609、4,808,207、4,943,310、4,481,026、7,270,823、4,592,772、5,346,879、5,627,134、4,439,225、4,931,082、4,554,010、4,057,413、4,072,495、4,364,768、7,544,821、5,523,275、5,525,576、7,404,959、4,619,685、4,157,255、5,688,745、6,569,809、4,606,756、4,537,623、5,965,488、4,243,405、4,978,386、5,654,255、5,849,666、7,078,369、6,884,758、5,076,833、6,649,568、4,954,157、4,519,163、4,154,596、4,246,020、4,356,022、4,093,664、4,808,209、4,726,835、4,879,291、4,776,874、4,892,576、4,859,231、4,130,409、4,530,715、4,936,907、4,964,894、4,921,529、4,494,982、5,228,899、4,992,093、4,059431、4,765,823、4,059,432、4,969,948、6,750,222、4,171,213、5,668,082、4,672,112、4,067,722、4,732,605、5,481,034、5,015,283、4,812,159、3,905,799、4,371,388、4,427,436、4,293,331、3,979,204、5,436,225、6,727,205、4,148,624、4,737,498、3,938,983、5,656,571、4,863,505、4,227,918、4,595,406、4,976,771、4,857,545、4,999,043、3,960,539、5,617,671、3,912,492、4,217,129、4,170,462、4,486,219、5,801,123、5,211,738、4,067,721、5,854,179、4,285,722、5,510,321、6,114,284、4,588,435、7,005,298、4,504,304、4,451,281、3,940,414、5,925,596、6,331,506、4,391,629、5,006,153、4,857,649、5,922,646、5,922,599、5,709,871、4,741,768、4,723,984、4,752,321、5,741,521、5,700,760、4,888,048、4,113,463、5,086,187、4,711,658、4,960,453、4,846,883、4,959,097、5,371,065、4,620,867、5,154,751、4,090,862、6,906,006、4,292,072、4,349,377、4,586,947、4,239,528、6,284,711、4,043,792、6,939,831、5,030,270、4,844,730、6,410,483、5,922,648、6,069,114、6,861,389、4,806,143、4,886,544、4,923,502、6,071,860、5,131,940、4,193,788、RE31550、4,127,402、4,799,950、4,963,180、4,337,080、4,637,828、4,525,203、4,391,628、4,908,353、4,560,738、4,685,957、5,637,554、5,312,740、3,985,541、4,770,692、4,787,930、4,240,823、5,428,002、6,458,746、3,989,525、5,902,772、4,588,821、4,681,900、5,679,621、6,995,015、5,110,345、5,332,717、5,222,595、5,351,831、4,904,296、4,104,052、4,622,064、4,902,332、4,747,869、5,053,072、5,186,736、4,349,378、5,223,017、4,889,946、5,323,906、5,529,976、4,946,493、4,961,775、5,253,759、4,311,514、4,380,626、5,635,451、4,975,112、5,658,854、6,410,482、7,479,471、5,015,284、4,925,480、4,638,004、4,124,369、5,039,334、5,090,992、5,710,104、4,909,832、4,744,817、4,764,202、4,668,274、4,547,214、4,808,213、4,507,140、4,904,298、6,316,388、6,265,217、5,869,424、5,110,344、4,330,322、5,292,533、4,047,923、4,764,624、4,560,403、4,557,754、5,346,068、4,770,688、5,073,185、4,973,690、4,772,309、4,911,746、4,594,094、4,518,415、4,786,312、7,198,811、6,376,425、4,895,589、4,960,456、4,897,107、4,891,057、4,102,667、5,763,495、4,606,753、4,602,929、4,740,231、4,812,165、5,324,710、5,701,699、6,465,394、5,783,516、4,334,909、5,466,460、5,559,218、4,678,496、5,679,620、5,977,023、7,326,826、4,729,783、4,377,407、4,602,938、5,211,736、5,106,409、4,802,909、4,871,387、4,846,873、4,936,892、5,714,436、6,239,071、4,507,141、4,936,901、5,026,418、4,734,126、4,999,046、4,554,017、4,554,007、4,943,311、4,401,458、5,419,079、4,789,394、4,871,389、5,198,254、5,747,421、5,073,187、5,258,360、4,153,442、4,808,722、4,565,875、5,298,480、4,233,056、4,849,007、5,112,386、5,221,316、5,470,819、4,614,534、4,615,725、5,496,794、4,772,310、4,640,706、4,894,083、6,767,865、5,022,916、4,797,152、4,957,535、4,880,457、4,735,651、5,160,364、4,647,302、4,818,271、5,710,103、6,508,869、5,858,921、4,599,448、4,938,791、4,491,466、4,812,162、7,427,650、4,684,396、4,201,565、4,636,247、4,925,482、4,486,218、6,570,068、5,045,108、4,336,059、4,983,208、4,954,162、4,921,528、4,826,531、4,661,145、4,935,049、4,515,619、4,810,283、4,988,382、4,584,008、4,227,915、4,875,922、4,988,383、4,886,545、5,602,076、4,229,442、4,525,201、5,034,052、5,104,443、3,620,919、4,164,405、5,703,016、5,102,443、4,618,360、6,569,808、4,919,704、4,584,013、4,775,406、5,631,208、4,909,835、4,178,166、4,183,742、6,225,260、5,318,945、4,623,382、5,053,073、4,693,745、4,875,930、5,696,053、4,221,584、4,975,459、4,601,746、4,185,991、4,871,390、4,863,503、5,073,184、5,262,389、5,061,311、4,966,622、6,228,808、5,057,146、4,849,009、4,939,278、4,481,365、4,333,758、4,741,754、4,411,685、4,455,162、7,291,199、5,252,542、4,470,840、4,227,911、4,959,093、及5,123,951。此处所引用的各个专利、专利公开资料以参照方式整体纳入此处，包括为它们的一部分的所有图式/照片。

细菌接种剂包含通常在种植时用于接种土壤的有益菌的组合物。这种细菌接种剂包括固氮细菌或根瘤菌。大豆慢生型根瘤菌（Bradyrhizobia japonicum）通常用于大豆接种，豇豆慢生型根瘤菌（Bradyrhizobia Vigna））或花生慢生型根瘤菌（BradyrhizobiaArachis））用于花生。其它根瘤菌可用于其它作物：豌豆根瘤菌（Rhizobium leguminosarum）用于豌豆、扁豆、豆类、苜蓿及三叶草，百脉根根瘤菌（Rhizobium loti）、豌豆根瘤菌及慢生型根瘤菌属用于各种豆科植物。在一实施形式中，本发明的组合物与至少一种细菌接种剂混合或还包含至少一种细菌接种剂，且接着被施用至土壤或种子。在另一实施形式中，所述组合物及细菌接种剂同时或依序施用至植物、植物部分或植物或植物部分的所在地。

在一些实施形式中，本发明的组合物与杀昆虫剂混合、还包含杀昆虫剂、或与杀昆虫剂同时施用、或作为杀昆虫剂喷洒程序的一部分施用。适当的杀昆虫剂包括新烟碱类杀昆虫剂诸如1-（6-氯-3-吡啶甲基）-N-硝基咪唑烷-2-亚基胺（吡虫啉（imidacloprid））、3-（6-氯-3-吡啶甲基）-1,3-噻唑烷-2-亚基氰酰胺（噻虫啉（thiacloprid））、1-（2-氯-1,3-噻唑-5-基甲基）-3-甲基-2-硝基胍（噻虫胺（clothianidin））、烯啶虫胺（nitempyran）、N.sup.1-[（6-氯-3-吡啶）甲基]-N.sup.2-氰-N.sup.1-甲基乙脒（啶虫脒（acetamiprid））、3-（2-氯-1,3-噻唑-5-基甲基）-5-甲基-1,3,5-恶二井-4-亚基（-硝基）胺（噻虫嗪（thiamethoxam））、及1-甲基-2-硝基-3-（四氢-3-呋喃甲基）胍（呋虫胺（dinotefuran））。

在其中所述组合物用于控制线虫的一些实施形式中，所述组合物还包含至少一种其它杀线虫剂、或与至少一种其它杀线虫剂混合、或与至少一种其它杀线虫剂同时施用、或作为含有至少一种其它杀线虫剂的处理程序的一部分施用。此处所使用的术语“杀线虫剂”包括线虫控制剂，诸如这些杀灭线虫及这些抑制线虫生长和/或发育的控制剂。所述第二种杀线虫剂可为化学或生物杀线虫剂。此处所使用的术语“化学杀线虫剂”排除烟熏剂，术语“烟熏剂”包含在栽种前施用于土壤及通过土壤（在土壤空气和/或土壤水分中）扩散的广义农药化学品，可作为气体（诸如甲基溴）、挥发性液体（诸如氯化苦）、或挥发性固体（诸如棉隆（dazomet））施用。

在一些实施形式中，所述化学或生物杀线虫剂是可自商业途径获得的配制商品，其与本发明的组合物桶混。在其它实施形式中，所述化学或生物杀线虫剂在配制前与本发明的基于芽孢杆菌的组合物混合，以使这种活性成分最终形成一个经配制的制品。

在这种混合物中使用的化学杀线虫剂是氨基甲酸酯类、肟氨基甲酸酯类及有机磷杀线虫剂。氨基甲酸酯杀线虫剂包括苯菌灵（benomyl）、克百威（carbofuran）、丁硫克百威（carbosulfan）及除线威（cloethocarb）。肟氨基甲酸酯类包括棉铃威（alanycarb）、涕灭威（aldicarb）（或作为先正达（Syngenta）公司的Complete Pak种子处理的部分）、涕灭砜威（aldoxycarb）杀线威（oxamyl）硫双威（thiodicarb）（拜耳作物科学的种子处理系统的一部分）、及环线威（tirpate）。有机磷杀线虫剂包括丰索磷（fensulfothion）灭线磷（ethoprop）除线特（diamidafos）、苯线磷（fenamiphos）、丁硫环磷（fosthietan）、磷胺（phosphamidon）、硫线磷（cadusafos）、毒死蜱（chlorpyrifos）、除线磷（dichlofenthion）、乐果（dimethoate）、噻唑磷（fosthiazate）、速杀硫磷（heterophos）、艾沙米多福（isamidofos）、氯唑磷（isazofos）、甲拌磷（phorate）、磷虫威（phosphocarb）、特丁磷（terbufos）、虫线磷（thionazin）、三唑磷（triazophos）、庄无忌（imicyafos）、及四甲磷（mecarphon）。在各化合物后的括弧内的名称为以上各种化合物的代表性商用配制剂。其它可用于这种混合物中的化学杀线虫剂包括螺虫乙酯（spirotetramat）MON37400杀线虫剂及氟虫腈（fipronil）。

生物性杀线虫剂包括几丁质及尿素混合物；堆肥浸提物及堆肥茶（包括加气及未加气二者）；包含真菌疣孢漆斑菌（Myrotheciumverrucaria）和/或由此而来的代谢物的组合物（如商用的）；包含真菌拟青霉（Paecilomyces）包括淡紫拟青霉（P.lilacinus）的组合物（如商用的或）；细菌巴氏杆菌（Pasteuria）包括杀线虫巴氏杆菌（P.usgae）及包含这种细菌的组合物（如商用的）；芽孢杆菌属的细菌包括坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）（包括CNMC I-1582，于1995年5月29日保藏于法国巴斯德研究所国家微生物菌种保藏中心及例如商用的VOTIVO）、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌（包括在1999年1月14日保藏于NRRL的编号B-30087的菌株及其突变株）及蜡样芽孢杆菌及包含一或多种上述细菌的组合物；杀线虫性链霉菌属诸如利迪链霉菌（Streptomyceslydicus）及包含这种细菌的组合物（如商用的）；及食线虫性真菌，包括嗜线虫真菌（Duddingtonia flagrans）诸如菌株T-89（于GNC VB“Vector”微生物标本（新西伯利亚区Koltsovosettlement）的保藏编号F-882）、淡紫拟青霉、及寡孢子节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）。生物性杀线虫剂亦包括植物性杀线虫剂诸如基于苦楝植物（包括源自植物的种子或油）或印楝素（azidirachtin）的制品、苦楝种子的二次代谢产物、芝麻油类制品（诸如）、香芹酚（carvacrol）、及基于植物提取物的制品（诸如得自智利皂树（Quillaja saponaria）的）。生物性杀线虫剂亦包括由细菌产生的经分离的化合物，诸如菌素类（由除虫链霉菌（Streptomyces avermentilis）所生产的化学化合物家族）包括阿维菌素（abamectin）（由阿维菌素B_1a及B_1b的组合组成）及阿维菌素B_2a，及过敏素蛋白质（最初在解淀粉欧文氏菌（Erwiniaamylovora）中识别）包括过敏素_EA及过敏素_αβ。

本发明的基于芽孢杆菌的组合物可被独立施用或与一或多种其它化学及非化学杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂和/或植物健康制品组合施用。在一些实施形式中，所述swrA^-细胞与至少一种杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂和/或植物健康制品一起配制，且该经共配制的制品经施用于植物、植物部分或植物所在地。在一些实施形式中，本发明的组合物与自商业途径获得的杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂和/或植物健康制品的配制剂桶混，且经施用于植物、植物部分和/或植物所在地。在其它实施形式中，本发明的组合物在施用自商业途径获得的杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂和/或植物健康制品的配制剂之前或之后立即施用于植物、植物部分和/或植物所在地。在其它实施形式中，本发明的组合物与自商业途径获得的杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养素、矿物质、植物生长素、生长刺激剂和/或植物健康制品的配制剂轮流施用于植物、植物部分和/或植物所在地。在一实施例中，所述基于枯草芽孢杆菌的组合物作为种子处理或作为犁沟或浇淋处理施用，如在此更详细地说明。在上述实施形式的一些情况中，所述自商业途径获得的杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂的配制剂以低于该产品标示上建议使用该杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂或杀线虫剂作为独立处理时的施用率施用。在此实施形式的一方面中，所述杀真菌剂、杀昆虫剂、杀螨剂和/或杀线虫剂是化学物质。在另一方面，所述化学物质具有毒性疑虑，在一或多个国家中亦可能由相关政府机关予以“逐步废除”。

在其它实施形式中，本发明的组合物在施用烟熏剂后被施用于植物、植物部分和/或植物所在地。烟熏剂可通过长柄注射施用，通常最少在土壤表面以下8英寸。烟熏剂的液体配制剂亦可经由表面滴灌化学灌溉施用以使该烟熏剂到达土壤表面以下8英寸或更深的深度。经处理的土床以塑胶布覆盖以维持该烟熏剂于该土中数天。此在栽种前进行，并使其在栽种前通风。在此描述的基于芽孢杆菌的组合物将于该通风期之后施用，不论在栽种之前、的同时或之后。在一些情况中，所述烟熏剂以低于该产品标示上所建议的施用率施用。

烟熏剂（包括烟熏剂杀线虫剂）包括卤化羟类，诸如氯化苦甲基溴及其组合物（诸如及）、1,3-双氯酚（II、EC、）及1,3-双氯酚与氯化苦的组合（C-17、C-35、及）、碘甲烷异氰酸甲酯释放者诸如甲基二硫代氨基甲酸钠（）、1,3-双氯酚与异氰酸甲酯的组合及二硫化碳释放者诸如四硫代碳酸钠及二甲基二硫化物或DMDS上述各种烟熏剂的商用配制剂在化学名称之后的括弧内提供。

本发明的组合物亦可作为病虫害整合管理（“IPM”）程序的部分施用。这种程序在各种公开资料中描述，特别是由大学合作推广部所发表的文献。在线虫控制方面，这种程序包括以无法作为标靶线虫的宿主的作物轮作、栽培及耕作措施、及使用移栽。举例来说，在此描述的基于芽孢杆菌的组合物可在芥末或其它线虫抑制作物的生长季后施用。

在一些实施形式中，施用本发明的组合物至植物、植物部分或植物所在地之前要先识别需要处理的所在地。以线虫控制而言，该识别可能通过目视观察植物出现褪绿、矮态、枯斑或枯萎（即似乎出现营养缺乏病征），通常再加上知道过去曾有线虫问题、辅以植物采样和/或土壤采样判别。植物采样可在生长季期间或在最后收成之后立即进行。自土壤中取出植物，检查植物的根部以决定该田间的线虫问题的本质及范围。以根结线虫而言，根瘿严重性通过测量该根部系统形成根瘿的比例而定。由根结线虫造成的根瘿可与固氮土壤细菌造成的结节区别，因为根瘿无法轻易地与根部分离。根结线虫在土中的数量随着根瘿严重性增加。在一些情况中，检测到任何程度的根瘿代表栽种任何具易感性的作物（特别是在采样区域或附近）会出现根结线虫的问题。包囊线虫亦可通过植物采样及检视根部的包囊形成加以识别。

土壤采样提供一种测定感染一定量的土壤或根部的线虫和/或线虫卵的数量的方法。土壤采样可在疑似初次发现问题时、最后收成、或在栽种新作物以前的任何时间点包括在前次作物的作物破坏之前进行。大学合作推广程序提供土壤采样服务，包括佛罗里达大学、奥勒冈州立大学及内布拉斯加州林肯分校。此外，这种程序提供如何收集样本的指导。举例来说，在一种收成后预测采样的方法中，以规律的Z字形模式在5或10英亩面积（依作物价值而定，越高价值的作物在越少英亩面积上采样）上的10至20个大田位置自6至10英寸的土壤深度收集样本。在一种测试已建立的植物的方法中，根及土壤样本在土壤深度6至10英寸之处自出现症状但未死亡或濒死（即腐烂）的嫌疑植物取得。

在一些实施形式中，识别涉及决定是否到达病虫害（诸如线虫）的经济阀值，即不处理的预期经济损失超越处理成本的点。该经济阀值依作物、地理、气候、栽种时间、土壤类型、和/或土壤温度而异。数篇关于此议题的文献已被发表，并可自不同地区的大学合作推广程序取得这类指导。见例如Robb,J.G.,et al.,“Factors Affectingthe Economic Threshold for Heterodera schachtii Control inSugar Beet,”Economics of Nematode Control January-June1992、Hafez,Saad L.“Management of Sugar Beet Nematode,”Universityof Idaho Current Information Series（CIS）1071（1998）、及UCIPM Pest Management Guidelines:Tomato UC ANR Publication3470Nematodes A.Ploeg,Nematology,UC Riverside（January2008）。决定特定作物在一年中特定时间的经济阀值是本领域的一般技术人员所熟悉的技艺。

在一些实施形式中，所述土壤采样显示线虫感染将造成约80％、约90％、或约95％的正常未受感染的土壤的产率。

在一些实施形式中，每公斤土壤样本的根结线虫幼虫的经济阀值至少约250只、至少约300只、至少约500只、至少约750只、至少约1000只、至少约2000只、至少约3000只、至少约4000只、至少约5000只、或至少约6000只。

在一些实施形式中，每1cm³土壤中的包囊线虫虫卵及幼虫的经济阀值至少约0.5、至少约1、至少约2、至少约3、至少约4。根据Hafez（1998）（同上），一个包囊预估有500个可存活的虫卵及幼虫。

本发明还包含一种识别和/或生产增进植物生长的细菌制品的方法，该方法通过筛选枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种的细胞，选择具有swrA基因突变的细胞及以具有该swrA^-突变的细胞生产发酵产物。在一些实施形式中，筛选需要接种芽孢杆菌菌株、选择个别细菌菌落、自各菌落分离DNA、及利用根据图5所提供的swrA序列的引物测序该swrA基因。适当的PCR条件将为本领域的一般技术人员所广为周知。示范性引物及PCR条件如实施例24中所述。

在一些实施形式中，在筛选之前先培养该细胞并选择具有下列一或多种特征的细胞：相较于野生型细胞具有砂纸形态或受损的群聚能力。群聚能力可根据实施例7中所述的相同方式测定。

在其它实施形式中，所述选择步骤亦涉及选择这些具有swrA基因突变的细胞，这种细胞相较于野生型细胞具有较强的增进植物健康的能力。在一方面中，此涉及施用该发酵产物至植物、至植物的部分和/或至植物所在地，及对比植物与未施用该发酵产物的参照植物和/或施用源自不具有所述突变的等基因细胞的发酵产物的参照植物的生长。

在另外其它的实施形式中，所述筛选涉及筛选对应SEQ ID NO:1的位置1至3或位置26至34的swrA基因的突变。

该经筛选的swrA^-细胞可能具有此处关于各种swrA突变的说明所述的突变的任一个。

本发明还包含一种筛选增进植物生长的细菌制品的方法，该方法包含（i）使源自枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种的细菌细胞的野生型swrA基因突变以产生突变细菌细胞，（ii）培养该突变细菌细胞及观察其特定细胞形态特征，（iii）在固体表面（诸如琼脂）上培养源自枯草芽孢杆菌分支内的芽孢杆菌菌种的具有野生型swrA基因的细菌细胞族群，及（iv）选择具有如上步骤（ii）中所识别的细胞形态的细菌细胞。在一些实施形式中，所述swrA突变通过反义或转座子技术产生。具体实施例如实施例25所提供。

在另一实施形式中，本发明包含一种用于生产植物生长促进制品的方法，该方法包含：

a.培养在swrA基因或其同源基因中具有突变的细菌细胞，其中相较于不具有所述突变的细菌细胞，该突变减少该细胞在固体或非液体表面生长时的群聚能力，及

b.使具有所述突变的细菌细胞生长至孢子形成。

在另一方面中，所述方法还包含使该细菌细胞自步骤（b）干燥。在又一方面中，所述方法还包含添加载体或配制惰性剂。在另一实施形式中，所述生长步骤发生于生物发酵器中。在一些实施形式中，所述生物发酵器具有至少2L的容量。

保藏信息

QST713野生型swrA⁺、QST30002（即AQ30002）和QST30004（即AQ30004）的样本已被保藏于位于美国农业部农业研究中心的国家农业应用研究中心的农业研究机构保藏中心（地址1815North UniversityStreet,Peoria,IL61604）。QST713野生型swrA⁺（2010年10月5日保藏）被指派下列保藏编号：NRRL B-50420。QST30002（2010年10月5日保藏）被指派下列保藏编号：NRRL B-50421。QST30004（2010年12月6日保藏）被指派下列保藏编号：NRRL B-50455。

为了满足35U.S.C.§112的可施行性及证明本发明的菌株保藏符合37C.F.R.§§1.801-1.809中所述的规定，关于这种经保藏的枯草芽孢杆菌菌株QST713野生型swrA⁺、QST30002和QST30004（保藏编号为NRRL B-50420、B-50421和B-50455），申请人特此声明如下：

1.在本申请未决期间，对本发明的取得将于局长要求时给予；

2.在授予专利后，这种细菌菌株将依37CFR1.808所规定的条件供公众取得；

3.该保藏将在30年内或在最后一次请求后的5年内或该专利的可执行期间维持于公共库存中，以较长者为准；

4.该生物性材料于保藏时的存活性将受到测试；及

5.该保藏若有无法取得的情况将被取代。

在本申请未定期间，对此保藏的取得将可由专利商标局局长依据37C.F.R.§1.14及35U.S.C.§122所决定的有权取得人士取得。在核准本申请中的任何申请专利范围时，根据37CFR1.808的（b）段的规定，所有关于公众取得这种细菌菌株的限制将被不可撤销地移除。

下列实施例纯粹为了示例说明本发明而提出，不具有限制本发明的目的。

具体实施方式

实施例1－识别砂纸突变株的形态学

第一个具有砂纸形态的枯草芽孢杆菌细胞在对商用批量的进行例行品质控制（QC）试验时被意外发现并分离。

该砂纸变体在营养琼脂培养板上呈现与QST713野生型细胞不同的菌落形态学。该砂纸细胞在固体培养基上形成高度紧密及疏水性的菌落（见图1中以基恩斯（Keyence）数码显微镜拍摄的QST713野生型及砂纸菌落的影像）。给予这些变体“砂纸”的名称是因为它们的表型呈现非常紧密、非常“粗糙”且非常难以自它们生长的琼脂上移除的平坦干燥菌落（即黏附性非常高的菌落）。自此初步发现初步分离及选择出具有砂纸形态的单一菌株以供进一步特征化。此菌株被命名为AQ30002。

除了在固体培养基上具有独特的菌落形态之外，AQ30002亦被观察到在早期指数期间在液体培养物中形成长链细胞。相反地，QST713野生型细胞在此相同生长阶段期间形成短链或维持单一细胞（图2的对比显微影像）。

AQ30002亦显示在高度剪切力的液体培养物中生长的独特形态学反应。当生长于摇晃中的液体培养物时，AQ30002和QST713显示非常类似的形态学及生长习性；然而，若在试管中放置物体（例如塑胶吸量管尖头），由此物体在培养基中移动所产生的较强涡流似乎仅刺激AQ30002的形态转移，即防止营养细胞在分裂后分开（链结）及产生大型丝状结块。此表型可在生长8至9小时后以显微镜及直接观察该培养试管发现。对比图3所提供的影像，它们是如下所述获得。AQ30002和QST713野生型的甘油保存菌液在营养琼脂板上过夜生长。各板上的一个菌落被分别放进装有3毫升的卢里亚（Luria）肉汁的8毫升弹扣盖试管中，并在该接种细菌的试管中放进一个1毫升无DNA酶的吸量管尖头。源自各板上的一个菌落亦在不放吸量管尖头的相同条件下的试管中生长。该试管在37℃下以260rpm摇晃，在8至9小时后利用光学显微镜对比生长情况。

数种芽孢杆菌基因（例如sinR）先前已被识别作为生物膜生产的活化子或（当突变时）作为组成性生物膜的生产基因。根据来自丹卡恩斯（Dan Kearns）（美国印第安那大学）的私人通讯，当生长于液体培养物时，sinR突变株结成“块状”，此与此突变株无视于环境讯号而随时产生生物膜的想法一致。此性质并非商业发展所欲，一般认为在生物膜产生的下游、效应子基因（诸如SinR）将不会是良好的商业候选物。

相反地，swrA似乎为天然细胞开关的一部分，其允许芽孢杆菌细胞调整它们的环境。虽然swrA先前未被描述为生物膜调节基因，其已被认为在液体培养物中的二种不同形态学状态之间转换细胞的作用：单浮游性细胞或连接细胞的长链（Kearns and Losick,“CellPopulation Heterogeneity During Growth of Bacillus subtilis”,Genes and Development（2005）:19,pp3083-3094.）。与此报告一致的是，swrA突变细胞仍对环境信号有反应。当于在液体培养物中生长时，这些细胞生长成单一细胞或链状，但似乎不会结块或形成生物膜。出乎意料的是，当生长于根或固体培养基时，这些细胞开始产生致密的生物膜。此与swrA是正常基因开关的想法一致，该开关能转换细胞至产生不同类型的生物膜的能力且（因为其在该途径的早期作用）仍允许细胞对环境信号做出回应（例如当生长于液体培养物时的非附着生长及当生长于固体培养基时的生物膜形成）。

实施例2－在生物反应器中制备枯草芽孢杆菌QST713全发酵液

观察到生长于生物反应器中的枯草芽孢杆菌QST713培养液包含少部分的砂纸变体细胞。枯草芽孢杆菌QST713的保存菌液冷冻保存于甘油溶液的小瓶中。为了在生物反应器中产生全发酵液，解冻一小瓶的保存菌液，将该内容物转移至含有适当培养基诸如狄菲克（Difco）公司营养肉汤的无菌瓶中。该瓶培养液在促进该有机体生长的条件下在旋转震荡器上培养，通常为介于25℃至37℃的温度及自100至250rpm的旋转速度。当在瓶中的细胞密度够高时，该内容物被转移至生物反应器中的新鲜灭菌的生长培养基。

该生物反应器被控制在特定温度、搅动、pH、及通气状态下以促进该有机体的生长及活性代谢物的表现。典型的生物反应器设定包括介于25℃至37℃的温度范围，自200至1000rpm的搅动速度、经缓冲以维持介于大约6至8的pH，及介于0.2至1.0VVM的通气量。当细胞生长及代谢物生产停止时（通常在培养24至72小时内），该培养菌液经收集接着测定细胞计数及纯度。在这些检测完成及接受后，该菌液可被用于实验室试验。

或者，可将保藏剂及其它添加剂（诸如增稠剂及分散液）混合加入该生物反应器肉汤中以模拟用于大田实验的商业制品。

实施例3－定量枯草芽孢杆菌QST713中的砂纸突变株频率

由AgraQuest公司（加州戴维斯市）生产的不同商业批量的经稀释（1/10E+6）及接种于营养琼脂（NA）以得到个别菌落。该砂纸样菌落经由16S rDNA测序证实为QST713野生型的突变株。

该砂纸菌落的数量经定量为所产生的菌落总数的百分比。具有特征菌落形态学的砂纸菌落在该经分析的商业批量的出现频率自0.0％至1.3％（见图4），在该经分析的商业批量中则为0.0％至3.2％。

如上所述，的EPA产品标示具体指出该商业制品包含14.6％的干燥QST713。若的商业样本包含至多14.6％的干燥QST713野生型/砂纸且其中至多仅3.2％是swrA变体，则该的商业样本包含至多（0.146×0.032）＝0.004672＝0.4672％或少于0.5％的干燥砂纸变体（即swrA^-）。

源自单一菌落的具有野生型形态学的QST713细胞亦过夜生长于有卢里亚（Luria）肉汁的瓶中，接着经稀释及接种于营养琼脂上以获得个别菌落。砂纸菌落经识别，该突变频率经计算为1/16,000。此高于其它基因的自发性丧失功能性突变频率的数量级，且与该swrA为超突变期的变异基因座的想法一致（D.B.Kearns et al.,“GenesGoverning Swarming in Bacillus subtilis and Evidence for a PhaseVariation Mechanism Controlling Surface Motility”,MolecularMicrobiology（2004）,52:357-369）。6个砂纸菌落个体的swrA基因的核苷酸序列经测序。所有六个菌落皆为swrA阴性。因此我们推论在QST713中，所有砂纸菌落皆为swrA阴性。

实施例4－定量商用芽孢杆菌菌株中的砂纸样突变频率

含有芽孢杆菌菌株的各种其它商用生物农药制品亦经分析以测定是否能识别出具有砂纸样形态学的细胞。此处所使用的“砂纸样”或“sp样”是指具有类似生长于营养琼脂上的QST713砂纸细胞（见例如图1）的菌落形态学的菌落形态学的细胞。

该商用菌株经生长于液体培养物、经稀释、及接种于营养琼脂（NA）以获得如实施例2所述的单菌落。在这些商用制品中的砂纸样菌落的频率介于0％至0.7％（见表2）。

表2.在代表性芽孢杆菌性商用生物农药中砂纸样细胞的频率

这些非砂纸样菌落最常见的菌落形态学如下：

发亮、隆起中心及皱褶边缘。

隆起、3D透明中心、起皱边缘；除此野生型以外的替代性表型（即形态学）是一大团（a big mass）。

圆形、隆起中心及粗糙不平整的边缘；亦可见3个QST713野生型样菌落。

高原样；紧密、隆起、不发亮的中心。

发亮、隆起中心及皱褶边缘；不像的多样性；亦可见2个QST713野生型样菌落。

Yield隆起中心及平坦周围边缘、在周围边缘内有小型环状气泡；亦可见4个QST713野生型菌落。

我们分析这些商用制品中的所有砂纸样变体的swrA基因，结果出乎意料地，所有皆为野生型（swrA⁺）。因此除了QST713以外的细胞，砂纸形态学本身并不足以预测该swrA^-突变及增进植物健康的改善能力。

实施例5－识别造成砂纸形态学的基因突变

利用具有砂纸形态学的多株QST713变异分离株的全基因组鸟枪法测序以识别造成该砂纸表型的基因突变。除了原本源自QST713的AQ30002分离株之外，另有四个展现该砂纸表型的QST713突变株（即AQ30003、AQ30004、AQ30005、及AQ30006）经测序。

使用由Illumina公司（加州圣地牙哥市）所提供的次代测序技术，产生全部大约涵盖各分离株基因组70倍长（70×coverage）的序列读值（sequence reads），并与该参照QST713野生型基因组比对。

已发表的用于突变检测的工具诸如MAQ（Li,H.,et al.,“Mapping Short DNA Sequencing Reads and Calling Variants UsingMapping Quality Scores,”Genome Res.（2008）18,1851-1858）及BWA（Li,H.and Durbin R.,“Fast and Accurate Short ReadAlignment with Burrows-Wheeler Transform,”Bioinformatics（2009）25,1754-1760）被用来识别可能的突变位置。下列统计性及生物性假设被用来过滤假阳性：

1.所有五个砂纸分离株（即AQ30002至AQ30006）极不可能在完全相同的位置呈现完全相同的突变。

2.若五个分离株皆出现完全相同的突变，最有可能是因为在参照基因组中的测序错误。

3.砂纸表型最可能因为一个基因中的单一突变造成。

4.突变可能发生在编码区。

5.突变可能造成蛋白质的巨大变化。若该突变将该受影响的密码子改变成终止密码子或将起始密码子变成非起始密码子，则认为是单一碱基改变。若突变造成读框移位突变，则考虑为插入及删除。

6.突变不可能发生在必需基因。

通过在分析过程中采用上述假设，swrA被识别为造成QST713细胞的砂纸形态突变的唯一候选基因。

在上述经测序的砂纸突变株中所识别的swrA突变等位基因接着利用桑格（Sanger）法测序（Sanger,F.,et al.,“DNA Sequencingwith Chain-Terminating Inhibitors,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1977）74,5463-5467）各分离株中的此区加以证实。对比源自代表性砂纸分离株AQ30002及AQ30004和源自各种野生型芽孢杆菌菌株包括QST713的预期swrA转录物的序列比对显示于图5。

桑格测序法证实在QST713中的该swrA序列符合由次世代测序所产生的参考序列。图5对比这种受到关注的预期编码序列与Bsub_3610的swrA的预期编码序列，其是芽孢杆菌基因学领域的技术人员所熟知的标准。

此分析亦证实AQ30002、AQ30003、及AQ3006皆包含swrA中1bp的删除，导致读框移位及提前终止密码子（见图5中的AQ30002），及在AQ30004及AQ30005中该swrA起始密码子经突变为另一种（非起始）密码子（见图5中的AQ30004）。

swrA的同源基因仅存在于少数芽孢杆菌菌种。为了识别枯草芽孢杆菌分支内可能具有swrA基因的成员，利用多序列比对程式ClustalW比对密切相关的各种芽孢杆菌菌种的全长16S rRNA基因。该ClustalW比对接着被转换成PHYLIP格式以产生亲源关系树（见图6）。接着询问公共基因资料库以识别哪一个菌种具有经证实的swrA同源基因序列，这些菌种（即短小芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及地衣芽孢杆菌）以双星号标示于图6。SwrA是一种不寻常的独特蛋白质，在此群以外并无可识别的相关蛋白质或任何预测的功能。由于16S rDNA对比显示此群芽孢杆菌菌种（枯草芽孢杆菌分支）是单系性且该swrA基因存在于该分支的所有4支，我们的结论是此基因在此的早期出现，最有可能的是存在于该群中的所有菌种。

Kearns,et al.（“Genes Governing Swarming in Bacillussubtilis and Evidence for a Phase Variation MechanismControlling Surface Motility,”Molecular Microbiology（2004）52（2）:357-369）识别二个可能的起始密码子TTG及GTG。GTG在TTG上游35个碱基处。在使各密码子独立地突变后，他们观察到只有突变的TTG阻止下游报告基因的表现，因此结论认为此为真正的起始密码子。我们注意到文献中对于swrA转译起始密码子的预测有不同的意见（例如，在此处swrA转译起始被预测为GenBank编号ABV89964.1的枯草芽孢杆菌枯草亚种NCIB3610株的swrA基因的上游75bp（图5）；亦见Zeigler,et al.,2008,“The Origins of168,W23,and OtherBacillus subtilis Legacy Strains,”J.Bacteriol.190（21）:6983-6995中的引用文献）。另外，在Kearns,et al.（2004，同上）中的预测起始密码子是非典型的。因此我们实施枯草芽孢杆菌分支的多菌种间的对比性序列分析。由于密切相关物种诸如枯草芽孢杆菌分支之间的基因结构已知具有高度保守，因此此方法提供基因特征诸如转译起始位点或主要基因调节序列位置的有力证实。

我们对比菌株QST713野生型、FZB42（解淀粉芽孢杆菌）、AQ2808（短小芽孢杆菌）及枯草芽孢杆菌斯皮兹亚仁亚种（B.subtilis subsp.Spizizenii）（Genbank编号NC_014479）中于此处所报告的TTG起始密码子的上游的100碱基。我们发现没有其它起始密码子ATG或可替换者能产生阅读框以生产除了由此处所报告的TTG起始密码子所产生的swrA多肽。如细菌基因学领域的技术人员所知，许多偶然性基因座（swrA似乎即为其中之一）使用替代性起始密码子。见例如Annu.Rev.Genet.（2006）40:307-33。因此，我们的结论是真正的转译起点位于由Kearns,et al所预测的TTG密码子。

实施例6－QST713砂纸细胞的连续传代

在swrA基因序列中具有删除的QST713砂纸突变株（例如AQ30002）在含有胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基（17g/L胰消化酪蛋白、3g/L大豆粉木瓜酶消化物、5g/L氯化钠、2.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L葡萄糖）的瓶中经过15次传代后仍然稳定。当砂纸细胞在瓶中转换15次后接种于NA上时，没有发现QST713野生型回复突变细胞。这些结果显示砂纸突变株真正稳定且能繁殖。

实施例7－swrA于AQ30002中的互补性分析

方法

进行试验以确认该swrA^-突变造成该增进植物生长表型的原因。二个包含该swrA基因及该swrA基因加上该编码区上游300个核苷酸且分别被命名为pPen_swrA（即在组成型启动子转录控制下的swrA基因）及endoPro_swrA（即在它自己的启动子转录控制下的swrA基因）的构建体利用包含限制酶位点的引物由QST713swrA⁺基因组DNA生产，这种限制酶位点被用于亚克隆该DNA片段至经设计可与存在于枯草芽孢杆菌MMB869中的整合性接合因子（ICE）相容的质粒载体中（WiepKlaas Smits and Alan D.Grossman,“The TranscriptionalRegulator Rok Binds A+T-Rich DNA and Is Involved in Repressionof a Mobile Genetic Element in Bacillus subtilis,”PLoSGenetics（2010）6（11）:e1001207、Catherine A.Lee,et al.,“Identification and Characterization of int（integrase）,xis（excisionase）and Chromosomal Attachment Sites of theIntegrative and Conjugative Element ICEBs1of Bacillussubtilis,”Molecular Microbiology（2007）66（6）:1356-1369）。含有i）用于pPen_swrA构建体的在组成型启动子控制下的swrA基因或ii）用于endoPro_swrA构建体的在它自己的启动子控制下的swrA基因的浓缩环状质粒DNA经自然感受态作用被转化入供体枯草芽孢杆菌MMB869。MMB869包含枯草芽孢杆菌整合性接合因子（ICE Bs1）转座子（见上述的Smits and Grossman），其有利于被克隆于质粒载体中的DNA移动至芽孢杆菌中。此通过自然感受态作用发生，所希望的DNA构建体被插入二个与该芽孢杆菌基因组中的位置同源的结构域之间。

为了允许自然感受态发生，MMB869细胞系生长于SPC培养基（SPC培养基：10ml 10X Spizizen、1ml 50％葡萄糖、4ml 5％酵母菌提取物、2.5ml 1％酪蛋白氨基酸、1.6ml 2.5mg/ml色胺酸、0.5ml1M MgSO₄；10X Spizizen盐：2％（NH₄）2SO₄、14％无水K₂HPO₄、6％K₂HPO₄、1％柠檬酸三钠二水、0.2％Mg₂SO₄·7H₂0），转移至SPII培养基（10ml 10X Spizezen、1ml 50％葡萄糖、2ml 5％酵母菌提取物、1ml 1％酪蛋白氨基酸、1.6ml 2.5mg/ml色胺酸、1ml 50mMCaCl₂、0.5ml 1M MgSO₄），离心成团块，再重悬于SPII培养基。该MMB869细胞接着被加至含有该经纯化的质粒DNA的小体积ME溶液（0.200ml 10X Spizizen盐、0.020ml 200mM EGTA、1.780ml无菌去离子水）中。该细胞及DNA混合物在37℃下摇晃培养1小时。

细胞被置于LB卡那霉素琼脂板上，于37℃过夜生长。数个LB-卡那霉素板上的菌落被贴上LB氯霉素板，以确认质粒已经通过双重交叉事件被插入。经新转化的供体MMB869菌株被用于通过接合作用分别转移pPen_swrA及endoPro_swrA构建体至该AQ30002 swrA^-菌株。含有pPen_swrA及endoPro_swrA ICE构建体的MMB869供体菌株过夜生长于LB卡那霉素板上。AQ30002_strepR（含有链霉素抗药性基因的AQ30002）过夜生长于LB琼脂上。pPen_swrA及endoPro_swrA MMB869菌株的单一菌落被转移至LB+卡那霉素。AQ30002_strepR的单一菌落亦被转移至LB+链霉素。这三种培养液在生长至OD600大约1.0时，以新鲜LB稀释至OD6000.02，在37℃下生长约1小时后，添加木糖以诱导该ICE构建体切割及经由接合作用转移至AQ30002_strepR。

细胞于37℃下再生长1小时后，这些培养液的OD600大约为0.9。将2.5ml的供体细胞与2.5ml的AQ30002_strepR细胞混合，经无菌膜过滤器真空过滤。将该过滤器自过滤组移除，利用无菌技术转移至SMS琼脂板（25ml的10X Spizizen盐及3.75g洋菜于总共250ml去离子水中）并于30℃过夜培养。通过以5ml的1X Spizizen盐（1:10稀释的10X Spizizen盐于无菌、去离子水）冲洗该过滤板收集细胞。100μl的细胞被接种至LB卡那霉素/链霉素板上，并于37℃过夜培养以识别AQ30002_strepR接合转移菌。其余的细胞液经离心形成团块，重悬于LB中，再接种至LB卡那霉素/链霉素板上。

我们假设以pPen_swrA构建体或endoPro_swrA构建体互补AQ30002将导致丧失砂纸表型及回复成为粘性野生型QST713swrA⁺表型。除了菌落形态学之外，我们通过评估该添加的swrA基因是否救援AQ30002群聚的能力以证实该互补性，群聚试验如Joyce E.Patrick及Daniel B.Kearns所述（“Laboratory Strains of Bacillussubtilis Do Not Exhibit Swarming Motility,”Journal ofBacteriology（2009）191（22）:7129-7133）。见图7。

我们亦测量含有pPen_swrA构建体或endoPro_swrA构建体的AQ30002细胞的根部定殖。番茄种子首先以70％乙醇接着以10％漂白水表面灭菌。这些种子接着以无菌去离子水润洗及置于含有少量无菌水的48孔盘的分开孔槽中。使该种子在室温中光线下（高强度、设定为8小时光照时间）发芽，在5至7天后使用。

这些发芽种子的根部被浸泡于磷酸缓冲盐水（PBS）的细胞悬浮液中。为了标准化该细胞悬浮液的浓度，使用0.01的OD600nm，因为此为QST713产生10E6CFU/ml的大约OD600nm值。在浸泡后，各发芽的种子接着被置于含有12ml的无菌MS培养基（2.215g/L Murashige及Skoog（MS）盐、1.5％蔗糖、1％琼脂pH5.7）的试验试管中，允许其于室温中光照下生长约1周。根部定殖（根上的生物膜形成）利用基恩斯（Keyence）数码显微镜目视观察，并从零（表示无根部定殖）至三（表示大量根部定殖）评分。在各试验中，以浸泡于无菌水中的根部作为阴性对照。

结果

插入pPen_swrA基因ICE构建体至AQ30002_strepR（称为AQ30002_pPen_swrA_ICE细胞）以非常低的频率产生具有部分粘性形态学的细菌细胞。各个接合转移菌被收集及再画线于各LB卡那霉素/链霉素板上以供确认及未来实验使用。大部分的接合转移菌维持砂纸样形态学或呈现砂纸及粘性的混合。将endoPro_swrA ICE构建体插入AQ30002_strepR（称为AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞）产生具有100％粘性形态学的细菌细胞。未观察到砂纸样菌落。各个分离株被收集及再画线于各LB卡那霉素/链霉素板上以供确认及未来实验使用。这些结果与ICE插入AQ30015_strepR的结果相同，AQ30015_strepR和AQ30002一样具有相同swrA基因突变的独立源自QST713的第二链霉素抗药性菌株（资料未显示）。

为了证实AQ30002_strepR及AQ30015_strepR维持原始的swrA突变，和pPen_swrA^-_ICE及endoPro_swrA_ICE构建体包含野生型版本的swrA，自各接合转移菌实验的二个分开的分离株纯化基因组DNA，并实施PCR以扩增该内源性swrA基因座及swrA_ICE构建体。测序这些PCR产物证实该内源性swrA基因座经突变，和该swrA_ICE构建体野生型。

进一步特征化AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞包括生长于液体培养物以和AQ30002对比形成长链/结块的程度，以及利用定性试验及定量试验对比这些菌株与AQ30002的群聚能力。于30℃及250rpm摇晃过夜生长于14ml弹扣盖试管中的LB液体培养基时，AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞相较于高度链结/结块的AQ30002呈现模糊及透明性质。

为了测试群聚能力，使用接种环将过夜培养液接种于0.7％LB琼脂板上，经干燥后，使其在37℃下生长大约10小时。在生长后，AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞群聚在大部分板上的程度类似于野生型QST713，与AQ30002细胞相当不同。AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞呈现群聚阳性，和AQ30002菌株不同（图7）。AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞在定性群聚试验中以类似于QST713的比率群聚（资料未显示）。AQ30015_endoPro_swrA^-_ICE细胞在所有试验中有类似的表现（资料未显示）。

根部定殖试验的结果和细胞链结/结块及群聚试验中的结果一致。在根部定殖试验中，AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE细胞并不定殖于番茄根部，不像AQ30002或AQ30002_strepR处理组（见表3及图8）。此外，当查看每一组的复制品中的最佳定殖根部样本的生物膜时，AQ30002_pPen_swrA_ICE处理的生物膜似乎更密切地符合AQ30002和AQ30002_strepR的生物膜，而非AQ30002_endoPro_swrA^-_ICE处理组的生物膜（其似乎类似QST713生物膜）（如图9所示）。

表3根部定殖试验结果，各处理组有四个复制品。

实施例8－AQ30002液体培养物的薄膜强度

在液体培养基的表面上生长的培养细菌可能形成有些连续性的称为薄膜的膜。此膜由微生物细胞及经分泌的胞外基质组成。因此，薄膜代表液体/气体介面生物膜。如此处进一步描述，薄膜强度可通过戳刺该薄膜以得知薄膜是否破裂的试验确定。

来自枯草芽孢杆菌株QST713野生型swrA⁺的菌落（即100％swrA⁺细胞，自单一菌落生长）的二个复制品试管（命名为wt1及wt2）和来自枯草芽孢杆菌株AQ30002swrA^-的菌落的二个复制品（命名为sp1及sp2）生长于猪肉汤母培养基或小猪肉汤（Piggy）培养基（10g/L葡萄糖、8g/L酵母菌提取物、8g/L猪肉汤pH8.5）至对数中期。QST713野生型swrA⁺和AQ30002swrA^-在猪肉汤母培养基中具有类似的生长速率（见图10的生长曲线）。

QST713野生型swrA⁺和AQ30002swrA^-亦具有类似的抗生素感受性、介于15℃至65℃的温度范围内的类似生长模式、在血液琼脂上的类似生长、及以BioLog表型微阵列技术测定的类似代谢特性（Hayward,California）（资料未提供）。

此二菌株在20ml的猪肉汤母培养基中于30℃、200rpm下生长。等分被稀释于24孔盘的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）培养基（17g/L胰消化酪蛋白、3g/L大豆粉木瓜酶消化物、5g/L氯化钠、2.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L葡萄糖）中，放在实验室工作台上让它在室温中生长3天。

各菌株的二个样本具有4个复制品，因此每一株总共具有8个薄膜以供检查。各薄膜戳刺三次直到吸量管尖端轻触孔盘底部。在戳刺后维持完整的薄膜数量与破裂的数量对比。二种菌株在TSB培养基中生长3天后形成薄膜。由QST713野生型swrA⁺形成的8个薄膜在戳刺后全部破裂，由AQ30002swrA^-形成的8个薄膜中仅4个破裂（见图11）。

实施例9－在根部定殖后AQ30002生物膜的特征

番茄种子以70％乙醇及10％漂白水表面灭菌，接着以无菌去离子水润洗。

为了使其无菌发芽，种子被放在二片无菌滤纸之间，并添加无菌去离子水。用石蜡膜封住孔盘，该孔盘被放在室温中光照下（12小时黑暗/12小时光照）7天后，出现发芽种子。

将这些发芽种子的根部浸泡在AQ30002swrA^-或QST713野生型swrA⁺细胞的磷酸缓冲盐水（PBS）悬浮液中。为了标准化该细胞悬浮液的浓度，使用0.01的OD_600nm，因为此为QST713产生10E6CFU/ml的大约OD_600nm值。

为了允许无菌生长及根部定殖，在浸泡后，各发芽种子接着被置于含有12ml的无菌MS培养基（2.215g/L Murashige及Skoog（MS）盐、1.5％蔗糖、1％琼脂pH5.7）的试验试管中，允许其于室温中光照下生长10天。根部定殖利用基恩斯（Keyence）数码显微镜目视观察。

水对照组无根部定殖。QST713野生型swrA⁺定殖于整个根部包括尖端，该生物膜非常模糊。AQ30002swrA^-也定殖于整个根部包括尖端，该生物膜相较于QST713野生型swrA⁺似乎更为密实且看起来更紧密地与根部结合（见图12）。

为了证实在根部表面的AQ30002swrA^-生物膜相较于QST713野生型swrA⁺生物膜具有更致密的性质，如上所述制备额外样本。在室温中光照下生长1周后，覆盖QST713野生型swrA⁺或AQ30002swrA^-细胞的根部在乙醇中脱水、干燥、以金包覆、并以扫描式电子显微镜（SEM）观察。在根部表面上的AQ30002swrA^-生物膜再度显示相较于由QST713野生型swrA⁺所形成的生物膜显著地更为致密（见图13）。应注意的是，此方法低估野生型生物膜的扩散性质，因为此结构在乙醇脱水期间显著地皱缩更多。

为了进一步对比在根部表面上的AQ30002swrA^-生物膜与QST713野生型swrA⁺生物膜的特征，额外的根部样本如上述培养及生长，并以光学显微镜进行如下述的分析。小心地自琼脂中移出根部，在卡诺夫斯基（Karnovsky′s）固定液固定15分钟，并以逐渐增量至100％的乙醇脱水。接着以临界点干燥、四氧化锇处理及包埋于树脂中。一些树脂块经厚切、甲基蓝染色、封片及以显微镜在10至40x放大倍率下观察。水对照组无根部定殖。QST713野生型swrA⁺细胞在根部周围形成稀薄疏松的层。缺乏明显的生物膜可能是人为结果，该具有稀松特性的野生型生物膜在自琼脂移出时或在清洗及脱水步骤期间丧失。相反地，AQ30002细胞在根部周围形成厚实的膜。见图14。在相同制备条件下该突变生物膜附着于根部表面，显示该生物膜相较于野生型结构在物理上更为强韧且附着性更高。

同时，其它经固定及包埋的根样本经薄切、封片及以透射电子显微镜观测。该水对照组显示无定殖，而QST713野生型swrA⁺细胞看起来像教科书上的芽孢杆菌营养细胞。该AQ30002细胞显示完全不同的形态学。该AQ30002细胞的直径显著大于（0.83μm+/-0.066；p<0.05；n＝14；费氏检定）该QST713细胞的直径（0.52μm+/-0.027；n＝11）。此外，该AQ30002细胞显示远较为复杂的形态学，在这种细胞的中心出现大型电子穿透性（白色）区域，看起来像是额外的胞衣或细胞壁。见图14。

实施例10－AQ30002于增进番茄、玉米及小麦植物生长的活性

制备枯草芽孢杆菌QST713（即如中可见的野生型和砂纸细胞的混合物，见图4）、AQ30002（swrA^-）、独立的QST713基因变体（713var）及短小芽孢杆菌QST2808（同义名称AQ2808）各菌株的全发酵液以用于种子浇淋。在含有LB培养基（Luria Broth）的种子瓶中接种各菌株，使这些菌株在30℃过夜生长。隔天，取自各种子瓶中的等分被接种至以基于大豆的培养基，使其生长直到孢子形成。

在进行种子浇淋之前，根据每毫升的CFU将全发酵液的终浓度稀释成商用产品的64盎司/英亩的施用率。64盎司/英亩是指每颗种子的菌落形成单位的数量，或2.2×10⁸CFU/植物。此处所使用的量根据该全发酵液的cfu/ml计算。

将穴盘（Hummert公司，目录编号14-3128）填满种子发芽混合物，各孔穴种入一颗种子。使用‘Spring Treat Hybrid’玉米种子、‘Derkwin’小麦种子，及‘QualiT21’番茄种子。因此，本试验包括单子叶植物（即玉米和小麦）及双子叶植物（即番茄）。每个穴盘接着以2ml的全发酵液样本处理，未经处理的对照组接受2ml的水。这些穴盘被放在室温中高强度光照（约300爱因斯坦（Einsteins），设定为16小时光照/8小时黑暗周期）之下。在需要时进行浇水。不使用肥料。

在浇淋这些种子后2周，观察番茄、玉米及小麦植株的植物生长增进特性。接着采收叶子和根组织，在纸袋中干燥及秤重。以AQ30002处理的植物相较于以水处理的植物看起来都较绿、较高且整体来说较为健康（见图15、16、17）。以AQ30002处理的所有植物组织的干重皆显著高于这些未经处理的植物的对应组织的干重，除了玉米根部以外，其中干重相同（见图18、19、20）。

实施例11－在大田间以AQ30002处理的加工用番茄的产量增加

二个独立的大田试验在靠近加州爱丝卡隆（Escalon,California）及靠近圣路易斯欧毕斯波（San Luis Obispo,California）的加工用番茄场进行。该材料在移栽时作为浇淋处理施用至植物。枯草芽孢杆菌菌株QST713（即如中可见的野生型和砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-在生物反应器中生长于以基于大豆的培养基中，经配制成类似商用ASO产品，并以相当于商用产品3.4夸脱/英亩（qt/acre）的浓度施用。植物生长刺激剂（PGS）以625ml/acre施用，含有活性成分精甲霜灵（mefenoxam）的SL（Syngenta）以1品脱/英亩（pint/acre）的比率施用。使用每个处理组有四个复制品的随机完全区集（RCB）设计。各复制品代表大约2行×25英尺。

在靠近爱丝卡隆进行的试验中，以AQ30002处理的植物的可上市总产率显著高于未经处理的对照组（UTC）的可上市总产率（见图21）。

虽然在靠近圣路易斯欧毕斯波进行的试验中，没有一种处理产生高于未经处理的对照组的可上市总产率（资料未显示），但此试验不被认为可象征植物的AQ30002处理可能造成的典型产率增加。圣路易斯欧毕斯波地区通常不种植番茄，该区的土壤类型及气候和通常种植番茄的加州地区有显著差异。另外，该试验不在传统番茄生长地区进行的地理错位及在不对的时间收成导致有问题的结果。

实施例12－在大田间以AQ30002处理玉米植株减少倒伏百分比及降低茎腐病（腐霉）发生率

大田实验在靠近明尼苏达州佩恩斯维尔（Paynesville,Minnesota）进行，使用马齿种玉蜀黍（Zea mays indentata）（凹玉米）Dekalb变种‘DK2C26’植株。该材料作为稀释于水中的犁沟或T条带（T-band）处理以施用至植株。除了有或无植物生长刺激剂（PGS）的特定全发酵液之外，该桶混中不包括肥料或任何其它产品。枯草芽孢杆菌菌株QST713（即如中可见的野生型和砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-在生物反应器中生长于以基于大豆的培养基中，经配制成类似商用ASO产品，并以相当于商用产品3.4夸脱/英亩（qt/acre）的浓度施用。植物生长刺激剂（PGS）以625ml/acre施用。使用每个处理组有四个复制品的随机完全区集（RCB）设计。各复制品代表4行×30英尺。该经处理的玉米植株并未显示与未经处理的对照组显著不同的产率（资料未提供）。然而，经AQ30002swrA^-处理的玉米植株相较于这些经QST713处理或未经处理的对照组显示显著较少的倒伏（见图22）。此外，所有包括AQ30002swrA^-的处理组相较于未经处理的对照组（UTC）显著降低由腐霉造成的茎腐病的发生率（见图25）。

在另一大田试验中，生长于生物反应器中以基于大豆的培养基中且经配制以模拟商用ASO产品的AQ30002swrA^-以每亩2夸脱的比率，在栽种大豆时与形成结节的细菌（特别是大豆慢生型根瘤菌）的细菌接种剂一起经犁沟施用。在四个月后采收植物（包括根部），对比未经处理和经处理的样本的根部结节。见图23及24中的结果。

实施例13－AQ30002对抗叶疾病的活性

虽然并未被视为叶疾病的治疗，AQ30002swrA^-被观察到具有对抗下列植物病原体的活性：芸苔黑腐病菌（Xanthomonas campestris pv.campestris）、葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichum orbiculare）（黄瓜炭疽病菌）、灰霉菌（Botrytis cinerea）（辣椒灰霉病）、苍耳单丝壳（Sphaerotheca fuliginea）（黄瓜白粉病）、古巴假霜霉（Pseudoperonospora cubensis）（瓜类露菌病）、隐匿柄锈菌（Puccinia recondita）（小麦叶锈病）、丁香假单胞菌番茄变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）（番茄细菌性叶斑病）、及禾本科布氏白粉菌大麦小种（Blumeria graminis f.sp.hordei）（大麦白粉病）（资料未提供）。

实施例14－AQ30002对抗土壤疾病的活性

QST713（即在中可见野生型及砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-菌株生长于基于大豆的培养基生物反应器中，所述全发酵液以20％浓度测试对抗终极腐霉及立枯丝核菌的活性。植物病原菌经制备于来自Fungi Perfecti公司的含有200g的蛭石及600ml的马铃薯葡萄糖（PD）肉汤的“栽培袋”中。该袋被接种一整盘大约一周龄的终极腐霉或立枯丝核菌，在使用前允许其生长一周。

种子发芽混合物以每公升混合物100ml的去离子水润湿，接着以每公升混合物8g接种液的立枯丝核菌及64g/L混合物的终极腐霉感染。该被接种的混合物接着被放进2.5英寸的盆器中。未经感染的混合物亦被用来作为未经感染的对照组（UIC）。在感染及放置该混合物进入盆器中之后，各治疗组中的各盆器以10ml的其个别处理浇淋。在浇淋之后，各盆器利用量匙种植大约65颗芸苔属种苗（品种：‘Johnny′s Broccoli for Sprouting’，目录编号2108）。该盆器经饱水后被放在高强光照之下，允许其生长一周后评估。

各复制组中的个别种苗经计算，以获得各处理组及各疾病的发芽出苗数量。该结果与未感染对照组（UIC）及感染对照组（IC）对比以决定活性（见图26）。疾病控制由在接种特定病原菌的土壤中出苗及存活的种苗数量决定。

进行大田试验以对比如实施例11及12所述制备的AQ30002和QST713（即野生型和砂纸样细胞以大约200:1比例的混合物，如中可见）对抗各种土壤植物病原体的效果。在花生及菜花的立枯丝核菌试验及莴苣的黄萎病试验中，AQ30002在疾病控制上的效果似乎优于QST713。（特定结果未提供。）在疾病控制试验中，AQ30002的效果并未优于所有QST713。

进行活体外试验以测试AQ30002控制另一土壤疾病齐整小核菌（Sclerotium rolfsii）的能力。先期结果显示AQ30002相较于QST713（即如中可见的野生型和砂纸样细胞的混合物）更为有效地对抗此疾病。（结果未提供。）

实施例15－AQ30002对抗辣椒疫霉的植物内活性

QST713（即在中可见野生型及砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-菌株生长于基于大豆的培养基生物反应器中，所述全发酵液以20％浓度测试对抗辣椒疫霉的活性。该辣椒疫霉生长于V-8琼脂，使其释放孢子囊中的游动孢子至无菌去离子水。该游动孢子的浓度接着被稀释成2x10E4游动孢子/ml以用于接种（10ml/植物）。

种植于培养土中的二周龄椒（品种‘California Wonder’）各以10ml的全发酵液处理浇淋，隔天接种辣椒疫霉。为了监测疾病在椒植株中的发展及由QST713或AQ30002swrA^-处理所提供的保护作用，在8天期间监测植物。含有三乙膦酸铝的化学杀真菌剂Aliette亦经测试于3.2mg/ml及1.6mg/ml的浓度。AQ30002swrA^-的处理相较于QST713的处理在较长时间提供较多数量的全植物存活的植物保护（见图27）。

实施例16－以AQ30002处理的植物增加叶绿素含量

源自枯草芽孢杆菌QST713（即如中可见的野生型和砂纸样细胞的混合物，见图4)和AQ30002swrA^-各菌株的全发酵液经制备以用于种子浇淋。含有LB培养基(Luria Broth)的种子瓶经接种并于30℃过夜生长。隔天，取5ml的种子瓶液以接种于以基于大豆的培养基。使该瓶中的细菌生长直到孢子形成完全。在进行种子处理之前，根据每毫升的CFU将全发酵液的终浓度稀释成商用产品的4、8、16、32、64及128盎司/英亩的施用率。

将穴盘（Hummert公司，目录编号14-3128）填满种子发芽混合物，各孔穴种入一颗种子。使用QualiT21番茄种子。每个穴盘接着以2ml的全发酵液样本处理，未经处理的对照组接受2ml的水。这些穴盘被放在室温中高强度光照（约300爱因斯坦（Einsteins），设定为16小时光照/8小时黑暗周期）之下。在需要时进行浇水。不使用肥料。

在浇淋这些种子后2周，观察番茄植株的植物生长增进特性。接着定量在叶中的叶绿素含量；在各处理组中随机选择3片叶子以打洞取得3个重复样本。该叶样本被磨碎并以80％丙酮_（aq）萃取，测量该提取物的OD_600nm。

二种处理QST713和AQ30002swrA^-皆具有非常明显的剂量依赖性反应，从大约16oz/acre开始一直到128oz/acre相较于H₂O对照组导致更绿且更大的叶片。在较低施用率（4至16oz/acre）下，AQ30002swrA^-处理看起来比该对应的QST713处理更绿。

对比QST713和AQ30002swrA^-处理的全番茄植株和个别叶片的影像可分别见于图28及29。除了目视观测之外，亦对比QST713和AQ30002swrA^-全发酵液的不同施用率之间的叶绿素含量。虽然不具统计显著性，但是自AQ30002swrA^-处理组收集的叶片相较于对应施用率的QST713处理组具有较高叶绿素含量的固定倾向（除了32oz/acre之外，其中二组似乎具有相同量的叶绿素）。见图30。

实施例17－AQ30002于增进番茄植株生长的活性

源自枯草芽孢杆菌QST713（即如中可见的野生型和砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-各菌株的全发酵液经制备以用于原位种子处理。含有卢里亚（Luria）肉汁（LB）的种子瓶经接种自NA盘上挑起的一个菌落，这些瓶被放置于30℃中以200rpm摇晃。隔天，取5ml的种子瓶液以接种于培养基2。培养基2将包含5％蛋白胨、5％葡萄糖、3％酵母菌提取物、3％麦芽提取物、1.5％棉子提取物、10％黄豆粉及0.5％MgSO₄×7H₂0。

在进行种子处理之前，根据每毫升的CFU将全发酵液的终浓度稀释成商用产品的64盎司/英亩的施用率。64盎司/英亩是指每颗种子的菌落形成单位的数量，或2.2×10⁸CFU/植物。此处所使用的量根据该全发酵液的cfu/ml计算。

将穴盘（Hummert公司，目录编号14-3128）填满种子发芽混合物，各孔穴种入一颗种子。使用QualiT21番茄种子。每个穴盘接着以2ml的全发酵液样本处理，未经处理的对照组接受2ml的水。这些穴盘被放在室温中高强度光照（约300爱因斯坦（Einsteins），设定为16小时光照/8小时黑暗周期）之下。在需要时进行浇水。不使用肥料。

在浇淋这些种子后2周，观察番茄植株的植物生长增进特性。我们假设经AQ30002处理的植株相较于经水处理的植株将全部显得较绿、较高及整体较健康。我们亦假设经AQ30002处理的所有植株组织的干重将显著高于这些未经处理的植株的对应组织。然而，这些结果显示培养基2（施用于植物以作为对照组）促进植物健康。因此，申请人无法自此试验得到确切结论。

实施例18－AQ30002对抗终极腐霉及立枯丝核菌的植物内活性

QST713（即在中可见野生型及砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-菌株生长于培养基2（5％蛋白胨、5％葡萄糖、3％酵母菌提取物、3％麦芽提取物、1.5％棉子提取物、10％黄豆粉及0.5％MgSO₄×7H₂0）中，所述全发酵液以20％全发酵液浓度测试对抗终极腐霉及立枯丝核菌的活性。植物病原菌经制备于来自FungiPerfecti公司（华盛顿州奥林匹亚市）的含有200g的蛭石及600ml的马铃薯葡萄糖（PD）肉汤的“栽培袋”中。该袋被接种一整盘大约一周龄的终极腐霉或立枯丝核菌，在使用前允许其生长一周。

种子发芽混合物以每公升混合物100ml的去离子水润湿，接着以每公升混合物8g接种液的立枯丝核菌及64g/L混合物的终极腐霉感染，接着被放入2.5英寸的盆器中。未经感染的混合物亦被用来作为未经感染的对照组（UIC）。在感染及放置该混合物进入盆器中之后，各治疗组中的各盆器以10ml的其个别处理浇淋。在浇淋之后，各盆器利用量匙种植大约65颗芸苔属种苗（‘Johnny′s Broccoli forSprouting’，目录编号2108）。这些种子被覆盖上一层未经感染的培养土，且这些盆器被放在无孔且盛装去离子水的盘上直到所有盆器均吸饱水。在该盆器经饱水后放在高强光照之下，允许其生长一周后评估。

各复制组中的个别种苗经计算，以获得各疾病的各处理组的发芽出苗数量。该结果与未感染对照组（UIC）及感染对照组（IC）对比以决定活性。疾病控制由在接种特定病原菌的土壤中出苗及存活的种苗数量决定。在疾病控制上，此试验与之前以生长于大豆底物培养基的相同菌株所观察到的结果并无差异。

实施例19－AQ30002对抗辣椒疫霉的植物内活性

QST713（即在中可见野生型及砂纸样细胞的混合物，见图4）和AQ30002swrA^-菌株生长于培养基2（5％蛋白胨、5％葡萄糖、3％酵母菌提取物、3％麦芽提取物、1.5％棉子提取物、10％黄豆粉及0.5％MgSO₄×7H₂0）中，所述全发酵液以20％浓度测试对抗辣椒疫霉的活性。辣椒疫霉的游动孢子在V-8琼脂上制备，且经稀释为2×10⁴个游动孢子/ml以供接种（10ml/植物）。

种植于培养土中的二周龄椒（品种‘California Wonder’）以10ml的全发酵液处理浇淋，隔天接种辣椒疫霉。经过一周后，计算各处理组中死亡/未死亡的椒总数。对比处理组与经感染的对照组（IC）和未经感染的对照组的死亡率。含有三乙膦酸铝的化学杀真菌剂Aliette经测试于3.2mg/ml及1.6mg/ml的浓度。

为了监测疾病在椒植株中的发展及由QST713或AQ30002处理所提供的保护作用，在8天期间监测植物。以AQ30002处理相较于QST713（即在中可见野生型及砂纸样细胞的混合物，结果未显示）的处理在较长时间提供较多数量的全植物存活的植物保护。

实施例20－枯草芽孢杆菌3610swrA^-突变株增进番茄植物生长

源自3610WT枯草芽孢杆菌（即野生型细胞，此处称为3610或3610WT）和3610swrA^-的个别全发酵液经制备以用于种子浇淋。该3610WT枯草芽孢杆菌描述于Kearns,2004。该3610swrA^-突变株是指在Kearns,2004中所述的swrA^-突变，其在3610的位置26至34处具有8个A:T碱基对的连续片段插入。各菌株被画线在营养琼脂（NA）上，经3天后被接种至种子瓶。含有卢里亚（Luria）肉汁的种子瓶经接种自NA盘上挑起的一个菌落，这些瓶被放置于30℃中以200rpm摇晃。隔天，取5ml的种子瓶液以接种于以基于大豆的培养基。

在进行种子浇淋之前，根据每毫升的CFU将全发酵液的终浓度稀释成商用产品的64盎司/英亩的施用率。64盎司/英亩是指每颗种子的菌落形成单位的数量，或2.2×10⁸CFU/植物。此处所使用的量根据该全发酵液的cfu/ml计算。

将穴盘（Hummert公司，目录编号14-3128）填满Sunshine3号培养土（Sun Gro园艺公司）（润湿及灭菌1小时，然后经通气3天），在各孔穴种入一颗种子。使用‘Spring Treat Hybrid’玉米种子、‘Derkwin’小麦种子，及‘QualiT21’番茄种子。因此，本试验包括单子叶植物（即玉米和小麦）及双子叶植物（即番茄）。每个穴盘接着以2ml的全发酵液样本处理，未经处理的对照组接受2ml的水。穴盘自底部吸水，通过将该穴盘放在没有孔的装满水的盘中。这些穴盘被放在室温中高强度光照（约300爱因斯坦（Einsteins），设定为16小时光照/8小时黑暗周期）之下。在需要时进行浇水。不使用肥料。

在浇淋这些种子后2周，观察番茄植株的植物生长增进特性。接着量化叶子的表面积。

该经3610WT处理的植物并未显示比经水处理的植物更绿或更高。相反地，经3610swrA^-处理的植物似乎比经3610WT处理的植物更绿及更高（资料未显示）。这些结果经量化证实，对比经3610swrA^-处理的植物的叶表面积（图31）。在五株随机选择的番茄幼苗的对比中，经3610swrA^-处理的植物的第一片真叶的平均叶绿素含量并未显示较高的叶绿素含量（图32）。

类似的试验在小麦及玉米中进行。根据定性观察的结果，经3610WT处理的植物和经3610swrA^-处理的植物在高度和颜色方面类似的，不过二者皆比经水处理的对照组更高和更绿。然而，这些差异在单子叶植物相当细微（在短期的温室试验中），因此可能无法经由此定性试验分辨。

实施例21－3610swrA^-对抗辣椒疫霉的植物内活性

如上所述的3610WT和3610swrA^-菌株生长于瓶中的以基于大豆的培养基中，所述全发酵液以20％的浓度测试对抗辣椒疫霉的活性。该辣椒疫霉生长于V-8琼脂上1至2周。在此期间结束时，以无菌镊子切下该盘外围1/4英寸的部分并丢弃。在该盘中加入无菌去离子水至淹没琼脂的高度，在室温光照下培养2天以利于孢子囊产生。接着将该盘置于4℃中一个半小时，然后置于室温中一小时，以释放孢子囊中的游动孢子。在显微镜下用血球计数盘量化游动孢子的浓度，随机拍摄3张照片并计算游动孢子的平均数量。该游动孢子的浓度接着被稀释成2×10⁴游动孢子/ml以用于接种（10ml/植物）。

种植于培养土中的二周龄椒（品种‘California Wonder’）各以10ml的全发酵液处理浇淋，隔天接种辣椒疫霉。观察这些植物8天。接着对比处理组与经感染的对照组（IC）和未经感染的对照组的比例（见图33）。含有三乙膦酸铝的化学杀真菌剂Aliette亦经测试于3.2mg/ml及1.6mg/ml的浓度。

3610swrA^-的处理相较于3610的处理在较长时间提供较多数量的全植物存活的植物保护（见图33）。

实施例22－AQ30002对抗线虫的活性

使用黄瓜种子苏丹变种进行试验以测定AQ30002对抗爪哇根结线虫（根结线虫）的活性。含有20g沙子及一颗未发芽种子的50ml离心管以不同比率的AQ30002的全发酵液处理。为了获得AQ30002的全发酵液，在含有LB培养基（Luria Broth）的种子瓶中接种AQ30002及置于30℃过夜生长。隔天，取自各种子瓶中的等分被接种至1L振荡培养瓶中的200ml以基于大豆的培养基，使其生长直到孢子形成。简言的，该振荡培养瓶被维持在介于30℃至32℃的温度，振荡器设定于200至220rpm。在大约培养3天后，当细胞生长及代谢物产生停止时，收集该培养菌液。

使该经处理的种子在温室中发芽及生长。在处理后4至5天（DAT），在各试管中接种100只根结线虫的二龄幼虫。在处理后第10天，以表4所述的0至4分纪录该幼苗形成根瘿的百分比。

接着以酸性品红染色根部以观察线虫穿透及发育，并在徕卡（Leica）解剖显微镜下观察。以线虫穿透而言，计算在各根部内的线虫幼虫总数。以线虫发育而言，计算所有肥幼虫包括二龄晚期幼虫（J2）及三龄幼虫（J3）的数量。如表4所述纪录线虫穿透至根部及线虫在穿透后的发育。所利用的技术的细节可见C.O.Omwega,et al.,“ANondestructive Technique for Screening Bean Germ Plasm forResistance to Meloidogyne incognita,”Plant Disease（1988）72（11）:970-972）。

表4细菌全发酵液的抗线虫活性的评分表。根瘿指数根据根部形成根瘿的百分比。穿透评分以平均线虫幼虫总数相对于未经处理的对照组（UTC）中的线虫幼虫数量计算。发育评分反映在根部内的线虫肥幼虫（J2晚期/J3期）的总数。

图34显示施用AQ30002全发酵液减少根部根瘿。图35显示施用各种比率的AQ30002相较于未经处理的对照组减少根瘿形成、穿透及发育。应注意的是，由于这些资料根据上述评分系统，因此不一定可以观察到剂量反应。

实施例23－AQ30002控制番茄的根结线虫的效果

另一试验在番茄种子进行，以测试AQ30002控制根结线虫（爪哇根结线虫）虫卵的效果。在不同时间点于生物反应器中制备第1批AQ30002及第2批AQ30002。简言的，解冻一小瓶保存菌液，将该菌液转移至含有狄菲克（Difco）公司营养肉汤的无菌瓶中。该培养瓶接着被放在旋转振荡器上培养（培养温度介于28℃至32℃，旋转速度为200至220rpm），以促进细胞生长及获得高细胞密度，接着将其添加至20L生物反应器中的12L以基于大豆的生长培养基。该生物反应器被设定为介于30℃至32℃的温度范围、自500至1000rpm的搅动速度、经缓冲以维持介于6至8的pH，及介于0.5至1.0VVM的通气量。在大约培养3天后，当细胞生长及代谢物产生停止时，收集该培养菌液。

三周龄的番茄植物经AQ30002浇淋处理。接着将该盆器放在温室中生长10天，之后在每盆中接种5000颗根结线虫（“RKN”）虫卵。在线虫接种后42天采收植物。利用1％NaOCl溶液收集番茄植物根部的虫卵，如Hussey RS,Barker KR,“A Comparison of Methods ofCollecting Inocula of Meloidogyne spp.,Including a NewTechnique,”Plant Disease Reporter,1973;57:1025–1028中所述。AQ30002减少在每株植物所观察到的根结线虫虫卵数量。这些资料直接计算的虫卵数量，非使用评分系统。与未经处理的样本（UTC）对比的结果显示于图36。

实施例24－筛选swrA^-自发性突变

自枯草芽孢杆菌分支内的菌株筛选swrA^-自发性突变株可如下述进行。在1公升瓶中的250mLLB培养基（Luria Broth）液体培养基中接种源自适当琼脂板上的单一菌落。此菌于30℃下以200rpm在回转式振荡器上培养16至20小时。该形成的菌液将以磷酸缓冲液连续稀释成1×10³、1×10⁶、及1×10⁹，各取100μl的稀释液接种于适当的琼脂板上并于37℃下培养12至16小时。产生150至200个单菌落的稀释板被移置于4℃冰箱中24至48小时。在4℃中静置24至48小时后，可能的swrA^-分离株在琼脂板上呈现明显白色、砂纸样的形态学，然而不呈现此形态学的swrA⁺的分离株通常变得透明且难以在板上看见。

收集可能的swrA^-突变株，在LB中于30℃以250rpm过夜培养。利用MoBio套组所提供的MoBio微生物DNA分离套组离心程序进行基因组DNA分离。突变株以该swrA基因座的PCR及测序加以识别，使用如上述分离的基因组DNA，及利用下列芽孢杆菌特异性PCR引物或用于被筛选菌株的受到关注的一般性引物以进行PCR扩增。

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

BA_swrA_PCRF AAACAATGAAAAAAGCCGTTCTGG

BA_swrA_PCRR TCCGTGATAATCAAAAGGCC

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

BP_swrA_PCRF AAAGAATGATCTTCAGCTAC

BP_swrA_PCRR ATTAAAAACAGACCGACCGC

地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）

BL_swrA_PCRF CATAATGAATAGAATTGACCCG

BL_swrA_PCRR GAAACCCAGCTTGTCTAAAG

枯草芽孢杆菌

BS_swrA_PCRF AATGAAACTTTTGCAAGTTGCC

BS_swrA_PCRR AATCGATATTCCGAGTCCAC

未经识别的芽孢杆菌菌株

Bac_swrA_PCRF ACGCTKTAYAARTGGCTSAC

Bac_swrA_PCRR TCATCCAKAYCGTVACATTDG

以下列出用于扩增swrA基因座加上3′及5′UTR的大约150个核苷酸的PCR程序及反应条件：

每次反应的PCR反应成份

2.5μl gDNA–终反应液≤250ng

5μl GoTAQ5x缓冲液–终反应液1X

1μl GoTAQ MgCl₂–终反应液1mM

0.5μl10mM dNTPs–终反应液0.2mM

0.25μl0.1nMol前置引物–终反应液1pMol

0.25μl0.1nMol反置引物–终反应液1pMol

0.25μl GoTAQ–终反应液1X

15.25μl H₂O

总反应体积25μl

适当的PCR循环条件如下所示：

94℃2:00分钟

94℃0:30分钟

55℃0:30分钟

72℃2:00分钟

25个循环

72℃5:00分钟

保持4℃恒温

利用适当的DNA染料及大小梯状条带在1％洋菜糖胶体上观测5％的PCR反应液。PCR产物大约700个核苷酸长的单股。在测序之前，以2μl的ExoSap-It酶清洁5μl的经扩增的DNA。经清洁的扩增子利用桑格（Sanger）法测序以前置或反置PCR引物测序。该swrA基因座序列利用ClustalW序列比对工具与野生型参考菌株（较佳地相同菌种）对比，识别任何核酸改变、筛除或插入。

该swrA基因座中的突变导致改变的菌落形态学、相较于野生型swrA⁺在液体生长期间促进链结、在0.7％琼脂上丧失群聚性芽孢杆菌的群聚能力、和/或更坚固的根部生物膜形成。

实施例25－通过各种方法的生产swrA^-突变株

swrA⁺芽孢杆菌菌株的swrA基因减弱的反义构建体可通过PCR建构，自源自QST713或其它swrA⁺芽孢杆菌的基因组DNA的该swrA编码区的反向互补序列扩增。PCR引物经设计以具有相容于供插入先前建构的endoPro_swrA质粒载体的限制酶切割位点，该质粒载体经设计以与存在于枯草芽孢杆菌MMB869中的整合性接合因子（ICE）相容（WiepKlaas Smits and Alan D.Grossman,“The TranscriptionalRegulator Rok Binds A+T-Rich DNA and Is Involved in Repressionof a Mobile Genetic Element in Bacillus subtilis,”PLoSGenetics（2010）6（11）:e1001207；Catherine A.Lee,et al.,“Identification and characterization of int（integrase）,xis（excisionase）and chromosomal attachment sites of theintegrative and conjugative element ICEBs1of Bacillussubtilis,”Molecular Microbiology（2007）66（6）:1356-1369）。该swrA编码区通过限制酶消化endoPro_swrA质粒被插入且插入该swrA基因的反向互补序列。该swrA反义构建体可通过测序经纯化的质粒DNA而证实为正确地插入质粒载体中，并无PCR导入的核酸改变。见实施例7。

该swrA基因座中的突变导致改变的菌落形态学、相较于野生型swrA⁺在液体生长期间促进链结、在0.7％琼脂上丧失群聚性芽孢杆菌的群聚能力、和/或更坚固的根部生物膜形成。

基于mariner的转座子TnYLB-1（Le Breton,Y.,Mohapatra,N.R.,and W.G.Haldenwang,2006.In Vivo Random Mutagenesis ofBacillus subtilis by Use of TnYLB-1,a mariner-BasedTransposon,Appl.Environ.Microbiol.72:327-333）亦可被用来的生产swrA^-突变株。由于有Himar-1转位酶的存在，mariner辨识、切割及插入其自身于二个反向插入（IS）元件，并随的携带位于这种IS元件之间的任何外源性DNA。TnYLB用于芽孢杆菌属的经修饰的mariner转座子。卡那霉素抗药性标志被插入这种IS元件之间以快速筛选嵌入物。TnYLB由质粒pMarA传送（Le Breton et al.,2006–同上）。除了给予宿主芽孢杆菌卡那霉素抗药性之外，由于扰乱开放阅读框，因此插入通常产生丧失功能性突变。通过筛选群聚能力的丧失或砂纸样菌落的形态学及确认转座子插入该swrA基因座，swrA^-突变株可被的生产。

pMarA质粒通过电穿孔被导入swrA⁺芽孢杆菌菌株，该质粒编码该mariner IS元件、卡那霉素抗药性基因及该IS元件以外的himar1基因（以确保该元件稳定存在基因组中）。该pMarA质粒骨架具有mls（巨环内酯-林可霉素-链霉杀阳素B）抗药性基因以确保在转位后丧失该pMarA质粒。其具有温度敏感性起点，以允许mls或卡那霉素筛选。该含有pMarA质粒的swrA⁺芽孢杆菌菌株在室温中、在摩天轮式混合器上、过夜生长于3ml LB+mls中。该含有pMarA质粒的swrA⁺芽孢杆菌菌株经稀释接种于LB（以测定总菌落形成单位）和含有20μg/ml卡那霉素的LB上（以测定转位株的数量）并于45℃过夜培养。菌落被再画线于含有卡那霉素的LB板及mls板上。具有卡那霉素抗性/mls敏感性的菌落被保留以供进一步分析。可能的转座子插入该swrA基因座具有砂纸样菌落形态学、减少在0.7％LB琼脂板上的群聚能力。

在识别假定的swrA转座子插入时，该插入的确切位置由反向PCR（iPCR）测定。源自转座子突变株的基因组DNA经高频率限制酶诸如Sau3AI或TaqI的分离及消化。该经消化的DNA被重新接合以形成环化DNA片段。当使用被设计于该TnYLB转座子内的引物时，包含该转座子的一个IS元件及邻近宿主基因组DNA的环化片段成功地产生PCR片段。

iPCR引物：

2507AGGAGGAATTCTACGGAAGTGTTAATTTCATAC

2508TCCATGCTCGAGGAAGAGC

2509ACAGAAAGTCTCGAGATCGTC

2510CTCCTGGATCCTCAATGGCTTTTTGGAAATCAG

该iPCR产物以朝外扩增引物纯化及测序。每个突变株的序列标签经的生产并与靠近该swrA基因座的基因组序列比对。包含swrA基因座基因组DNA的转座子可能扰乱swrA功能。

通过转位以基因减弱该swrA基因座导致改变的菌落形态学、相较于野生型swrA⁺在液体生长期间促进链结、在0.7％琼脂上丧失群聚性芽孢杆菌的群聚能力、和/或更坚固的根部生物膜形成。

除非另行定义，此处的所有技术及科学术语具有本发明所属领域的一般技术人员所通常理解的相同意义。虽然任何方法及材料（与此处所描述者类似或相等）均可被用于实施或测试本发明，该较佳的方法及材料在此处描述。所有被引用的发表文献、专利及专利公开资料以参照方式整体纳入此处以符合所有目的。

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