高效利用碳源生产生物塑料PHBV的极端嗜盐古菌工程菌

技术领域

本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯PHBV的极端嗜盐古菌工程菌。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯是一类由微生物在营养不均衡时在细胞体内积累的高分子聚酯， 作为碳源和能源的储备物广泛存在于自然界。由于其具有热塑性、生物可降解性和生 物兼容性，PHA被普遍认为是引起白色污染的石化衍生塑料的潜在替代物，可以应用 于包括日常用品（比如塑料袋，容器）和生物医学材料（比如人造血管，药物释放载 体）在内的多个领域，且越来越受到科学界和商业界的关注。

目前，细菌中实现PHA产业化生产的主要是PHB、PHBV和P3HB4HB。PHB在某些 性能上与热塑性塑料相类似，力学性质与聚丙烯（PP）相类似。经基因工程改造的大 肠杆菌菌株VG1（pTU14）利用廉价的淀粉水解糖做碳源，分批流加培养60小时，菌 浓度可达216克/升，PHB在菌体内的积累量达细胞干重的90%。此外，血红蛋白的过 表达，提高了菌体的摄氧和耐低溶氧的能力；利用裂解基因可控诱导细胞裂解，释放 出细胞内的PHB。然而，PHB易折裂的缺点却限制了其应用范围。在PHB中掺入其他单 体（如羟基戊酸）可以降低其强度和硬度，材料学性能有了很大改进；但是，生产PHBV 过程中丙酸等前体的添加极大的提高了生产成本。

PHBV是羟基丁酸和羟基戊酸的共聚物，虽然基因工程改造的大肠杆菌也可以通过 非相关碳源合成PHBV，但随着羟基戊酸组分的增加PHBV的含量也逐渐降低；羟基戊 酸组分的摩尔百分含量可达17.5%，但其PHBV含量只占细胞干重的12%左右。P3HB4HB 作为一种新的PHA材料已经受到很大关注并正在进行工业化生产。在发酵过程中添加 1,4丁二醇或gama-丁酸内酯，细胞体内就会积累P3HB4HB，其中4HB所占的摩尔百分 比可控制在0-40%。

极端嗜盐古菌是一类依赖高渗透压环境生长的极端微生物，其作为PHA的生产菌 株具有独特的优点：高渗的生长环境可以简化灭菌过程甚至不用灭菌；对高渗环境的 依赖使菌体在清水中非常容易裂解，从而使PHA的提取安全、简便。而地中海富盐菌 由于其生长速率较其他极端嗜盐古菌快，可以利用淀粉、乳清等多种碳源，能够通过 非相关碳源合成PHBV等优点成为极端嗜盐古菌中最合适的PHA生产菌种。1986年， 地中海富盐菌被报道可以积累PHA；1990年，Lillo对培养基的组分及培养条件进行 了优化。随着其积累的PHA被确定为PHBV(羟基戊酸组分的摩尔百分比最低为10.7%)， 地中海富盐菌又逐渐受到人们的关注。以处理后的淀粉和米糠（1:8g/g）为碳源，优 化发酵工艺，培养大约120个小时，PHBV浓度达到77.8克/升。虽然在一定程度上节 约了碳源的成本，但由于以酵母提取物为氮源，同时通入了纯氧，反而增加了生产的 总成本。我们实验室正在尝试分别使用廉价的淀粉和氯化铵做碳源和氮源，同时在只 通入空气的情况下对PHBV的生产进行优化。

地中海富盐菌在PHBV发酵生产过程中会产生多种副产品，如胞外多糖。胞外多糖 的合成和积累不仅造成了不必要的碳源浪费，而且会对生产产生一些副作用，包括提 高了培养液的黏度、增加了起泡量、降低了溶氧。对于地中海富盐菌胞外多糖的研究 目前仅限于其生产优化、理化性质、生理功能和组成结构，而在遗传水平却没有报道。 考虑到胞外多糖的合成与PHBV的生产条件比较相似，故在遗传水平对菌株进行改造是 必需的。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效利用碳源生产聚羟基脂肪酸酯PHBV的胞外多糖合 成功能缺失的重组极端嗜盐古菌，及一种极端嗜盐古菌胞外多糖合成相关的基因簇。

本发明提供的极端嗜盐古菌胞外多糖合成相关的基因簇，名称为eps，来源于地 中海富盐菌Haloferax mediterranei，其保藏编号为CGMCC 1.2087，其编码的蛋白质 为如下1）-4）所述的蛋白：

1）由序列表中序列2所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中序列2 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有与序 列2所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，2）由序列表中序列3所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中 序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与序列3所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，3）由序列表中序列4所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中 序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与序列4所示的蛋白相同活性的蛋白质；

和，4）由序列表中序列5所示的氨基酸残基序列组成的蛋白质，或者将序列表中 序列5的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 与序列5所示的蛋白相同活性的蛋白质。

所述基因簇的序列为下述脱氧核苷酸之一：

1）序列表中序列1所示的自5′末端第547-5762位核苷酸序列；

2）序列表中序列1所示的DNA序列；

3）在严格条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

4）与1）、2）或3）限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA序列。

该极端嗜盐古菌胞外多糖合成的关键基因簇包括一个启动子和一个编码区。序列 1中第547-857位核苷酸为启动子区域，第858-5762位核苷酸为编码区。

所述编码区在翻译水平可以表达出四种蛋白质，在基因组中的编号依次为 HFX2145-2148。序列1中第858-2228位核苷酸为HFX2145的编码区，其氨基酸序列 如序列2所示；序列1中第2228-3286位核苷酸为HFX2146的编码区，其氨基酸序列 如序列3所示；序列1中第3283-4308位核苷酸为HFX2147的编码区，其氨基酸序列 如序列4所示；序列1中第4305-5762位核苷酸为HFX2148的编码区，其氨基酸序列 如序列5所示。预测四种蛋白质的功能依次是：UDP-N-乙酰葡萄糖胺-6-脱氢酶，长醇 磷酸-甘露糖基转移酶，含有糖基转移酶4-相似结构域蛋白，和多糖合成转运蛋白。

扩增上述基因簇的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一类高效利用碳源生产聚羟基脂肪酸酯的重组极端 嗜盐古菌工程菌。

本发明所提供的重组极端嗜盐古菌，是将出发极端嗜盐古菌的基因组中的上述的 基因簇表达的至少一种蛋白功能缺失，获得的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。

将上述基因簇表达的至少一种蛋白功能缺失即可以使该极端嗜盐古菌胞外多糖 合成的关键基因簇的功能缺失，从而会导致胞外多糖合成缺陷。

所述将出发极端嗜盐古菌的基因组中的上述胞外多糖合成功能的基因簇的表达 的至少一种蛋白功能缺失的方法是将所述基因簇中编码所述功能缺失蛋白的基因突 变、或/和基因敲除、和/或基因沉默；优选将胞外多糖合成功能的基因簇突变、或/和 基因敲除、和/或基因沉默、和/或RNA干扰编码所述功能缺失蛋白的基因的表达。

该极端嗜盐古菌胞外多糖合成的关键基因簇通过质粒或非原位同源重组等方法 可以恢复上述胞外多糖合成缺陷菌株的胞外多糖合成能力。

所述出发极端嗜盐古菌为地中海富盐菌Haloferax mediterranei；优选为地中海 富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087。

所述基因敲除是通过同源重组实现的；所述同源重组所用的上游交换臂的序列为 自序列表中序列1的5′端第1-865位核苷酸序列；所述同源重组所用的下游交换臂 的序列为自序列表中序列1的5′端第5763-6282位核苷酸序列。

和/或，所述出发极端嗜盐古菌在基因敲除所述基因簇前，先敲除其基因组中序列 如序列表中序列6的5′端第810-1607位核苷酸序列片段（pyrF基因）获得尿嘧啶合成 缺陷型菌株，再以所述尿嘧啶缺陷型菌株作为出发菌株进行所述基因簇的敲除，获得 尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成缺陷型菌株，最后，将序列表中序列6的第810-1607 位核苷酸序列片段原位敲回，获得尿嘧啶合成功能与所述出发极端嗜盐古菌相同的胞 外多糖合成功能缺失的工程菌。

pyrF敲除株为尿嘧啶合成缺陷株，利用该菌株可以更快速、有效地做基因敲除实 验，故而以尿嘧啶合成缺陷株出发；而由于是尿嘧啶合成缺陷株，作为PHA生产菌株 在生产上需要加入外源尿嘧啶，故而需要将pyrF基因原位回补，事实上，回补后的 pyrF位点与野生型相同；因此，该方法获得的工程菌株与用野生型极端嗜盐古菌直接 敲除上述基因簇表达的蛋白编码基因或者直接敲除所述基因簇获得的工程菌株的效果 一致。

上述重组极端嗜盐古菌可用于生产聚羟基脂肪酸酯（PHBV）。该类胞外多糖合成 缺陷株的上述重组极端嗜盐古菌生产的产物聚羟基脂肪酸酯（PHBV）仍是通过非相关 碳源就可以合成的3-羟基丁酸（3HB）和3-羟基戊酸（3HV）共聚物（PHBV）。

所述在生产聚羟基脂肪酸酯的方法，是发酵所述的重组极端嗜盐古菌，得到含有 聚羟基脂肪酸酯的菌体细胞；所述发酵在发酵罐中进行，温度32-45℃，通气量1∶1-2:1 vvm，搅拌随溶氧的变化手动调节，pH维持在6.5-7.5，罐体内压为1个大气压。所述 发酵温度为优选为37℃。

所述发酵用培养基的组分为氯化钠110-220克/升，氯化镁0-10克/升，硫酸镁 2-20克/升，氯化钾1-5克/升，氯化钙0-1克/升，碳酸氢钠0-0.3克/升，溴化钠0-0.5克 /升，酵母提取物0-10克/升，氯化铵1-5克/升，磷酸二氢钾0.02-4克/升，淀粉10-50 克/升，柠檬酸铁铵0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-2毫升/升；pH值为6.5-7.5； 所述发酵用培养基的组分优选为氯化钠110克/升，氯化镁9.6克/升，硫酸镁14.4克/ 升，氯化钾5克/升，氯化钙1克/升，碳酸氢钠0.2克/升，溴化钠0.375克/升，酵母提 取物3克/升，氯化铵2克/升，磷酸二氢钾0.0375克/升，淀粉20克/升，柠檬酸铁铵 0.008克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升；所述微量元素溶液SL-6的各种组分及其含 量为：七水合硫酸锌1克/升，四水合氯化锰0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化钴2克/ 升，二水合氯化铜0.1克/升，六水合氯化镍0.2克/升，一水合钼酸钠0.3克/升；所述微 量元素溶液的pH用盐酸溶液调节至3-4。

所述生产聚羟基脂肪酸酯的方法还包括在发酵前进行种子培养其中，所述种子培 养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素5-10克/升，酵母提取物5-10克/升，谷氨酸钠1-2克/升，柠檬酸三 钠3-6克/升，氯化钠110-220克/升，氯化镁0-9.6克/升，硫酸镁2-30克/升，氯化 钾1-5克/升，柠檬酸铁铵0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-1毫升/升。pH 调节到6.5-7.5。

所述种子培养分为两级种子培养；所述种子培养的方法是将所述重组极端嗜盐古 菌单克隆接种于一级种子培养基中，37℃培养3天获得一级种子培养液，然后将一级 种子培养液以体积百分含量为2%的接种量接入二级种子培养基中，37℃培养3天获 得二级种子培养液。

一级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸钠1克/升，柠檬酸三钠3克 /升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008 克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升。

所述一级种子培养基的pH是7.0-7.2。

二级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸钠2克/升，柠檬酸三钠6 克/升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008 克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升。所述二级种子培养基的pH是7.0-7.2。

所述发酵过程中，如有需要，可以补加补料培养基。

所述补料培养基的各个组分及其浓度为：

氯化钠110-220克/升，氯化镁0-10克/升，硫酸镁0-20克/升，氯化钾0-5克/升， 氯化钙0-1克/升，碳酸氢钠0-0.3克/升，溴化钠0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升， 氯化铵10-100克/升，磷酸二氢钾0-1克/升，淀粉200-500克/升，柠檬酸铁铵0-0.01 克/升，微量元素溶液SL-6 0-1毫升/升。

所述发酵时，将所述二级种子培养液接种于所述发酵培养基中，二级种子培养液 的接种量为体积百分比为10%的量接种于所述发酵培养基中。

本发明提供的这类高效利用碳源生产聚羟基脂肪酸酯的极端嗜盐古菌工程菌是 通过遗传工程改造对胞外多糖合成的关键基因簇实现了功能缺失的地中海富盐菌，是 胞外多糖合成缺陷株。

该类胞外多糖合成缺陷株由于胞外多糖合成的关键基因簇的功能缺失，不再具有 合成及分泌胞外多糖的能力，从而避免了碳源的浪费，同时解决了胞外多糖积累造成 的培养液变粘、大量起泡和溶氧下降等问题。

利用本发明提供的这类高效利用碳源生产聚羟基脂肪酸酯PHBV的极端嗜盐古菌 工程菌，在相同的生产条件下聚羟基脂肪酸酯PHBV的浓度比野生型菌株提高20%以 上；同时解决了胞外多糖积累造成的培养液变粘、大量起泡和溶氧下降等问题。利用 本发明提供的聚羟基脂肪酸生产方法，发酵72小时，聚羟基脂肪酸酯PHBV的浓度可 达21.28克/升。

附图说明

图1为胞外多糖合成关键基因簇及其上下游序列的结构图及其预测的功能注释; 图中，HFX2145预测功能为UDP-N-乙酰葡萄糖胺-6-脱氢酶；HFX2146预测功能为长 醇磷酸-甘露糖基转移酶；HFX2147的预测功能为含有糖基转移酶4-相似结构域蛋白； HFX2148的预测功能为多糖合成转运蛋白。

图2为pyrF基因及其上下游序列的结构图

图3为比较各个菌株的菌落形态（图3中A）、胞外多糖含量（图3中B）及胞 外多糖样品中甘露糖基组分（图3中C）,图中，（Ⅰ为Haloferax mediterranei ΔpyrF， Ⅱ为Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps，Ⅲ为Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps：： pWL502-eps，Ⅳ为Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps::pWL502，Ⅴ为Haloferax  mediterranei CGMCC 1.2087，Ⅵ为Haloferax mediterranei ES1）。

图4为比较胞外多糖合成关键基因簇敲除株与野生型菌株的真实细胞质量、PHBV 浓度及总糖浓度，图中WT为Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087，ES1为Haloferax mediterranei ES1。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

地中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087购自中国普通微生物菌种保 藏中心(CGMCC)。

基因敲除和敲入所使用的菌株地中海富盐菌Haloferax mediterranei ΔpyrF（将地 中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087中的pyrF基因（自序列6中的 5′端第810-1607位核苷酸序列）敲除后获得的尿嘧啶合成缺失菌株，以方便筛查提 高敲除效率）、敲除出发载体pHFX（含有pyrF基因）、筛选培养基及相关原理和方法 在文献（Liu,H.,J.Han,et al.(2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems  for genome-wide manipulation of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarcula  hispanica."Journal of Genetics and Genomics 38(6):261-269.）公开，公众可从中国科学 院微生物研究所获得。

基因回补所使用的质粒载体pWL502在文献(Cai,S.,L.Cai,et al.(2012). "Identification of the Haloarchaeal Phasin(PhaP)That Functions in Polyhydroxyalkanoate  Accumulation and Granule Formation in Haloferax mediterranei."Applied and  Environmental Microbiology 78(6):1946-1952.)中公开过，公众可从中国科学院微生物研 究所获得。

实施例1、胞外多糖合成关键基因簇的确定及其基因的获得

基于地中海富盐菌的全基因组序列和注释，总结了全部糖基转移酶。经过分析， 基因HFX2145-2148被认为是可能的胞外多糖合成的关键基因簇（eps）。这四个基因 可能共用一个启动子，其中，HFX2145涉及前体物质UDP-N-乙酰葡萄糖胺酸的生物 合成，HFX2146、HFX2147涉及糖基依次转移至质膜载体长醇磷酸，HFX2148涉及三 糖单体的跨膜转运。这四个编码基因的结构及上下游基因的排布关系如图1所示。

设计一对引物epsF1/epsR1用于对包括胞外多糖合成的关键基因簇（eps）在内的 核苷酸序列进行PCR扩增，引物序列如下：

epsF1：5’-GCTCTAGACATCGCTTTGGGTCG-3’（XbaⅠ）（与自序列1的5'端 第544-558匹配）

epsR1：5’-CATGCCATGGCGGTACAGACCCTTTCA-3’（NcoⅠ）（与自序列1的 5'端第5796-5812匹配）

以地中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因组为模板，用引物 对epsF1/epsR1进行扩增，得到5269bp长度的PCR产物。

PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、54℃30s、68℃330s进 行30个循环；68℃延伸7min。扩增体系为25μl。

将经限制性内切酶Xba Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切的PCR产物和载体质粒pWL502用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态， 在含有氨苄青霉素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序。将鉴定正确 的上述含有PCR产物的pWL502重组质粒命名为pWL502-eps。

测序结果表明在质粒pWL502中插入的核苷酸序列如序列1中第544-5812位核苷 酸所示，其中第547-5762位核苷酸为胞外多糖合成的关键基因簇eps，第547-857位 核苷酸为基因簇的启动子区域，第858-5762位核苷酸为基因簇的编码区；编码区包括 4个基因，在基因组中的编号依次为HFX2145-2148。自序列1中的5'第858-2228位 核苷酸为HFX2145的编码区，其编码的氨基酸序列如序列2所示；自序列1的5'第 2228-3286位核苷酸为HFX2146的编码区，其编码的氨基酸序列如序列3所示；自序 列1的5'第3283-4308位核苷酸为HFX2147的编码区，其编码的氨基酸序列如序列4 所示；自序列1的5'第4305-5762位核苷酸为HFX2148的编码区，其编码的氨基酸 序列如序列5所示。

实施例2、胞外多糖合成关键基因簇eps功能的鉴定

利用基因工程技术对eps进行敲除及回补，通过遗传学方法验证其是胞外多糖合 成所必需的。

1、尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成关键基因簇（eps）敲除株的构建

利用基于pyrF基因的遗传操作系统，pyrF基因及其上下游序列的结构图如图2 所示，以Haloferax mediterranei ΔpyrF（Haloferax mediterranei ΔpyrF为以地中海富盐 菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087为出发菌株，敲除pyrF基因获得的尿嘧啶合 成缺陷菌株，以方便基因敲除与回补的筛选，提高敲除的效率；Liu,H.,J.Han,et al. (2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems for genome-wide manipulation  of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarcula hispanica."Journal of Genetics and  Genomics 38(6):261-269.）为出发菌株，构建尿嘧啶合成缺陷的eps敲除株。先构建用 于敲除eps的整合质粒pHFX-Δeps，再依次经同源重组单交换和同源重组双交换，对 获得的菌株进行筛选及验证，即得到目的菌株，具体步骤如下：

1）敲除eps的整合质粒pHFX-Δeps的构建

根据序列1中eps编码区及其上下游核苷酸序列，分别设计了上、下游交换臂的 扩增引物epsF2/epsR2和epsF3/epsR3：

epsF2：5’-AACTGCAGGAGTGGGTGGTCCTGAAT-3’（PstⅠ）（与自序列1的5' 端第1-18匹配）

epsR2：5’-TAGTGACAGGTTCAACCACAGGCACGACA-3’（与epsF2有11bp长度的相同序列）（与自序列1的5'端第848-865匹配）

epsF3：5’-CCTGTGGTTGAACCTGTCACTAGTACAATA-3’（与epsR1有11bp长度的相同序列）（与自序列1的5'端第5763-5781匹配）

epsR3：5’-GGGGTACCTTCCATAAACAACCAC-3’（KpnⅠ）（与自序列1的5' 端第6267-6282匹配）

以地中海富盐菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因组为模板，用引物 对epsF2和epsR2扩增敲除eps的上游交换臂865bp（序列为自序列表中序列1的5′ 端第1-865位核苷酸序列）。PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、54℃ 30s、68℃60s进行30个循环；68℃延伸7min。扩增体系为25μl。

以Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因组为模板，用引物对epsF3和 epsR3扩增敲除eps的下游交换臂520bp（序列为自序列表中序列1的5′端第 5763-6282位核苷酸序列）。PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、54℃ 30s、68℃60s进行30个循环；68℃延伸7min。扩增体系为25μl。

以回收后的上、下游交换臂产物为模板，用引物对epsF2和epsR3为上、下游引 物进行衔接PCR，借助epsR2和epsF3交叠的部分序列将上、下游交换臂连接到一起 并实现扩增。此片段被命名为Δeps，长度为1385bp。PCR扩增程序为：94℃5min预 变性；94℃30s、54℃30s、68℃90s进行30个循环；68℃延伸7min。扩增 体系为25μl。

将经限制性内切酶Pst Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切的PCR产物Δeps和载体质粒pHFX（Liu, H.,J.Han,et al.(2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems for  genome-wide manipulation of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarcula  hispanica."Journal of Genetics and Genomics 38(6):261-269.）用T4DNA连接酶16℃连 接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉素 抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序。将经测序表明含有Δeps的整合 质粒命名为pHFX-Δeps。

2）单交换菌株的构建、筛选及验证

采用PEG介导的转化方法，将整合质粒pHFX-Δeps转化Haloferax mediterranei ΔpyrF，转化后涂布于筛选培养基AS-168SY（所述筛选培养基AS-168SY各种组分及 其含量为：酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸钠1.0g/L、柠檬酸钠3.0g/L、NaCl 200g/L、 MgSO₄·7H₂O 20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO₄·7H₂O 0.36g/L、MnCl₂·4H₂O 0.36mg/L；所 述筛选培养基AS-168SY的pH值为7.1）固体平板，37℃培养4天左右。能在该固体 培养基上正常生长的单克隆为单交换菌株。

单交换菌株的验证：

根据序列1中eps编码序列，设计一对位于eps内部的扩增引物epsF4和epsR4 （604bp），用于对单交换菌株进行PCR验证：

epsF4：5’-ATTATCCTACTTACACCCAAAC-3’（与自序列1的5'端3735-3756 匹配）

epsR4：5’-TTGAAGCTAAATCCGTGA-3’（与自序列1的5'端4321-4338匹配）

以待验证单交换菌株的基因组为模板，分别用引物对epsF2和epsR3和引物对 epsF4和epsR4进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、 54℃30s、72℃90s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。若两对 引物都能扩增出相应大小的片段（即epsF2和epsR3能扩增出1385bp长度的片段且 epsF4和epsR4能扩增出604bp长度的片段），则证明此菌株为单交换菌株。

3）双交换菌株的构建、筛选及验证

将步骤2）筛选到的单交换菌株在液体添加终浓度50微克/毫升的尿嘧啶的筛选 培养基AS-168SY中传代培养50代，将培养液稀释10⁷涂布于添加终浓度50微克/毫 升尿嘧啶和250微克/毫升5-FOA的筛选培养基AS-168SY固体平板，37℃培养4天左 右。挑取单克隆划线于添加终浓度50微克/毫升尿嘧啶和250微克/毫升5-FOA的筛选 培养基AS-168SY固体平板，在该固体平板上能正常生长的单克隆为双交换菌株。

双交换菌株验证：

以待验证双交换菌株的基因组为模板，分别用引物对epsF2/epsR3和epsF4/epsR4 进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、54℃30s、 72℃90s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。若epsF2和epsR3 能扩增出1385bp长度的片段，而epsF4和epsR4不能扩增出604bp长度的片段，则证 明此菌株为双交换菌株。

经验证的双交换菌株即为尿嘧啶合成缺陷的eps敲除株，被命名为Haloferax  mediterranei ΔpyrF Δeps。

2、胞外多糖合成的关键基因簇eps经由质粒回补

将eps经由pyrF作为筛选基因的具有自主复制能力的质粒pWL502回补，验证 eps的功能。先构建用于回补eps的整合质粒pWL502-eps，将其转化到尿嘧啶合成缺 陷的eps敲除株Haloferax mediterranei ΔpyrF Δeps中，经筛选及验证，即得到目的菌 株，具体步骤如下：

1）回补eps的整合质粒pWL502-eps的构建

将实施例1中经测序表明含有eps的整合质粒命名为pWL502-eps，此整合质粒即 可用于eps的回补。

2）回补菌株的构建及筛选

采用PEG介导的转化方法，将整合质粒pWL502-eps转化Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps，转化后涂布于筛选培养基AS-168SY固体平板，37℃培养4天左右。在 该固体培养基上能正常生长的单克隆为回补菌株。回补菌株命名为Haloferax  mediterranei ΔpyrFΔeps：：pWL502-eps。

作为回补实验的对照，空的质粒pWL502转化Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps， 转化后涂布于筛选培养基AS-168SY固体平板，37℃培养4天左右。在该固体培养基 上能正常生长的单克隆为回补对照菌株。回补对照菌株命名为Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps：：pWL502。

3、胞外多糖合成能力的检测

通过菌落形态的观察、胞外多糖浓度的测定和甘露糖组分的检测这三个层面确定 待检测菌株是否具有胞外多糖合成的能力。

1）菌落形态的观察

将待观察的菌株划线于筛选培养基AS-168SY固体平板上（Haloferax mediterranei ΔpyrF和Haloferax mediterranei ΔpyrF Δeps的生长区域在划线前涂布终浓度50微克/ 毫升的尿嘧啶），37℃培养4天，即可对菌落形态进行观察。

2）胞外多糖的生产与样品的回收

将待测菌株由单克隆接种到液态筛选培养基AS-168SY（培养Haloferax  mediterranei ΔpyrF和Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps的培养基添加终浓度50微克/ 毫升的尿嘧啶）中，37℃培养3天，此为种子液；分别将种子液以4%的接种量接种 到EPS高产培养基（培养Haloferax mediterranei ΔpyrF和Haloferax mediterranei ΔpyrF Δeps的培养基添加终浓度50微克/毫升的尿嘧啶）中，37℃培养60小时。培养液经 两次10000转/分离心15分钟，然后经0.22微米孔径的滤器过滤以完全除去菌体。所 得处理后的培养液上清即为胞外多糖样品。

所述EPS高产培养基的各种组分及其含量为：30%的人工盐水833毫升/升，葡 萄糖10克/升，氯化铵1克/升，磷酸二氢钾0.15克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升， 微量元素溶液SL-6 1毫升/升；所述EPS高产培养基的pH值为7.0-7.2，并另加15.1 克/升PIPES（哌嗪-N-N’-二（2-乙磺酸））缓冲EPS生产过程中pH的变化。

所述30%人工盐水的各种组分及其含量为：氯化钠240克/升，六水合氯化镁30 克/升，七水合硫酸镁35克/升，氯化钾7克/升，二水合氯化钙0.5克/升；所述30% 人工盐水用浓度为1摩尔/升，pH为7.5的Tris盐酸缓冲液调节pH至7.5。

所述微量元素溶液SL-6的各种组分及其含量为：七水合硫酸锌1克/升，四水合 氯化锰0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化钴2克/升，二水合氯化铜0.1克/升，六 水合氯化镍0.2克/升，一水合钼酸钠0.3克/升；所述微量元素溶液的pH用盐酸溶液 调节至3-4。

3）蒽酮比色法测定胞外多糖样品中总糖的含量

培养液上清经1×10⁵分子量的透析袋在蒸馏水中透析四次，每次6小时。透析后 的胞外多糖样品用蒽酮比色法测定总糖的含量。

所述蒽酮比色法测定总糖含量的具体步骤为：

取7支大试管，分别加入100微克/毫升的糖标准溶液0.2，0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2、1.4毫升，以蒸馏水补充体积到2毫升；另取1支大试管加入2毫升蒸馏水，作 为空白对照。加4毫升蒽酮试剂，摇匀，沸水浴加热15分钟，冰水冷却后在625纳米 波长处测出光密度值。以糖浓度为横坐标，OD625为纵坐标制作标准曲线。取稀释到 一定浓度的待测样品溶液2毫升，加4毫升蒽酮试剂，摇匀，沸水浴加热15分钟，冰 水冷却后在625纳米波长处测出光密度值。利用标准曲线计算样品中总糖含量。

所述糖标准溶液是精确称取10毫克无水葡萄糖（于80℃烤箱内干燥恒重），以蒸 馏水定容到100毫升。

所述蒽酮试剂是精确称取100毫克蒽酮，以硫酸定容到100毫升。

4）离子色谱法检测甘露糖基组分

取透析后的胞外多糖样品4毫升，加入浓盐酸1毫升，于120℃水解4小时。将 盐酸和蒸馏水用水泵抽干后，用5毫升双蒸水完全溶解残余物质。取1毫升双蒸水重 新溶解的水解糖溶液，于1.5毫升离心管中旋转抽干，用100微升双蒸水溶解残余物 质。将1/10体积双蒸水重新溶解的浓缩水解糖溶液经0.22微米孔径的滤器过滤后用高 效阴离子色谱法检测甘露糖，以此代表胞外多糖中甘露糖基组分。以甘露糖标准溶液 作为对照。

所述高效阴离子色谱法使用的色谱柱是CarboPac PA1阴离子交换分离柱，使用的 样品检测器为脉冲安培检测器。

所述高效阴离子色谱法的操作流程如下：200毫摩尔/升氢氧化钠溶液以1毫升/ 分钟的流速清洗色谱柱20分钟，15毫摩尔/升氢氧化钠溶液以1毫升/分钟的流速平衡 色谱柱20分钟，10微升待测样品经由上样环上样并进入色谱柱，15毫摩尔/升氢氧化 钠溶液以1毫升/分钟的流速洗脱色谱柱20分钟。甘露糖的出峰时间为13.5分钟左右。

所述甘露糖标准溶液是精确称取10毫克无水甘露糖（于80℃烤箱内干燥恒重）， 以蒸馏水定容到100毫升。

结果如图3所示，Haloferax mediterranei ΔpyrF的菌落较Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps湿润且光滑，暗示Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps可能失去了胞外多糖 合成及分泌的能力；胞外多糖浓度的测定和甘露糖基组分的检测证明了Haloferax  mediterranei ΔpyrFΔeps完全丧失了合成及分泌胞外多糖的能力。将整合质粒 pWL502-eps转化到Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps中可以恢复胞外多糖合成和分泌 的能力，而空的质粒pWL502却不可以。以上的基因敲除和回补实验证明了预测的胞 外多糖合成的关键基因簇eps是胞外多糖合成必需的。

实施例3、不依赖外源添加尿嘧啶生长的eps敲除株的构建

尿嘧啶合成缺陷的eps敲除株Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps由于依赖外源添 加的尿嘧啶，即便可以高效利用碳源生产PHBV，却难以作为工业生产的菌株，所以 有必要原位回补其缺失基因pyrF。

1、尿嘧啶合成缺陷菌株缺失基因pyrF的原位敲入

利用基于pyrF基因的遗传操作系统，以Haloferax mediterranei ΔpyrFΔeps为出发 菌株，原位敲入缺失的基因pyrF，构建不依赖外源添加尿嘧啶的eps缺失突变株。先 构建用于原位敲入pyrF的整合质粒pT-pyrFr，再依次经同源重组单交换和同源重组双 交换，对获得的菌株进行筛选及验证，即得到目的菌株，具体步骤如下：

1）原位敲入pyrF的整合质粒pT-pyrFr的构建

根据序列6中pyrF编码序列及其上下游核苷酸序列，设计了一对包括pyrF编码 区和上、下游交换臂的扩增引物pyrFF1/pyrFR1：

pyrFF1：5’-GGGGTACCCGACGATGCGTGGCTGTA-3’（KpnⅠ）（与自序列6的 5'端第2533-2550匹配）

pyrFR1：5’-ACATGCATGCCGCCTTGTTCCTTCTGTAGACT-3’（SphⅠ）（与自序 列6的5'端第77-98匹配）

以Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因组为模板，用引物对 pyrFF1/pyrFR1扩增pyrF编码区和上、下游交换臂。此片段被命名为pyrFr，长度为 2474bp。PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、54℃30s、68℃180 s进行30个循环；68℃延伸7min。扩增体系为25μl。

将经限制性内切酶Kpn Ⅰ和Sph Ⅰ双酶切的PCR产物pyrFr和载体质粒pUCm-T （购自生工生物工程（上海）有限公司，产品编号为SK2211）用T4DNA连接酶16℃ 连接过夜，然后热激转化法将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态，在含有氨苄青霉 素抗性的平板上进行筛选，将获得的阳性克隆进行测序。将经测序表明含有pyrFr的 整合质粒命名为pT-pyrFr。

2）单交换菌株的构建、筛选及验证

采用PEG介导的转化方法，将pT-pyrFr转化Haloferax mediterraneiΔpyrFΔeps， 转化后涂布于筛选培养基AS-168SY固体平板，37℃培养4天左右。在该固体培养基 上能正常生长的单克隆为单交换菌株。

单交换菌株的验证：

根据序列6（pyrF基因编码区和上下游基因的核苷酸序列）中pyrF编码序列及其 上下游核苷酸序列，设计了两对位于上、下游交换臂外部且产物尽量小的扩增引物 pyrFF2/pyrFR2(1482bp)和pyrFF3/pyrFR3(869bp)：

pyrFF2：CGCTCAACAGTATCTGGTGGC（与自序列6的5'端第2738-2758匹配）

pyrFR2：CGTCGTCAAGCAGGTTCG（与自序列6的5'端第1277-1294匹配）

pyrFF3：GACAAGGCTGCGGGACA（与自序列6的5'端第853-869匹配）

pyrFR3：GGGGTCAAGTCAAGGGTAATC（与自序列6的5'端第1-21匹配）

以待验证单交换菌株的基因组为模板，分别用引物对pyrFF2/pyrFR2和 pyrFF3/pyrFR3进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、 54℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。若两 对引物中任一对引物能扩增出相应大小的片段（即pyrFF2/pyrFR2能扩增出1482bp长 度的片段或pyrFF3/pyrFR3能扩增出869bp长度的片段），则证明此菌株为单交换菌株。

3）双交换菌株的构建、筛选及验证

将步骤2）筛选到的单交换菌株在液体筛选培养基AS-168SY中传代培养50代， 将培养液稀释10⁷再次涂布于筛选培养基AS-168SY固体平板，37℃培养4天左右。 挑取单克隆划线于筛选培养基AS-168SY固体平板。

双交换菌株验证：

以待验证双交换菌株的基因组为模板，分别用引物对pyrFF2/pyrFR2和 pyrFF3/pyrFR3进行PCR反应，PCR扩增程序为：94℃5min预变性；94℃30s、 54℃30s、72℃120s进行30个循环；72℃延伸7min。扩增体系为25μl。若两 对引物都能扩增出相应大小的片段（即pyrFF2/pyrFR2能扩增出1482bp长度的片段且 pyrFF3/pyrFR3能扩增出869bp长度的片段），则证明此菌株为双交换菌株。

经验证的双交换菌株即为不依赖外源添加尿嘧啶的eps敲除株Haloferax  mediterranei Δeps，被命名为Haloferax mediterranei ES1。该胞外多糖合成关键基因簇 敲除株Haloferax mediterranei ES1仍依赖于高渗透压环境，在清水中容易裂解；细胞 仍成杆状，能够利用多种碳源生长，具有很强的淀粉水解及应用能力；在固体培养基 上形成粉红色菌落，但菌落表面变得干燥、褶皱；适宜培养温度为25-50℃，最适宜 培养温度为45℃；适宜培养pH值为中性，最适宜pH为7.0-7.2。

2、胞外多糖合成能力的检测

检测得到的工程菌株Haloferax mediterranei ES1是否因为pyrF基因的原位敲入影 响到胞外多糖合成缺陷的性状。

通过菌落形态的观察、胞外多糖浓度的测定和甘露糖组分的检测确定其胞外多糖 合成的能力，具体步骤可参照实施例1中第4部分。

结果如图3所示，pyrF基因的原位敲入不会影响到工程菌株Haloferax  mediterranei ES1的胞外多糖合成缺陷的性状。

实施例4、工程菌株与野生菌株生产PHBV的比较研究

1、用于PHBV生产的培养基组分、发酵条件及工艺流程

1）种子培养基、发酵培养基和补料培养基的配制

一级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸钠1克/升，柠檬酸三钠3克 /升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008 克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升。

所述一级种子培养基的pH是7.0-7.2。

二级种子培养基的各个组分及其浓度为：

酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸钠2克/升，柠檬酸三钠6 克/升，氯化钠200克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008 克/升，微量元素溶液SL-6 1毫升/升。

所述二级种子培养基的pH是7.0-7.2。

发酵培养基的各个组分及其浓度为：

氯化钠110克/升，氯化镁9.6克/升，硫酸镁14.4克/升，氯化钾5克/升，氯化 钙1克/升，碳酸氢钠0.2克/升，溴化钠0.375克/升，酵母提取物3克/升，氯化铵 2克/升，磷酸二氢钾0.0375克/升，淀粉20克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，微量 元素溶液SL-6 1毫升/升。

补料培养基的各个组分及其浓度为：

氯化钠129克/升，氯化铵45.45克/升，淀粉500克/升。

所述一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基于8磅蒸汽压力条件下湿热 灭菌30分钟。

2）菌种活化和种子培养

将地中海富盐菌的两个菌株Haloferax mediterranei ES1和地中海富盐菌Haloferax  mediterranei CGMCC 1.2087由单克隆接种到一级种子培养基中，37℃培养3天，此为 一级种子液；将一级种子液以2%（体积百分含量）的接种量分别接种到二级种子培 养基中，37℃培养3天，此为二级种子液。二级种子液作为发酵罐的种子液。

3）PHBV的发酵生产

将地中海富盐菌的菌株Haloferax mediterranei ES1二级种子液和地中海富盐菌 Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的二级种子液以10%（体积百分比）的接种量 分别接种到装有4升发酵培养基的发酵罐中，进行PHBV的发酵生产。发酵生产的条 件为：温度37℃；用2M盐酸溶液或2M氢氧化钠溶液调节pH稳定在6.95-7.05范围 内；通气量1.25:1vvm，搅拌随溶氧的变化手动调节以维持两个发酵罐中的溶氧都较 适宜为宜；罐体内压为1个大气压；发酵过程产生的气泡通过消泡电极的感应控制消 泡剂蠕动泵的搅动，从而加入消泡剂；发酵时间72小时。发酵生产进行到第28小时， 补料液以10.5毫升/小时的速率恒速加入发酵液，至发酵结束。

所述消泡剂是10毫升聚氧丙烯聚氧乙烯丙三醇醚（商品名称为泡敌）溶解于体 积浓度为20%的乙醇水溶液。

2、相关参数的的检测及分析

在发酵过程中，从二级种子液接种到发酵培养基的时刻（即第0小时）开始每8 个小时取100毫升左右的培养液，用于对发酵液中各个参数进行检测，从而作出分析。

1）菌体的回收及PHBV的测定

取50毫升培养液经10000转/分离心20分钟，倾倒干净上清，将离心管和残留在 底部的菌体于-70℃冷冻过夜。将装有冷冻菌体的离心管迅速放到真空冷冻干燥器中冷 冻抽干。抽干后的菌体称量总重，计算细胞干重（即每升培养液中的干菌体质量）；干 菌体经研磨均匀后称取70毫克左右，置于酯化管中，加入2毫升酯化液（3毫升浓硫 酸溶解于97毫升色谱纯的甲醇中，并精确称取0.1克苯甲酸溶于其中作为内标用于定 量）和2毫升氯仿，混匀后于100℃烤箱中酯化4小时。酯化反应后的样品冷却至室 温，加入1毫升双蒸水，混匀后室温静置至水相和氯仿相分层清晰（一般要两个小时 以上）。用气相色谱法检测氯仿相（下层）中丁酸甲酯和戊酸甲酯的含量，二者分别代 表PHBV中羟基丁酸和羟基戊酸的含量；以标准品（商品购得）做对照，计算PHBV 浓度（即每升培养液中的PHBV总质量）。细胞真实质量比细胞干重更能说明菌体的 生长情况。结合细胞干重，计算细胞真实质量（即细胞干重减去PHBV浓度）。

2）残余总糖的测定

取1毫升培养液经两次10000转/分离心15分钟完全除去菌体，将培养液上清稀 释到一定倍数，用蒽酮比色法测定培养液上清中残余总糖的含量。残余总糖的含量接 近淀粉浓度。所述蒽酮比色法的具体步骤可参照实施例1中第4部分的步骤2）。

结果如图4所示，Haloferax mediterranei ES1和Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087具有相同的生长速率，胞外多糖合成途径的切断并没有对碳源的吸收及利用产 生反馈抑制；在Haloferax mediterranei ES1中，本来用于胞外多糖合成的碳源由于胞 外多糖合成缺陷流向了包括PHBV合成的其他代谢通路。用Haloferax mediterranei ES1 发酵生产PHBV，发酵72小时，PHBV在发酵液中的浓度达到21.28克/升；在相同的 发酵条件下PHBV的浓度比Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087（17.80克/升）提高 20%。