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法律状态信息
法律状态
2020-07-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N22/00 授权公告日:20160622 终止日期:20190725 申请日:20130725
专利权的终止
2016-06-22
授权
授权
2014-01-22
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N22/00 申请日:20130725
实质审查的生效
2013-11-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及胃癌细胞鉴别方法,尤其是涉及一种利用介电频谱特性鉴别胃癌腺上皮细胞的方法。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居各种恶性肿瘤之首。中国胃癌死亡率属世界高死亡率水平,男性为欧美发达国家的4.2~7.9倍,女性为3.8~8.0倍。因此,胃癌是恶性肿瘤防治的重点,积极开展胃癌的基础理论和临床应用研究,揭示其发病机制,寻找有效的诊治方法,具有重要的现实意义。目前可用于辅助胃癌诊断方法:内窥镜(胃镜)镜及病理评价,脱落细胞学检查,X线钡餐造影,B超检查,CT扫描,磁共振成像MRI检查,血清胃蛋白酶原(PGI,PGII)检测等。其中,胃镜检查是临床最常用的胃癌诊断方法,它主要依靠视觉观察胃粘膜形态变化,对高怀疑区域,通过胃镜对可疑组织活检取样,再进行病理学诊断,目前病理学诊断仍为金标准,但存在以下缺点:1)依靠形态病理学变化作为诊断标准,肿瘤已发展到中晚期;2)组织活检具有损伤性。
因此,国内外学者都在探索各种方法和手段,寻找胃癌早期诊断方法和非损伤性诊断技术。其中,依据胃癌组织细胞电特性改变,对肿瘤细胞的早期辅助诊断就是一种选择,其主要原因在于组织细胞电学特性变化早于其形态学改变。因此,探索胃癌腺上皮细胞电学特征参数改变,通过这些改变的特征参数,实现对胃癌早期辅助诊断与防治指标的监控,已成为生物电工学和生物医学工程学关注的热点和难点问题。目前,国内外还没有公开任何关于利用介电频谱特性鉴别胃癌腺上皮细胞的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种无损伤性,准确性高的利用介电频谱特性鉴别胃癌腺上皮细胞的方法,为进一步开发早期胃癌筛查诊断仪器提供了基础。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种利用介电频谱特性鉴别胃癌腺上皮细胞的方法,包括以下步骤:
(1)样本采集
将正常人胃腺上皮细胞样品与胃癌腺上皮细胞样品分别进行体外细胞培养后,经过胰蛋白酶消化、吹打,配制成相应的正常胃腺上皮细胞悬浮液和胃癌腺上皮细胞悬浮液,待阻抗测量;
(2)介电谱测量
将正常胃腺上皮细胞悬浮液和胃癌腺上皮细胞悬浮液分别注入测量池中,将测量池连接到阻抗分析仪上,在0.01~100MHz频率范围取80个频率点,设定每个频率点自动循环扫描测量3次,恒压为200mV,测量每个频率点的细胞样本的电容C和电导G,将各个频率下的电容C和电导G转换成相应频率下的介电常数ε和电导率κ;
(3)建立鉴别依据
通过对正常人胃腺上皮细胞样品与胃癌腺上皮细胞样品的介电常数频谱、电导率频谱、复数平面图、介电损耗因子频谱、电导率虚部频谱和介电损耗角正切频谱的分析,获得正常人胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞具有介电行为特征的介电谱特征参数,将正常人胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞的介电谱特征参数通过统计学的差异显著性检验分析,获得正常人胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞之间具有显著性差异的介电谱特征参数,即得到鉴别用介电谱特征参数,并通过介电常数频谱、电导率频谱、复数平面图、介电损耗因子频谱、电导率虚部频谱和介电损耗角正切频谱,获得正常人胃腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围和胃癌腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围;
(4)胃癌细胞鉴别
取待测胃细胞进行体外细胞培养后,经过胰蛋白酶消化、吹打,配制成待测胃细胞悬浮液,测量待测胃细胞悬浮液的鉴别用介电谱特征参数值,若其中任一个鉴别用介电谱特征参数值落在相应的胃癌腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围内且在正常人胃腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围外,即可鉴别该胃细胞为胃癌腺上皮细胞。
步骤(1)中所述的体外细胞培养过程为:将细胞样品置于含10%灭活胎牛血清,100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的1640培养基中,在37℃,含5%的CO2的培养箱中生长。
步骤(2)中所述的介电谱测量的具体条件为:阻抗分析仪开机预热30min后,使用0.1mol/L KCL标准溶液将其进行校正,然后接上细胞测量的夹具,在0.01~100MHz频率范围内取80个频率点,设定交流激励信号源电压200mV,测量每个细胞样本的电容C和电导G,每个频率点自动循环扫描进行3次测量取其均值;测量池主要由透明的有机玻璃管和铂Pt电极构成,在测量电极上方有一微型进样孔,电极规格为:直径7.25mm,间距8.5mm,容积约0.4ml;使用0.1mol/LKCL标准溶液对测量电极进行校正,在25±1℃通过测量获得实测数据电容C和电导G以及测量池常数Co=0.016737pF,浮游电容C1=1.81pF,然后对实测数据进行了校正:
校正后电容:> (公式1)
校正后电导:> (公式2)
其中电极电感系数L=1.26nH,角频率ω=2πf,f为电场频率,介电常数ε=CS/Co和电导率κ=(εv/Co)*Gs,真空介电常数εv=8.854pF/m。
步骤(3)中所述的介电谱特征参数包括高频极限介电常数、低频极限介电常数、最大介电常数增量、电导率低频极限量、电导率高频极限量、最大电导率增量、第一特征频率、第二特征频率、第三特征频率、介电损耗因子峰、f2电导率虚部峰、f3电导率虚部峰和介电损耗角正切。
步骤(3)中所述的鉴别用介电谱特征参数包括电导率低频极限量、电导率高频极限量、最大电导率增量、第一特征频率、第二特征频率、第三特征频率、介电损耗因子峰和f2电导率虚部峰。
步骤(3)中所述的正常人胃腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围和所述的胃癌腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围如下表1所示:
表1
**表示胃癌组与正常对照组比较P<0.05,***表示胃癌组与正常对照组比较P<0.001,n为样本量。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明一种利用介电频谱特性鉴别胃癌腺上皮细胞的方法,由于人胃腺上皮细胞株和人胃癌腺上皮细胞株细胞内部结构不同,其介电常数和电导率也各自不相同,当外加电场作用于细胞时,不同结构的界面限制电荷的转移导致电荷积累,在电性不相同的两种介质间发生了极化现象,极化现象普遍存在于生物细胞,利用介电谱方法可以了解细胞介电行为特征,鉴别胃癌腺上皮细胞,该方法无损伤性,准确性高,为更好地实现胃癌的早期检测,掌握胃癌腺上皮细胞电特性的病变机制,并为进一步实现体内实验及开发具有独立知识产权的筛查诊断仪器奠定实验基础。
附图说明
图1为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的介电常数频谱;
图2为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的电导率频谱;
图3为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的介电常数复数平面图;
图4为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的电导率复数平面图;
图5为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的介电损耗因子频谱;
图6为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的电导率虚部频谱;
图7为正常人胃腺上皮细胞和人胃癌腺上皮细胞的介电损耗角正切频谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
一、实验材料
正常人胃腺上皮细胞株GES-1,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库,样本量为11个;
人胃癌腺上皮细胞株MGC-803,购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库,样本量为8个;
0.9%NaCl生理盐水(西安双鹤药业有限公司)、胎牛血清(hyclone)、双抗(hyclone)、1640培养基(hyclone)、75%酒精(宁波市镇海甬锋化工厂)
二、实验方法
正常人胃腺上皮细胞株GES-1和人胃癌腺上皮细胞株MGC-803具有细胞外液、细胞膜、细胞质、细胞核膜、细胞核质和细胞核仁等结构。由于细胞内部结构不同,其介电常数和电导率也各自不相同。当外加电场作用于细胞时,不同结构的界面限制电荷的转移导致电荷积累,在电性不相同的两种介质间发生了极化现象,极化现象普遍存在于生物细胞。利用介电谱方法可以了解细胞介电行为特征。本实验的主要内容就是通过对MGC-803和GES-01的介电谱检测,进而分析两者的差别,从而更好地实现胃癌的早期检测。
1正常人胃腺上皮细胞系GES-1实验
1.1GES-1细胞培养
将正常人胃腺上皮细胞GES-1置于含10%灭活胎牛血清,100IU/mL青霉素,100IU/mL链霉素的1640培养基中培养,细胞保持在37℃,含有5%CO2的培养箱中生长,经过胰酶消化、吹打、制备成悬浮细胞液,并配制成不同比容的细胞悬浮液。
1.2GES-1介电谱的测量
取GES-1细胞悬浮液0.4ml,使用移液管将细胞悬浮液注入测量池中,将测量池连接到阻抗分析仪上,设置测量条件为0.01~100MHz频率内测量80个频率点,给定恒压为200mV,测量每个频率点的细胞样本的电容C和电导G,记录实验数据。
1.3GES-1比容测量
阻抗测量后从测量池取出GES-1细胞样本,取微量注入细胞比容管,使用离心机,以10000rpm,离心5min,并记入细胞比容。
2胃癌腺上皮细胞株MGC-803实验
2.1MGC-803细胞培养
胃癌腺上皮细胞株MGC-803置于含10%灭活胎牛血清,100IU/mL青霉素,100IU/mL链霉素的1640培养基中培养。细胞保持在37℃,5%CO2培养箱中生长,经过胰酶消化、吹打、制备成悬浮细胞液,并配制成不同比容的细胞悬浮液。
2.2MGC-803介电谱的测量
取MGC-803细胞悬浮液0.4ml,使用移液管将细胞悬浮液注入测量池中,将测量池连接到阻抗分析仪上。设置测量条件为0.01~100MHz频率内测量80个频率点,给定电压为200mV。测量每个频率点的细胞样本的电容C和电导G,记录实验数据。
2.3MGC-803比容测量
阻抗测量后从测量池取出MGC-803细胞样本,取微量注入细胞比容管,使用离心机,以12 000rpm,离心5min,并记入细胞比容。
2.4测量条件设定
在温度为(25±1)℃下,4294A型阻抗分析仪开机预热30min后,将其进行校正,然后接上细胞测量的夹具,使用0.1mol/L KCL标准溶液校正。在0.01~100MHz频率范围内取80个频率点,设定交流激励信号源电压200mV,测量每个细胞样本的电容C和电导G,每个频率点自动循环扫描进行3次测量取其均值;测量池主要由透明的有机玻璃管和Pt电极构成,在测量池上方有一微型进样孔。电极规格为:直径7.25mm,间距8.5mm,容积约0.4ml;使用0.1mol/LKCL标准溶液对测量电极进行校正,在25±1℃通过测量获得实测数据以及测量池常数Co=0.016737pF,浮游电容C1=1.81pF,然后对实测数据进行了校正:
校正后电容:> (公式1)
校正后电导:> (公式2)
其中电极电感系数L=1.26nH,角频率ω=2πf,f为电场频率,根据ε=CS/Co和κ=(εv/Co)Gs转换成不同频率的介电常数ε和电导率κ,真空介电常数εv=8.854pF/m。
三、实验结果
通过对正常人胃腺上皮细胞GES-1与胃癌腺上皮细胞MGC-803的介电常数频谱,电导率频谱、复数平面图、介电损耗因子频谱、电导率虚部频谱和介电损耗角正切频谱的综合分析,确定正常胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞具有介电行为特征的介电谱特征参数,具体见图1-图7分析(下述分析数据结果为样本均值):
如图1所示,MGC-803与GES-01相比,在0.01-100MHz范围内,胃癌腺上皮细胞(MGC-803)的极限介电常数εL下降2.85%,低频极限介电常数εh下降3.07%,但ε谱线间没有存在显著性差异。其中介电常数频谱,即复数介电常数(ε*)随电场频率f变化的函数关ε*=ε-jκ/(2πfεv)=ε'-ε",介电常数实部ε’=ε,介电常数虚部ε"=κ/ωεv,角频率ω=2πf。
如图2所示,MGC-803比GES-01相比,胃癌腺上皮细胞(MGC-803)的电导率κ曲线全面上移,反映MGC-803细胞导电性能增大,其中电导率低频极限量κL增加13.19%(P<0.001)和电导率高频极限量κh增加10.32%(P<0.001)。其中电导率频谱,即复数电导率(κ*)是频率f的函数:κ*=κ+jωεεv=κ'+κ",电导率实部κ’=κ,电导率虚部κ”=εωεv。
如图3所示,MGC-803与GES-1比较,胃癌腺上皮细胞(MGC-803)的复数平面图主要表现为曲线圆弧向左缩小,表现为介电常数增量Δε减小2.85%从而导致面积减小,第一特征频率f1增加28%(P<0.001)。其中介电常数复数平面图,即横坐标是介电常数实部ε’=ε,纵坐标是介电常数虚部增量Δε”=(κ-κL)/(2πfεv)
如图4所示,MGC-803与GES-1比较,胃癌腺上皮细胞(MGC-803)的复数平面图整体向右平移,主要表现为电导率低频极限量κL增大13.19%(P<0.001)以及电导率高频极限量κh增大10.32%(P<0.001)使得MGC-803的整体导电性能增强。在特征频率方面,f2增大41.38%(P<0.001)以及f3减小11.04%(P<0.001),特征频率也发生了变化。其中电导率复数平面图,即横坐标是电导率实部κ’=κ,纵坐标是电导率虚部增量Δκ”=(ε-εL)×(2πfεv)。
如图5所示,介电损耗因子Δε”频谱中,MGC-803与GES-1比较,MGC-803的Δε”频谱被压低,表现为峰值Δε"p降低14.89%(P<0.001),峰的幅度变得圆滑,说明MGC-803比正常细胞介电损耗降低。其中介电损耗因子频率谱,即介电损耗因子(Δε”=(κ-κL)/(2πfεv))随电场频率变化的函数。
如图6所示,电导率虚部Δκ”频谱中,MGC-803与GES-01比较,MGC-803的电导率虚部曲线左侧峰值区域抬高明显,其峰值(P2=Δκ”p(f2))增加16.67%(P<0.001),第二特征频率f2增加41.38%(P<0.001),右侧主峰(P3=Δκ”p(f3))增加2.67%,对应的频率点为第3特性频率f3减小11.04(P<0.001)。其中电导率虚部频谱,即电导率虚部增量(Δκ”=(ε-εL)×(2πfεv))随电场频率变化的函数。
如图7所示,介电损耗角正切Δtgδ频谱中,MGC-803与GES-01比较,MGC-803的介电损耗角正切最大值Δtgδp与GES-1比较无显著性差异。其中介电损耗角正切频谱,即介电损耗角正切(Δtgδ=Δε"/ε')随电场频率变化的函数。
通过对正常胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞的介电谱特征参数进行统计学的显著性检验分析,确定正常胃腺上皮细胞与胃癌腺上皮细胞之间具有显著性差异的介电谱特征参数及相应的介电谱特征参数的数值范围,具体见表1,
表1GES-1和MGC-803电生理特性参数
注:**表示胃癌组与正常对照组比较P<0.05,***表示胃癌组与正常对照组比较P<0.001,n为样本量。
由上表可知,电导率低频极限量、电导率高频极限量、最大电导率增量、第一特征频率、第二特征频率、第三特征频率、介电损耗因子峰和f2电导率虚部峰可作为鉴别胃癌腺上皮细胞的介电谱特征参数。
将待测胃细胞进行体外细胞培养后,经过胰蛋白酶消化、吹打,配制成待测胃细胞悬浮液,测量待测胃细胞悬浮液的电导率低频极限量、电导率高频极限量、最大电导率增量、第一特征频率、第二特征频率、第三特征频率、介电损耗因子峰和f2电导率虚部峰的大小,若其中任一个鉴别用介电谱特征参数值落在上述表1中相应的胃癌腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围内且在正常人胃腺上皮细胞鉴别用介电谱特征参数的数值范围外,即可鉴别该胃细胞为胃癌腺上皮细胞。人胃癌腺上皮细胞介电谱特征参数及其数值范围大小的建立,为胃癌相关性疾病的电学特性研究,提供了新的研究手段和评价指标,具有潜在的临床应用前景。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。
机译: 利用介电泳的细胞鉴别方法和装置,以及细胞评价方法和装置
机译: 一种在利用散射的光学检查中鉴别伪影影响的方法和实施该方法的设备
机译: 利用长余辉发射鉴别安全标记的方法以及包含一种或多种余辉化合物的安全标记