肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用

技术领域

本发明涉及RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及肠道病毒71型阜 阳株及其减毒株的cDNA感染性克隆及应用。

背景技术

肠道病毒(Enterovirus)71型(EV71)属于小核糖核酸病毒科， 肠道病毒属。基因组为单股正链RNA。EV71主要感染5岁以下的儿童， 通过粪-口途径或飞沫进行传播，其感染主要引起手足口病(HFMD)， 在临床上与柯萨奇病毒A16感染所引起的手足口病难以区别。严重 的EV71感染还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质 炎样麻痹以及心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病，导致重 症甚至死亡病例的发生。EV71自1969年首次由Schmidt等从加利福尼 亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来后，已在世界范 围内引起十多次的爆发和流行。近年来，EV71的流行在亚太地区呈 上升趋势，令人关注的是该地区的EV71感染引起越来越严重的中枢 神经系统症状。2008年和2009年以EV71感染为主的手足口病在中国 大陆多个省市流行，共导致479名儿童死亡。目前尚无治疗EV71感染 的特效药物，主要通过对症治疗控制病情的发展。

EV71的基因组为长约7400个核苷酸的单股正链RNA，含有一个 开放阅读框(ORF)，可编码一条2193个氨基酸的多聚蛋白，包括编 码结构蛋白的P1区(VP4、VP2、VP3、VP1)以及编码非结构蛋白的 P2区(2A、2B、2C)和P3区(3A、3B、3C、3D)。基因组两侧分别 为5’非编码区(5’-UTR)和3’非编码区(3’-UTR)，对于病毒的复制， 病毒蛋白的翻译及基因组RNA的感染性具有重要作用。研究证实与 EV71同属肠道病毒的脊髓灰质炎病毒，其5’-UTR区、VP1以及3C蛋 白酶和3D聚合酶的编码区和3’-UTR区存在神经毒力决定位点，推测 EV71的神经毒力决定簇也位于这些区域中。McMinn等通过比对1999 年澳大利亚EV71流行株的VP1基因序列，发现临床症状表现为手足口 病的毒株和具有神经毒性的毒株主要区别位于VP1蛋白第170位氨基 酸丙氨酸到缬氨酸的替换。该位点的变化可能导致了VP1蛋白空间结 构的改变，从而使病毒与宿主细胞的结合能力和病毒的毒力发生改 变。2005年，Arita等通过在EV71标准株BrCr的cDNA感染性克隆中引 入一系列突变，证明了在猕猴模型中，位于5’-UTR区、VP1结构蛋白 和3D聚合酶编码区以及3’-UTR区的决定温度敏感性的突变位点可以 减弱病毒的神经毒力。2011年，Phuektes等通过在两株细胞生长表型 不同的EV71毒株的感染性克隆之间进行5’-UTR区、P1区和 P2-P3-3’-UTR区的置换，证明两株病毒的生长表型差异是由P1区和 P2-P3-3’-UTR区共同决定的，单一区段的对换对表型的影响并不完全 匹配。许多研究也证明临床表现不同的毒株基因组序列的差异并不 大，从而提示EV71的毒力决定位点并非为单一位点，可能受到多个 基因组功能区域的共同影响。此外，宿主的免疫应答反应对病毒的毒 力也有影响。

应用反向遗传学技术构建RNA病毒的感染性克隆，可以通过基因 工程的技术手段较容易地实现对病毒基因组的改造，如定点突变、重 组、缺失和嵌合等，为阐明病毒的致病机制，定位病毒的毒力决定簇、 研发新的抗病毒药物及获得新的疫苗候选株奠定重要的基础。

发明内容

本发明的目的是提供肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感 染性克隆及应用。

为了实现本发明目的，本发明的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感 染性克隆，其是通过反向遗传操作获得的肠道病毒71型阜阳株的 cDNA感染性克隆。

前述的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆，其编码的氨基 酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几 个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第930位蛋氨 基酸替换为精氨基酸，或将第1152位精氨基酸替换为赖氨基酸，均不 会影响其功能。

前述的肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆，其核苷酸序列 如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供含有上述肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆 的载体。优选地，出发载体为pBR322。

本发明还提供含有上述肠道病毒71型阜阳株的cDNA感染性克隆 的宿主细胞，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)FY/pBR322/DH5α， 已于2012年2月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，保藏号为CGMCC No.5820。

本发明的肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感染性克隆，其 是通过反向遗传操作获得的肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感 染性克隆。

前述的肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感染性克隆，其编 码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将第930 位精氨基酸替换为蛋氨基酸，或将第1152位赖氨基酸替换为精氨基 酸，均不会影响其功能。

前述的肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感染性克隆，其核 苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供含有上述肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感 染性克隆的载体。优选地，出发载体为pBR322。

本发明还提供含有上述肠道病毒71型阜阳株的减毒株的cDNA感 染性克隆的宿主细胞，其为大肠埃希氏菌(Escherichia coli) ZD/pBR322/DH5α，已于2012年2月29日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.5819。

本发明还提供构建上述肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA 感染性克隆的方法，其是以肠道病毒71型阜阳株(FY)及其实验室 传代减毒株(ZD)的基因组为模板，通过RT-PCR得到全长cDNA克 隆。

本发明还提供制备肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的拯救病毒 的方法，首先对肠道病毒71型阜阳株及其减毒株进行全基因组测序， 根据测序结果设计用于构建cDNA克隆的引物和酶切位点，通过引物 在基因组cDNA的5’端引入T7启动子，在其3’端引入polyA尾，然后分 别以肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的基因组为模板，进行RT-PCR 反应，得到全长cDNA克隆，酶切线性化后进行体外转录，用体外转 录出的RNA转染vero细胞，获得FY株和ZD株的拯救病毒。通过观察 细胞病变效应(CPE)、RT-PCR测序、western blotting检测、间接免疫 荧光检测及绘制病毒的增殖曲线对拯救出来的病毒进行检测，并通过 在两株病毒的感染性克隆间进行不同基因区段的置换，构建了一系列 病毒嵌合体，研究影响EV71复制增殖及毒力的决定位点。

本发明进一步提供上述肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA 感染性克隆在制备抗EV71病毒药物及疫苗中的应用。

本发明构建的肠道病毒71型阜阳株及其减毒株的cDNA感染性克 隆，为阐明EV71的致病机制，寻找EV71的毒力决定位点以及抗EV71 病毒药物的研发和EV71疫苗的研发奠定了重要的基础。

附图说明

图1为通过比对26株EV71的结构蛋白VP1的基因序列绘制的系统 进化树。

图2为体外转录得到的病毒基因组RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为用脂质体转染FY株和ZD株的基因组RNA到Vero细胞，观察 到的CPE结果。

图4为分别接种两株病毒的拯救病毒(R1)及其母本病毒(WT) 的Vero细胞裂解液的Western blotting结果。

图5为分别接种两株病毒的拯救病毒(R1)及其母本病毒(WT) 的Vero细胞的间接免疫荧光检测结果。

图6为FY株和ZD株的拯救病毒在Vero细胞中的增殖曲线。

图7为FY株和ZD株的嵌合株克隆的框架示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1肠道病毒71型FY株与ZD株的基因组测序与序列分析

根据EV71基因组的保守序列设计了9对通用引物对肠道病毒71 型中国阜阳2008年流行株(FY)及其实验室传代减毒株(ZD)进行 了全基因组测序。使用DNAStar软件对FY株和ZD株的基因组序列包 括5’-UTR区、3’-UTR区和蛋白编码区的序列以及编码的多聚蛋白的 氨基酸序列进行了分析和比对。FY株与ZD株的全基因组序列一致性 为97％，其中5’-UTR区的序列一致性为98％，3’-UTR区的一致性为 99％，蛋白编码区为97％。两株病毒的多聚蛋白的氨基酸序列一致性 为99％，突变氨基酸的位点及名称如表1所示。通过比对26株EV71的 结构蛋白VP1的基因序列，应用MeGa3.1软件绘制系统进化树(图1)。 从进化树上可见FY株与2008年的临床分离株进化距离较近，而ZD株 与2009年的临床分离株距离较近。

表1 FY和ZD两株病毒多聚蛋白的突变氨基酸位点

实施例2 肠道病毒71型FY株与ZD株的全长cDNA感染性克隆的 构建

根据测得的基因组序列和选择的酶切位点设计了2对引物，5’端 上游引物Sal-T7-FY+引入了T7启动子序列及Sal I酶切位点，3’端下游 引物Hind-End-引入了37个Poly(T)及HindIII酶切位点，由Sangon公司 合成。用Trizol提取病毒基因组RNA。用长片段逆转录酶M-MLV  Reverse Transcriptase(货号：M1705，购自Promega公司)以病毒基因组 RNA为模板，以3’端下游引物Hind-End-为反转录引物，42℃作用2h 反转录得到病毒基因组全长cDNA。以其为模板，用DNA聚合酶 PrimeSTAR(货号：DR010S，购自TaKaRa公司)分两段进行PCR反 应扩增全长基因组序列。RT-PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行 检测。产物经胶回收纯化后，双酶切依次连入pBR322载体，用Sal I 和HindIII酶切鉴定是否插入了目的片段，并对阳性克隆进行全长的基 因组测序，排除克隆构建过程中突变的引入。肠道病毒71型阜阳株及 其减毒株的全长cDNA克隆，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3 和4所示，由其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和2所示。

用构建好的EV71全长cDNA克隆转化大肠埃希氏菌(Escherichia  coli)DH5α，得到FY/pBR322/DH5α和ZD/pBR322/DH5α，保藏号分别 为CGMCC No.5820和CGMCC No.5819。

实施例3体外转录与细胞转染

细胞培养：待Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)生长为单层，用PBS 清洗细胞面3次。用0.25％的胰酶消化细胞，待细胞变圆时终止消化， 将胰酶吸出，立即加入含10％FBS的高糖DMEM培养基，用吸管轻轻 吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底并分散为单细胞悬液。血球计数板计 数后，用培养基将细胞浓度调整为2×10⁵个/ml，六孔板每孔接种2ml， 置37℃，5％CO₂孵箱培养。24h后(细胞丰度为80％)用于RNA转染。

体外转录与细胞转染：用HindIII对EV71 cDNA克隆的3’端进行酶 切，得到线性化的DNA模板，酚-氯仿抽提纯化后用T7RNA聚合酶体 外转录试剂盒MEGAscript High Yield Transcription Kit(货号： AM1334，购自Ambion公司)在体外转录出RNA，用Trizol进行提取和 纯化。EV71基因组RNA长度为7400bp左右，经1％琼脂糖凝胶电泳 鉴定，RNA带型比较集中，条带大小正确(图2)。Vero细胞培养于含 10％FBS的DMEM培养基中，接种六孔板24h后，换成不含血清的 DMEM培养基，用Lipofectamine^TM2000进行转染，每孔转染2μg RNA。 转染后每天观察细胞，可见典型的CPE，部分细胞圆缩、脱落。待CPE 达75％以上或观察7d后，收获病毒感染的细胞及培养液进行鉴定与传 代。FY株基因组RNA转染细胞后，病毒的增殖及细胞CPE的进展明 显比ZD株快很多。转染1d后，两株病毒均产生零星的细胞病变。而 转染3d后，FY株产生的CPE可达80％以上，而ZD株产生的CPE没有明 显进展。直至转染7d后，ZD株产生的CPE才可达80％以上(图3)。

实施例4RT-PCR鉴定拯救病毒的特异序列

应用通用引物2F(1094)(5’-GCAGTGGATAAACCAACGC-3’) 和2R(2116)(5’-ATAGGCTATGAGCATCTTGC-3’)通过RT-PCR反 应扩增病毒基因组第1094位至2116位核苷酸序列，通过测序分析对拯 救病毒进行鉴定，结果显示两个感染性克隆分别拯救出与其序列一致 的EV71病毒株。

实施例5免疫印迹(Western blotting)检测

当六孔板中Vero细胞的CPE达到50％时，用1ml预冷的PBS收集细 胞并加入细胞裂解液RIPA(购自Promega公司)，冰浴半小时裂解细 胞，离心收集上清液，即为细胞与病毒的总蛋白样品。进行SDS-PAGE 电泳，转膜，抗体孵育及ECL显色。其中一抗为抗EV71鼠单克隆抗 体(货号：ab36367，购自abcam公司)，二抗为辣根过氧化物酶(HRP) 标记的山羊抗鼠IgG二抗(货号：SC2031，购自Santa Cruz公司)。免疫 印迹结果证明两株病毒的拯救病毒与其母本病毒(wild type WT)具有 分子量一致的病毒蛋白。而且ZD株与FY株相比，在分子量大于VP2 蛋白的位置多出一条VP4和VP2的前体蛋白VP0，在分子量小于VP2 蛋白的位置，多出一条VP3结构蛋白(图4)。两毒株病毒蛋白带型的 差异可能是由于氨基酸突变引起蛋白构象和抗原表位发生改变导致 的。

实施例6间接免疫荧光检测

Vero细胞接种到放置于六孔板中的玻片上，2d后长至单层。分别 以0.5MOI接种拯救病毒株及其母本株到Vero细胞，于37℃，5％CO₂孵箱中培养。病毒接种12h后，CPE达25％左右，用预冷的甲醇固定细 胞。2％脱脂奶粉封闭1h后，用1∶1000稀释的抗EV71鼠单克隆抗体(货 号：ab36367，购自abcam公司)37℃孵育1h。PBS清洗细胞3次，用异 硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG二抗(货号：94372，购 自中杉金桥公司)孵育1h。荧光显微镜观察可见明亮的绿色荧光分布 在细胞质中，且拯救病毒株与其母本株无明显差异。细胞对照无荧光 (图5)。

实施例7 微量滴定法测定病毒的滴度(TCID₅₀)

将Vero细胞接种至96孔板，按1×10⁴个/孔进行接种。2d后细胞长 成致密单层。取待滴定的EV71病毒液进行10倍梯度稀释，即10^-1～1^0-9。 倾掉96孔板中的生长液，用不含血清的DMEM培养基清洗2遍。每个 稀释度设4孔，每孔加100μl病毒稀释液。另设病毒对照，每孔加病毒 原液100μl；细胞对照，每孔加DMEM培养基100μl。置37℃，5％CO₂培养箱培养。每日观察细胞的CPE变化并记录结果，一般需要观察5-7 天。按Reed-Muench法或Karber法计算结果得，收获的拯救病毒FY株 的滴度为10⁸lgTCID₅₀，ZD株的滴度为10^7.5lgTCID₅₀。

实施例8绘制病毒增殖曲线

待六孔板vero细胞长至单层，用不含血清的DMEM培养基清洗细 胞面2次，将两株拯救病毒按1MOI接种细胞，37℃吸附30min后吸弃 病毒接种液。然后六孔板每孔补加2ml含2％FBS的维持液，置37℃， 5％CO₂培养箱培养。在接种病毒后的0h、2h、4h、8h、12h、24h、 36h、48h和72h分别收集病毒培养上清和病毒感染的细胞至EP管中。 将不同时间点收集的病毒样品在常温和-80℃反复冻融3次，使病毒颗 粒充分释放出来。4℃3000rpm离心10min，去除细胞碎片，上清即为 收获的病毒液。用微量滴定法测定各个时间点收获的病毒样品的滴 度，绘制病毒的增殖曲线(图6)。结果显示FY株与ZD株在细胞中的 增殖趋势相似，ZD株的滴度略低于FY株。

实施例9构建FY株和ZD株的嵌合株克隆

分别以FY株和ZD株的感染性克隆为模板，用上游引物 Sal-T7-FY+(5’-ACGCGTCGACTTAATACGACTCACTATAGTTAAA ACAGCCTGTGGGTTGCAC-3’)和下游引物EV71-1108C-(5’-TGGTT TATCCACTGCTGTAGCGTC-3’)进行RT-PCR反应扩增得到5’-UTR片 段，经内切酶Sal I和BbvC I双酶切分别连接到ZD株和FY株感染性克 隆，得到置换5’-UTR区的嵌合株(ZD5’-FY和FY5’-ZD)。将FY株和 ZD株的感染性克隆经PspOM I和HindIII双酶切，分别连接入ZD株和 FY株的感染性克隆，得到置换3C-3D-3’-UTR区的嵌合株(FY-ZD3’和 ZD-FY3’)。将FY株和ZD株的感染性克隆经BbvC I和PspOM I双酶 切，分别连入ZD株和FY株感染性克隆，得到置换 VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B区的嵌合株(FY5’-ZD-FY3’和 ZD5’-FY-ZD3’)。通过两对引物，FY-837-F(5’-ACTACAAAGACTC CTATGCTGCCAC-3’)和FY-VP1-R(5’-TCCAAATTTCCCAAGAGTG GTGATCGCTGTGCGACTG-3’)以及ZD-2A-F(5’-ATCACCACTCTTG  GGAAATTTGGACAACAGTCTGGGGC-3’)和Hind-5419C-(ZD)(5’-C CCAAGCTTAGTAGGGAGAGAGCAAAATCAAGGC-3’)进行搭桥 PCR，得到FY(VP4-VP2-VP3-VP1)-ZD(2A-2B-2C-3A-3B)片段； 通过另外两对引物，FY-837-F和ZD-VP1-R(5’-TCCAAATTTCCCAAG AGTAGTGATCGCTGTGCGACTG-3’)以及FY-2A-F(5’-ATCACTACT CTTGGGAAATTTGGACAACAGTCTGGGGC-3’)和Hind-5418C- (FY)(5’-CCCAAGCTTAGTAGGGAGAGAGCAAAGTCAAGGC-3’) 进行搭桥PCR，得到ZD(VP4-VP2-VP3-VP1)-FY(2A-2B-2C-3A-3B) 片段。将以上片段经BbvC I和PspOM I双酶切连入FY株和ZD株感染 性克隆，分别得到置换VP4-VP2-VP3-VP1区的嵌合株(FY-ZDP1和 ZD-FYP1)以及置换2A-2B-2C-3A-3B区的嵌合株(FY-ZDNS和 ZD-FYNS)(图7)。将以上嵌合株经体外转录，RNA转染拯救出相应 毒株的病毒，研究这些嵌合株病毒的生长增殖及生物学特性，分析病 毒毒力的决定位点。

实施例10利用感染性克隆获得的拯救病毒筛选抗病毒药物

Vero细胞接种96孔板2d后长至单层，用不含血清的DMEM培 养基清洗细胞面2次。将肠道病毒71型FY株或ZD株的拯救病毒液 用含2％FBS的维持液稀释至100TCID₅₀/100μl。将发酵液或待测化合 物用维持液进行10倍梯度稀释，然后进行抗EV71活性测定。每个 样品设有药效孔和毒性孔。药效孔加入100μl病毒稀释液和100μl药 物稀释液；毒性孔加入100μl药物稀释液和100μl维持液。另外设细 胞对照孔(加入200μl维持液)和病毒对照孔(加入100μl病毒稀释 液和100μl维持液)。置37℃，5％CO₂培养箱培养，每天观察记录细 胞的病变效应(CPE)，分析药物抗EV71的活性。

培养3d后，细胞对照孔无CPE出现，病毒对照孔达100％CPE， 以CPE低于50％且无药物毒性的化合物为初筛阳性结果，通过后续 的复筛进一步确定其抗EV71的活性。以利巴韦林和干扰素作为阳性 药物对照，结果显示浓度为10μg/ml的利巴韦林和干扰素对拯救病毒 增殖的抑制率均达75％以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。