用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术

技术领域

本发明属于球根花卉组织培养和遗传育种领域，尤其涉及用于兰州百合遗传转化和种球繁育的tTCL离体再生技术。 

背景技术

兰州百合(Lilium davidii var unicolor)为百合科百合属多年生球根花卉，是川百合的一个变种。地下鳞茎个大色白，经多年栽培直径可达10-15 cm，其鳞片紧密，肉质瓣厚，粗纤维少，内含丰富的蛋白质、淀粉、糖等营养物质，丰润、味醇香甜，采收其鳞茎部分作为食用，有丰富的营养价值和药用保健功效，是我国原产且栽培历史悠久的优良百合类型。其花瓣反卷、花色橙红，观赏价值高，而且植株抗旱性、抗逆性和耐盐碱性均较强，是育种中培育新种质的良好材料。 

20世纪70年代起，植物细胞薄层培养技术(thin cell layers，TCL)起源并迅速发展，目前已成功应用于观赏植物的组培快繁中。TCL系统原意是从外植体上撕下厚3-6层细胞（包括表皮细胞、形成层细胞及薄壁细胞），如今薄层培养也指将外植体横切为厚约1-5 mm薄片的培养，即tTCL(transverse TCL)。对植物生长发育调控机制与分子机制等研究有深远意义。迄今已成功用于烟草、水稻、龙胆等植物快繁中，并在菊花、兰花、月季等观赏植物中取得不同程度的研究进展。 

长期以来，兰州百合生产过程中种球退化现象严重，表现为鳞茎变小，子鳞茎数量增多，建立高效的种球快繁体系进行种球更新与复壮成为兰州百合生产的关键技术环节。过多的无性繁殖导致有性繁殖功能不同程度地退化，且若仅依赖于常规杂交育种手段，因杂交亲本遗传背景较为单一，品种改良进程与效果受到局限。虽然近年来百合的组织培养和遗传转化研究取得了一些进展，但因受基因型的限制，目前尚未建立完善的基于基因转化和种球繁育的百合高频再生体系。而前人研究发现，采用使所有细胞都接触到筛选培养基的薄层细胞培养方法，不仅能大幅度增加与农杆菌接触的表面积，而且可避免转化细胞嵌合体的出现。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于兰州百合遗传转化和种球快繁的tTCL离体再生技术，采用tTCL（薄层培养）方式，以兰州百合鳞片、顶芽为试材，选择合适的培养基，诱导小鳞茎直接分化，从而避免愈伤组织诱导，降低变异频率，缩短种球繁育周期，减少成本，为百合转基因育种提供前提和基础。 

本发明提供的技术方案，包括以下工艺步骤： 

1. 灭菌消毒：取生长健壮、无病虫害，周径12-14 cm的兰州百合鳞茎，由外向内剥取鳞片、顶芽，洗衣粉水浸泡半小时，清水洗去表面泥沙，在自来水下流水冲洗12小时后备用；

在超净工作台上，先用浓度75%酒精灭菌60秒，再用浓度1.5%的次氯酸钠溶液浸泡15 分钟，期间不断进行摇动，最后用无菌水冲洗6次，每次不少于3 分钟；

2. 薄层培养切割：将步骤1所得的无菌外植体置于无菌滤纸上滤干水分，沿鳞片周围切去1 mm，随后横切为厚1-2 mm弯月形切片，顶芽横切成3-4 mm圆形切片；且鳞片和顶芽薄层均含有完整的外表皮细胞。

3. 接种：将步骤2所得的鳞片和顶芽薄层平铺于含诱导培养基MS+BA+NAA的培养皿中，并用无菌镊子按压外植体，使一半厚度的外植体插入培养基中； 

4. 小鳞茎诱导：培养室温度为25±1℃，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m^-2·s^-1；所有小鳞茎均由鳞片和顶芽薄层直接诱导所得，而未经愈伤组织和不定芽阶段；

5. 小鳞茎扩繁：诱导培养4周后，需提高培养基中BA和NAA的浓度，且降低BA/NAA比值，以利于小鳞茎扩繁；诱导形成的小鳞茎需按单个切下，且底部带有2 mm长接种的原鳞片薄层；

6. 小鳞茎膨大及生根：扩繁培养2代后，培养基中停止添加BA和NAA，且加倍蔗糖含量，以利于小鳞茎膨大。随后将小鳞茎转入生根培养基中诱导生根。

所述的培养皿直径为9 cm，含培养基体积为20 mL。 

所述的MS固体培养基含有蔗糖30 g·L^-1，琼脂（条）7 g·L^-1 ，pH 5.8，121℃高压灭菌20 分钟。 

所述的小鳞茎诱导培养基含BA和NAA，BA的浓度为0.5-1.5 mg·L^-1， NAA的浓度为0.1-0.5 mg·L^-1，即BA/NAA比值较大为宜。 

所述的小鳞茎扩繁培养基需提高BA浓度且降低BA/NAA比值，最适培养基为MS+BA 2.0 mg·L^-1+NAA 0.2 mg·L^-1。 

所述的小鳞茎膨大培养基为MS+蔗糖60 g·L-1。 

所述的小鳞茎生根培养基为MS+IBA/NAA0.5-1.0 mg·L^-1。 

本发明的积极效果：1. 以鳞片为外植体，且采用tTCL的切割培养方式，不仅节省试验材料，降低成本，而且取材不受季节限制，尤其适合兰州百合等野生百合种质资源保存及利用；2. 小鳞茎均经外植体直接再生，鳞片在接种近一周时，由白色逐渐变为嫩绿色，10 天左右时切面出现黄白色芽点，接种三周时，芽点逐渐膨大分化为小鳞茎；顶芽在接种一周后，首先呈横向生长，继而在节点和节间处均诱导产生小鳞茎；无需经过诱导愈伤组织或者不定芽环节，诱导途径单一，保证出苗整齐一致，便于工厂化生产；3. 相比传统块状接种方式，本发明在诱导时间上可缩短4-5天，且诱导系数提高近14-17倍，可作为种球快繁高效稳定的再生体系；另外，外植体对常用抗生素敏感性强，适合作为兰州百合遗传转化的良好受体系统。 

附图说明

图1是鳞片薄层接种情况。 

图2是鳞片薄层诱导形成的小鳞茎。 

图3是顶芽薄层诱导形成的小鳞茎1。 

图4是顶芽薄层诱导形成的小鳞茎2。 

图5是小鳞茎扩繁。 

图6是生根小鳞茎。 

具体实施方式

为了更详细叙述本发明的工艺步骤和技术特征，下面结合图1-6举实例说明。 

[实例一、兰州百合tTCL离体再生技术 

兰州百合（Lilium davidii var unicolor）由中国甘肃省兰州市七里河区原品百合种植加工基地提供。

1. 灭菌消毒：取生长健壮、无病虫害，周径12-14 cm的兰州百合鳞茎，由外向内剥取鳞片、顶芽，洗衣粉水浸泡半小时，清水洗去表面泥沙，在自来水下流水冲洗12小时后备用； 

在超净工作台上，先用浓度75%酒精灭菌60秒，再用浓度1.5%的次氯酸钠溶液浸泡15 分钟，期间不断进行摇动，最后用无菌水冲洗6次，每次不少于3 分钟；

2. 薄层培养切割：将步骤1所得的无菌外植体置于无菌滤纸上滤干水分，沿鳞片周围切去1 mm，随后横切为厚1-2 mm弯月形切片，顶芽横切成3-4 mm圆形切片；且鳞片和顶芽薄层均含有完整的外表皮细胞；

3. 接种：将步骤2所得的鳞片和顶芽薄层平铺于含诱导培养基MS+BA(0.5-1.5 mg·L^-1)+NAA(0.1-0.5 mg·L^-1)的培养皿中，培养皿直径为9 cm，含培养基体积为20 mL。外植体分别接种于12种含有不同浓度BA和NAA的培养基中（表1-1），其中蔗糖含量为30 g·L^-1，琼脂（条）含量7 g·L^-1。每处理接种外植体数不少于30个，并用无菌镊子按压外植体，使一半厚度的外植体插入培养基中；插入过深或过浅易引起外植体褐化、干枯，诱导效果差。

上述的基本培养基为MS固体培养基（Murashige and Skoog，1962），且含有蔗糖30 g·L^-1，琼脂（条）7 g·L^-1 ，pH 5.8。 

4. 小鳞茎诱导：培养室温度为25±1℃，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36 μmol·m^-2·s^-1。 

鳞片在接种近一周时，由白色逐渐变为嫩绿色，10 天左右时切面出现黄白色芽点，接种三周时，芽点逐渐膨大分化为小鳞茎；顶芽在接种一周后，首先呈横向生长，继而在节点和节间处均诱导产生小鳞茎；所有小鳞茎均由鳞片和顶芽薄层直接诱导所得，而未经愈伤组织阶段。其中诱导培养基含有较高浓度BA和较低浓度NAA，BA浓度为0.5-1.5 mg·L^-1， NAA浓度为0.1-0.5 mg·L^-1，即BA/NAA比值较大时，最适合小鳞茎诱导； 

接种45天后调查统计小鳞茎诱导率、诱导系数及直径。

由表1-1看出，不同浓度BA、NAA对兰州百合鳞片及顶芽小鳞茎诱导的影响存在明显差异。当BA达2.0 mg·L^-1，浓度相对过高时，小鳞茎诱导率及诱导系数较低，直径也显著低于1.5 mg·L^-1。而NAA浓度一定时，BA在0.5和1.0 mg·L^-1水平下，小鳞茎诱导效果较好。其中7号培养基中，当BA浓度适宜，NAA浓度较低，即BA/NAA较大时，小鳞茎诱导系数极显著高于其他处理，且小鳞茎诱导率仅次于2号培养基。由此得出，MS+BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1为兰州百合小鳞茎直接诱导的最适培养基，诱导率为87.18%，诱导系数高达6.94。 

5. 小鳞茎扩繁 

诱导培养4周后，需提高培养基中BA和NAA的浓度，且降低BA/NAA比值，以利于小鳞茎扩繁。需注意的是，诱导形成的小鳞茎需按单个切下，且底部带有2 mm长接种的原鳞片薄层。

将初代诱导的小鳞茎接于含BA、NAA的培养基中进行继代培养，按单鳞茎切下，分别接种。每处理不少于40个外植体。其中蔗糖含量为30 g·L^-1，琼脂（条）含量7 g·L^-1。45天后调查统计小鳞茎诱导率及增殖系数。 

不同浓度BA、NAA对小鳞茎扩繁的影响效果如表1-2所示，兰州百合小鳞茎诱导率及诱导系数不仅与BA、NAA浓度有关，而且与二者比值紧密相关。小鳞茎诱导率随BA/NAA比值的增大而增大，当BA/NAA最低为2时（2号培养基），小鳞茎诱导率显著低于BA/NAA最高为10时（3号培养基），BA/NAA为中间比值4或5（即1号、4号培养基）时，小鳞茎诱导率也居中且差异不显著。就小鳞茎扩繁系数而言，同等BA浓度下，NAA较低为0.2 mg·L^-1（1号、3号培养基）时，有利于不定芽扩繁，而当BA、NAA浓度均较大时（4号培养基），扩繁系数最低。综合数据得出，3号培养基MS+BA 2.0 mg·L^-1+NAA 0.2 mg·L^-1，即BA/NAA最大为10时，最适宜兰州百合小鳞茎扩繁，诱导率及扩繁系数分别为80%、3.25。 

6 .小鳞茎膨大及生根 

扩繁培养2代后，培养基中停止添加BA和NAA，且加倍蔗糖含量，以利于小鳞茎膨大。随后将小鳞茎转入生根培养基中诱导生根。

试验结果如表1-3所示，蔗糖含量90 g·L^-1时最利于小鳞茎膨大，但与60 g·L^-1时相比差异不显著，因此为节约成本将小鳞茎膨大的蔗糖浓度定为60 g·L^-1。 

将前期试验获得的直径大于1 cm的小鳞茎接种于生根培养基中进行生根培养。生根培养以1/2MS为基本培养基，添加IBA和NAA为生根激素（表1-4）。试验结果如表1-4所示，同等浓度水平下，NAA处理下生根系数高于IBA，其中当NAA浓度为1.0 mg·L^-1时，极显著高于其他处理。因此，4号培养基1/2MS+NAA 1.0 mg·L^-1为兰州百合小鳞茎生根的最适培养基。 

7. 抗生素敏感性筛选                                                                    

以鳞片为外植体，在小鳞茎诱导最适培养基中添加不同浓度Kan、Hyg抗生素进行敏感浓度筛选。45天后调查鳞片褐化情况如表1-5和1-6所示。

试验数据表明（表1-5），添加25 mg·L^-1 Kan后，鳞片不定芽的分化率就由对照中不加Kan的93.94%降到60%，说明外植体对Kan较敏感。筛选卡那霉素的亚致死浓度为75 mg·L^-1。 

在添加30 mg·L^-1 Hyg的4号培养基中，接种鳞片基本全部褐化死亡，不定芽分化率仅为6.45%（表1-6）。超过此浓度，接种鳞片均全部死亡。因此，确定潮霉素抗性质量浓度定为30 mg·L^-1。 

  实例二、验证tTCL培养的高效性 

对照培养基为：经步骤1消毒后，鳞片切为约1-1.5 cm²，凹面向上接于之前筛选出的小鳞茎直接诱导最适培养基MS+BA 1.5 mg·L^-1+NAA 0.1 mg·L^-1中，顶芽切为长1-1.5 cm小段，平放接种于相同培养基中。比较相同培养条件下，鳞片和顶芽薄层与传统块状接种方式对诱导效率的影响。

试验结果表明，兰州百合鳞片、顶芽经tTCL方式诱导形成小鳞茎大约需要25天，相比传统块状接种方式，可缩短4-5天。相对诱导系数而言，传统块状接种方式下，每1-1.5 cm²鳞片约诱导形成小鳞茎个数为3.96，而采用tTCL方式，同等大小鳞片可切割为8-10块薄层外植体，每个鳞片薄层小鳞茎诱导系数约6.94。由此，采用tTCL培养方式，小鳞茎诱导系数提高近14-17倍。