水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法

技术领域

本发明属于环境监测技术领域，具体涉及一种水体中三苯甲烷类及代谢物超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱的检测方法。

背景技术

孔雀石绿（Malachite green，MG）和结晶紫（Crystal violet，CV）均为三苯甲烷类染料，因其具有消毒杀菌作用而广泛用于水产养殖中。另一种三苯甲烷类物质，亮绿（Brilliant green，BG），常用于复染细胞质的三苯甲烷类燃料，文献研究较少，它与MG、CV有类似的化学结构，也容易被水产品吸收。MG和CV在生物体内分别代谢降解产物为隐性孔雀石绿（Leucomalachite green，LMG）和隐性结晶紫（Leucocrystal violet，LCV）。三苯甲烷类及其代谢物具有较高毒性、致癌、致畸、致突变等特性，在生物体内具有较高残留，对人体危害较大，近年成为水体污染和水产品安全的重点监控污染物。美国、加拿大和欧盟等国已将MG、CV列为水产养殖禁用药，许多国家也制定了相关的法律法规及检测措施，欧盟成员国爱尔兰规定养殖排放水中MG含量不得超过100 μg/L，饮用水中不得超过1.0μg/L。我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中，禁止用于所有食品动物中；农业行业标准使用准则《无公害食品渔用药物使用准则》（NY 5071-2002）中也将MG列为禁用药物；同时严禁在水产养殖中使用MG和CV，并规定MG（含LMG）和（含LCV）不得检出。但由于MG抗菌性效果好，价格低廉，替代品少等原因，仍有部分养殖用户偷偷使用。关于水产品中的三苯甲烷类物质及其代谢物的检测方法已经建立了相应的国标、行标，但目前对水环境中这类杀菌剂并没有相关控制限值，存在环境监管盲点，安全隐患较大。

三苯甲烷类物质分子式如下。

目前，国内外文献报道有关三苯甲烷类物质的测定多采用液相色谱法（紫外检测、荧光检测）或液质联用技术。由于LMG、LCV在紫外可见区无吸收峰，而MG、CV又无荧光响应，故采用高效液相法同时测定这几类物质时往往需要借助一定的前处理手段，如紫外可见法测定时需经过PbO₂柱后衍生，将隐性物质LMG、LCV氧化为显性物质MG、CV，但衍生柱填料配比受到流动相和样品基质的影响，存在转化率不稳定等问题；而使用荧光检测器测定时，可通过在前处理过程中加入还原剂，将MG、CV还原成LMG、LCV；为避免前处理氧化柱或还原剂的繁琐，也有利用高效液相色谱-紫外-荧光串联法，直接测定养殖水中MG、CV及其代谢残留，该方法检出限为0.4 μg/L。目前还未见可以同时检测MG、LMG、CV、LCV、BG五种物质的并且检出限到ng级别的检测方法。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种的水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法。本发明采用复合质谱是一种先进的新型质谱仪器，串联四极杆线性离子阱技术，极大提高了MS/MS扫描能力，可以建立了一种简单、快速、灵敏的方法，同时测定水体中5种三苯甲烷类及其代谢物，为进一步分析评价生态环境中污染情况提供可靠的检测方法。

本发明是通过下述的技术方案来实现的：

一种水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法，

该方法所用到的设备包括超高效液相色谱仪和三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪，

所述超高效液相色谱仪为ACQUITY UPLC，色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18，色谱柱规格为2.1 mm × 50 mm，1.7 μm；柱温为50 ℃；流速为0.5 mL/ min，进样体积5μL；流动相为：以5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相A，流动相A用甲酸调节至PH=4.5，乙腈为流动相B；洗脱条件为：采用梯度洗脱模式，0 min，20% B，保持0.5 min；2.9 min时，线性增长至80% B，保持1 min；4 min后恢复为20% B，平衡1 min结束；

所述的三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪为AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪，所述质谱仪中离子化电压为5000 V，离子源温度为600 ℃，气帘气为40 pis，喷雾气为55 pis，辅助加热气为60 psi，碰撞器为High，离子源为电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描方式，“杆-阱扫描”方式；

该方法包括内标混合液的制备工序、样品溶液的制备工序和上机检测工序，

所述内标混合液的制备工序如下：内标混合液配置：取MG-D_5、LMG-D_6、CV-D₆和LCV-D₆，加乙腈配制成浓度为MG-D₅500 μg/L、LMG-D₆100 μg/L、CV-D₆100 μg/L和LCV-D₆500 μg/L的混合溶液，作为内标混合液备用；

所述样品溶液的制备工序如下：取活化好的固相萃取柱，量取100 mL水样，加入2 mL 10%盐酸羟胺溶液、1 mL 1.0 mol/L对甲苯磺酸溶液，再加入10 μL内标混合溶液，摇匀后，以1 mL/min的流速将水样通过固相萃取柱，以富集水样中的三苯甲烷类化合物，上样后，依次用3 mL丙酮、5 mL乙腈、5 mL水淋洗固相萃取柱除杂，用氮气吹扫固相萃取柱，去除固相萃取柱中的水分；最后用氨水-乙腈溶液洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；将洗脱液置于氮吹浓缩仪中，吹至尽干，用乙腈定容至1.0 mL，涡旋振荡混匀，微孔滤膜滤过，取滤液，得水样品溶液；

所述上机检测工序如下：将样品溶液置于进样瓶中，上机通过超高效液相色谱-质谱仪检测，测定结果，该方法的检测限为MG2.18 ng/L，LMG1.19 ng/L，CV1.07 ng/L，LCV0.97 ng/L，BG0.42 ng/L，定量限MG8.73 ng/L，LMG4.75ng/L，CV4.26 ng/L，LCV3.90 ng/L，BG1.68 ng/L。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，流动相5 mmol/L乙酸铵水溶液中的水为Millipore超纯水。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的固相萃取柱为Oasis MCX 150 mg/ 6 cc。 

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的MCX固相萃取柱的活化方法为分别用5 mL乙腈、5 mL 5%甲酸水溶液活化MCX固相萃取柱30min。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的氮气吹扫时间为20min。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的氨水-乙腈的体积比为5:95。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的氨水-乙腈溶液洗脱用量为10ml。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的微孔滤膜为0.22 μm PVDF滤膜。

本发明对质谱条件进行了选择实验，根据MG、LMG、CV、LCV、BG及其对应同位素内标物的化学性质，采用“杆-阱扫描”（MRM-IDA-EPI）模式，选择[M + H]^- 为母离子，再以适当的碰撞能量对其进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片。离子峰响应最强的子离子作为定量离子，响应相对较强的子离子作为定性离子。详细参数见表1。

三重四极杆/复合线性离子阱质谱，既保留串联四极杆较好选择性与灵敏度，也可作线性离子阱增强二级碎片离子定性功能。“杆-阱扫描”（MRM-IDA-EPI）模式，一次进样可得到用于定量的MRM色谱图及用于定性的MS₂质谱图，与常见的三重四极杆扫描模式相比，增强了二级碎片子离子扫描，极大提高了MS/MS的扫描能力，更利于微量分析，增加复杂介质中目标化合物的定性能力。MG举例，比较了EPI扫描模式与MS/MS子离子扫描模式对比，在相同浓度10 μg/L的MG在EPI扫描模式下，碎片离子响应增强近100倍。

由于三苯甲烷类化合物属于极性分子，选用ESI离子源相比于APCI离子源，离子化效率更高。MG、CV、BG具有铵离子基团，LMG、LCV具有二甲胺基，因此离子化采用正离子ESI源。

本发明对色谱条件流动相进行了选择实验目标化合物三苯甲烷类物质属于弱碱性物质，在超高效液相色谱-质谱联用中，对于正离子电喷雾扫描模式，流动相在弱酸性环境条件下加入适量乙酸铵可以提高待测物离子化效率。当水相中同时添加乙酸铵和甲酸时，有利于目标分析物的分子离子化，目标化合物的色谱峰峰形得到极大改善。本实验考察了流动相乙腈-5 mmol/L乙酸铵（分别含0.01%，0.02%，0.05%，0.10%和0.20%甲酸）对流动相对目标化合物的影响。结果表明，当甲酸含量越高，目标化合物与C18柱的硅醇基发生反应，峰形较宽并带有拖尾，分离度也很差。pH值越低，尤其对LCV的峰形影响越大、色谱峰响应减弱、峰形变宽拖尾（图4中列出流动相不同浓度甲酸对LCV物质的影响）。当酸的浓度低于0.02%时，对峰形无影响。根据峰形、响应强度、分离度等综合因素考虑，最终选择乙腈-5 mmol/L乙酸铵（0.02%甲酸）水溶液作流动相。

本发明对内标物进行了选择实验，本实验发现，三苯甲烷类物质对内标物的要求非常严格，由于三苯甲烷类物质本身的不稳定及源内裂解等一些特性，选用不同的内标，对各目标物标准曲线的线性影响显著，表1中列出了在相同的线性范围下，选择不同内标物所获得的线性相关系数。结果可见，选择与自身结构及性质尽可能相似的内标，可以很好的校正因不稳定和源内裂解产生的误差问题。

本发明对固相萃取前处理的条件进行了优化选择，

固相萃取的选择的试验结果如下：比较了C18、HLB柱和MCX柱对三苯甲烷类物质的萃取效率，结果表明MCX对三苯甲烷类物质有较好的萃取效率，而采用C18、HLB柱进行萃取时，五种物质的回收率在10%—50%之间，相对较低。由于三苯甲烷类物质属于碱性离子型化合物，阳离子交换柱适合碱性离子型化合物的富集与分离，这与实验结果相吻合。

固相萃取柱的活化的试验结果如下：三苯甲烷类物质在酸性条件下易形成阳离子。根据阳离子固相萃取柱上样条件，样品溶液pH值要小于其pKa两个单位，保证上样溶液带正电荷。实验中对于固相萃取柱活化溶液是否酸化做了考察，经乙腈活化后，对纯水活化和酸水活化进行比较。如果选用乙腈，纯水活化，对于显性物质MG、CV、BG回收率在65%左右，而隐性物质LMG、LCV回收率低于50%。而固相萃取柱的活化溶液用酸性溶液酸化后，萃取效率明显好转，回收率达到80%以上。所以阳离子交换柱采用酸性溶液活化，上样水样调节pH为酸性，有利于阳离子交换柱对目标化合物的富集。三苯甲烷类物质极性较大，水样用离子对试剂对甲苯磺酸酸化，有利于三苯甲烷类物质形成离子对，增加提取效率。同时MG、LMG、CV、LCV、BG对光、热、氧气敏感，易甲基化、氧化，所以，在样品提取时加入还原剂盐酸羟胺，有利于防止待测物的降解。

洗脱溶剂的优化试验结果如下：

为中和分析物的电荷，阳离子交换柱的洗脱溶液pH值要大于其pKa两个单位，所以洗脱溶剂采用碱性溶液洗脱。在一些文献的基础上，本实验比较了氨水-乙腈（5：95）、氨水-甲醇（5：95）、氨水-甲醇-乙酸乙酯（5：45：50）3种洗脱液的洗脱效果（见图1）。氨水-乙腈（5：95）溶液回收率很好；氨水-甲醇（5：95）对大部分物质回收率低于40%；氨水-甲醇-乙酸乙酯（5：45：50）对BG损失较大，回收率仅30%。最终洗脱溶剂选择氨水-乙腈（5：95）。洗脱溶剂的优化试验结果见图1。

本发明水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法的标准曲线如下：

以各组分的峰面积（Y）对浓度（X，μg/L）绘制标准曲线，MG、LCV、BG线性范围0.02-20.0 μg/L，LMG、CV线性范围0.02-5.0 μg/L，质量浓度在线性范围内与峰面积呈良好的线性关系，r大于0.998以上。表2中列出三苯甲烷类物质的线性关系、相关系数。

本发明水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法的检出限与定量限如下：根据国家环境标准空白实验未检出目标物质的检出限测定方法，本实验以5.0 ng/L的水样浓度作为检出限测定的浓度，配制7份平行水样，水样体积为100 mL。经全过程分析，计算其浓度的标准偏差S。以3.14S为检出限（LOD），4倍检出限为定量下限（LOQ），5种物质的检出限为0.32 ~ 2.18 ng/L，（见表3）方法具有较高的灵敏度，完全满足水体中三苯甲烷类的分析测定。

本发明水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法的精密度与回收率如下:

方法采用空白水样加标方式，在浓度水平分别为5.0 ng/L、10.0 ng/L、20.0 ng/L的空白加标水样进行回收率测定，每个加标水样平行配置6份样品，其加标回收率及精密度结果见表4。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明采用复合质谱是一种先进的新型质谱仪器，串联四极杆线性离子阱技术，极大提高了MS/MS扫描能力，同时串联超高效液相色谱仪，可以建立了一种简单、快速、灵敏的方法，同时测定水体中5种三苯甲烷类及其代谢物，为进一步分析评价生态环境中污染情况提供可靠的检测方法。

（2）三重四极杆/复合线性离子阱质谱，既保留串联四极杆较好选择性与灵敏度，也可作线性离子阱增强二级碎片离子定性功能。“杆-阱扫描”（MRM-IDA-EPI）模式，一次进样可得到用于定量的MRM色谱图及用于定性的MS₂质谱图，与常见的三重四极杆扫描模式相比，增强了二级碎片子离子扫描，极大提高了MS/MS的扫描能力，更利于微量分析，增加复杂介质中目标化合物的定性能力。

（3）欧盟成员国爱尔兰规定养殖排放水中MG含量不得超过100 μg/L，饮用水中不得超过1.0 μg/L，而本方法的检出限为0.42 ~ 2.18 ng/L，远低于要求的限制，完全满足环境监管需求。

附图说明

图1  不同洗脱溶剂的回收率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

本实施例所用到的仪器设备有：

超高效液相色谱ACQUITY UPLC（美国Waters公司）；AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪（美国 AB公司）；固相萃取仪（美国 Supelco公司）；固相萃取柱Oasis MCX 150 mg/ 6 cc（美国 Waters公司），氮吹浓缩仪（美国 Zymark公司）；0.22μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜针头式过滤器（美国 Millipore公司）；Milli-Q超纯水器（美国 Millipore公司）；涡旋混合器（日本 LMS公司）。

本实施例所用到的试剂有：

标准品孔雀石绿（MG，纯度98.0%）、隐性孔雀石（LMG，纯度97.0%）、结晶紫（CV，纯度92.5%）、隐性结晶紫（LCV，纯度99.0%）、亮绿（BG，纯度96.0%）、氘代隐性孔雀石（LMG-D6，纯度98.5%）、氘代结晶紫（CV-D6，纯度99.0%）均为德国Dr. Ehrenstorfer公司试剂；氘代孔雀石绿（MG-D5，纯度99.7%）和氘代隐性结晶紫（LCV-D6，纯度99.8%）为德国Witega公司试剂。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、异丙醇、乙酸铵、异丙醇、乙酸铵（色谱纯，德国 Merck试剂）；盐酸羟胺、对甲苯磺酸（纯度99%+，瑞士 Adamas公司）；实验用水Millipore超纯水（TOC：<1 ppb）。

一种水体中三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法，

该方法所用到的设备包括超高效液相色谱仪和三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪，

所述超高效液相色谱仪为ACQUITY UPLC，色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18，色谱柱规格为2.1 mm × 50 mm，1.7 μm；柱温为50 ℃；流速为0.5 mL/ min，进样体积5μL；流动相为：以5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相A，流动相A用甲酸调节至PH=4.5，乙腈为流动相B；洗脱条件为：采用梯度洗脱模式，0 min，20% B，保持0.5 min；2.9 min时，线性增长至80% B，保持1 min；4 min后恢复为20% B，平衡1 min结束；

所述的三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪为AB SCIEX QTRAP 5500 质谱仪，所述质谱仪中离子化电压为5000 V，离子源温度为600 ℃，气帘气为40 pis，喷雾气为55 pis，辅助加热气为60 psi，碰撞器为High，离子源为电喷雾离子源，扫描方式为正离子扫描方式，“杆-阱扫描”方式；

该方法包括内标混合液的制备工序、样品溶液的制备工序和上机检测工序，

所述内标混合液的制备工序如下：内标混合液配置：取MG-D₅50mg、LMG-D₆10mg、CV-D₆10mg、和LCV-D₆50mg，置100ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容配制成浓度为MG-D₅500 μg/L、LMG-D₆100 μg/L、CV-D₆100 μg/L和LCV-D₆500 μg/L的混合溶液，作为内标混合液备用；

所述样品溶液的制备工序如下：取活化好的固相萃取柱，量取100 mL水样，加入2 mL 10%盐酸羟胺溶液、1 mL 1.0 mol/L对甲苯磺酸溶液，再加入10 μL内标混合溶液，摇匀后，以1 mL/min的流速将水样通过固相萃取柱，以富集水样中的三苯甲烷类化合物，上样后，依次用3 mL丙酮、5 mL乙腈、5 mL水淋洗固相萃取柱除杂，用氮气吹扫固相萃取柱20min，去除固相萃取柱中的水分；最后用10ml氨水-乙腈（5:95）溶液洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；将洗脱液置于氮吹浓缩仪中，吹至尽干，用乙腈定容至1.0 mL，涡旋振荡混匀，0.22 μm PVDF滤膜微孔滤膜滤过，取滤液，得水样品溶液；

所述上机检测工序如下：将样品溶液置于进样瓶中，上机通过超高效液相色谱-质谱仪检测，测定结果。三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪测定参考质谱条件见表5。

该方法的检测限为MG2.18 ng/L，LMG1.19 ng/L，CV1.07 ng/L，LCV0.97 ng/L，BG0.42 ng/L，定量限MG8.73 ng/L，LMG4.75ng/L，CV4.26 ng/L，LCV3.90 ng/L，BG1.68 ng/L。

上述的三苯甲烷类及其代谢物的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱质谱检测方法中，所述的MCX固相萃取柱的活化方法为分别用5 mL乙腈、5 mL 5%甲酸水溶液活化MCX固相萃取柱30min。

对南京地区30个点位的环境水样进行分析测定。结果表明，靠近某化工厂池塘水样MG的浓度为3.64 ng/L，某化工厂长江废水排出口CV的浓度为2.11 ng/L其它水源地各物质检测均低于检出限。通过分析，饮用水源地的水样对目标化合物均未检出，但在污染源附近的水样，受化工厂等影响，能够对其中某些物质检出。欧盟成员国爱尔兰规定养殖排放水中MG含量不得超过100 μg/L，饮用水中不得超过1.0 μg/L，而本方法的检出限为0.42 ~ 2.18 ng/L，远低于要求的限制，完全满足环境监管需求。在大量样品分析或养殖水含量过高的情况，水样经PH值调节过滤后，可以直接进样，检出限为26.7-40.8 ng/L，亦远低于控制限值。

虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。