一种新型异黄酮酰胺衍生物的制备方法,及抗氧化活性研究

技术领域

本发明涉及一类具有抗氧化性能的新型化合物及其制备方法。更具体 地说，本发明涉及新型异黄酮酰胺衍生物、其制备方法及其作为抗氧化剂 的用途。

背景技术

异黄酮属于黄酮类化合物，是一类重要的天然有机化合物，是植物在 长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。它广泛存在于高等植物及 羊齿植物的根、茎、叶、花、果实等中，不仅数量种类繁多，而且结构类 型复杂多样。

异黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞 具有许多重要的生理、生化作用。一方面，异黄酮类化合物具有高度的化 学反应性，例如，它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用；另一方 面，异黄酮类化合物又具有很多重要的药理作用，对人类的许多疾病具有 治疗价值。它们拥有抑制酶的活性、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过 敏、抗糖尿病并发症等功能，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退变性疾 病的治疗和预防有重要意义，它作为弱雌激素，在治疗妇女更年期综合症 方面有很好的应用前景。此外，异黄酮类化合物还是众多中草药如黄芩、 银杏、沙棘等的活性成分。因此，引起了国内外化学家、药物学家的广泛 重视，研究进展很快，具有十分诱人的应用前景。

自由基是引起癌症、衰老、心血管等退变性疾病的罪恶之源。自由基在 体内可直接或间接地发挥强氧化剂作用而与机体内核酸、核蛋白和脂肪酸 相结合，转变成氧化物或过氧化物，使之丧失活性或变性，细胞功能发生 障碍，引起机体逐渐衰老或病变。研究显示，异黄酮类化合物具有抑制自 由基的生成、降低脂质过氧化和刺激抗氧化酶的作用。目前对于黄酮类抗 氧化剂的结构修饰多集中于化学改性，以便提高在食品中的分散能力和透 过细胞膜的能力，从而更充分的发挥其抗氧化作用。因此，以黄酮类化合 物为先导化合物，对其进行结构改造和结构优化，以期研发出具有更强药 理作用的黄酮类新药，是该研究领域的一个重要课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化性能的新型化合物。

本发明的更具体的目的是提供一种异黄酮酰胺衍生物。

本发明的另一目的是提供制备上述异黄酮酰胺衍生物的方法。

本发明的又一目的是本发明的异黄酮酰胺衍生物作为抗氧剂的用途。

本发明一方面提供一种通式I的异黄酮酰胺衍生物，其具有如下文所 示的结构。

本发明另一方面提供一种制备通式I的异黄酮酰胺衍生物的方法。

本发明再一方面提供通式I的异黄酮酰胺衍生物作为抗氧化剂的用 途。

本发明的这些和其他目的、特征和优点在结合附图阅读完本说明书之 后将变得更加明了。

附图说明

图1为本发明实施例2中得到的化合物L1在不同浓度条件下清除 O₂^-·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照319nm处峰高度从高到低依次排列， 分别代表本发明化合物L1的浓度为0、2、4、5、6、7、8、9、12、16μM 时的吸收曲线。

图2为本发明实施例3中得到的化合物L2在不同浓度条件下清除 O₂^-·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照319nm处峰高度从高到低依次排列， 分别代表本发明化合物L2的浓度为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μM 时的吸收曲线。

图3为本发明实施例4中得到的化合物L3在不同浓度条件下清除 O₂^-·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照319nm处峰高度从高到低依次排列， 分别代表本发明化合物L3的浓度为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18μM 时的吸收曲线。

图4-6分别为本发明实施例2-4中得到的化合物L1、L2和L3在不同 浓度条件下清除O₂^-·的清除率曲线。

图7为本发明实施例2中得到的化合物L1在不同浓度条件下清除·OH 的荧光光谱图；曲线1-10按照427nm处峰高度从高到低依次排列，分别 代表本发明化合物L1的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、 4.0μM时的荧光光谱图。

图8为本发明实施例3中得到的化合物L2在不同浓度条件下清除·OH 的荧光光谱图；曲线1-10按照427nm处峰高度从高到低依次排列，分别 代表本发明化合物L2的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、4.0、 6.0μM时的荧光光谱图。

图9为本发明实施例4中得到的化合物L3在不同浓度条件下清除·OH 的荧光光谱图；曲线1-10按照427nm处峰高度从高到低依次排列，分别 代表本发明化合物L3的浓度为0、0.2、0.4、0.7、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、 4.5μM时的荧光光谱图。

图10-12分别为本发明实施例2-4中得到的化合物L1、L2和L3在不 同浓度条件下清除·OH的清除率曲线。

图13为本发明实施例2中得到的化合物L1在不同浓度条件下清除 DPPH·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照517nm处峰高度从高到低依次排 列，分别代表本发明化合物L1的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6、1.8mM时的吸收曲线。

图14为本发明实施例3中得到的化合物L2在不同浓度条件下清除 DPPH·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照517nm处峰高度从高到低依次排 列，分别代表本发明化合物L2的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6、1.8mM时的吸收曲线。

图15为本发明实施例4中得到的化合物L3在不同浓度条件下清除 DPPH·的紫外吸收曲线；曲线1-10按照517nm处峰高度从高到低依次排 列，分别代表本发明化合物L3的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6、1.8mM时的吸收曲线。

图16-18分别为本发明实施例2-4中得到的化合物L1、L2和L3在不 同浓度条件下清除DPPH·的清除率曲线。

具体实施方式

本发明的异黄酮酰胺衍生物为未见文献报道的新型异黄酮衍生物且由 如下通式I表示：

其中

R¹相同且为NH₂、C₁-C₆亚烷基COOM或C₁-C₆烷基，优选NH₂、 CH₂COONa或CH₃；

M为碱金属离子或碱土金属离子，优选钠离子、钾离子、钙离子或镁离 子，更优选钠离子；和

R²各自相互独立地为C₁-C₆亚烷基，优选亚甲基。

用于本文的术语C₁-C₆烷基是指具有1-6个碳原子的饱和直链或支化 烃基，例如C₁-C₄烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁 基、仲丁基和叔丁基。

用于本文的术语C₁-C₆亚烷基例如包括C₁-C₄亚烷基，如亚甲基、亚 乙基、亚丙基和亚丁基。

本发明还涉及其中R¹为NH₂，R²为亚甲基的通式I的化合物(L1)，即 4′,7-二氧乙酰肼异黄酮。

本发明还涉及其中R¹为CH₂COONa，R²为亚甲基的通式I的化合物 (L2)，即4′,7-二氧乙酰甘氨酸钠异黄酮。

本发明还涉及其中R¹为CH₃，R²为亚甲基的通式I的化合物(L3)，即 4′,7-二氧(N-甲基乙酰胺)异黄酮。

本发明还涉及一种制备通式I的异黄酮酰胺衍生物的方法，

其中R¹相同且为NH₂、C₁-C₆亚烷基COOM或C₁-C₆烷基，

M为碱金属离子或碱土金属离子，优选钠离子、钾离子、钙离子或镁离 子，更优选钠离子，和

R²各自相互独立地为C₁-C₆亚烷基，优选亚甲基，

该方法包括：

步骤a1)

其中R²如上所定义，

和

当R¹为NH₂时，随后反应如下：

步骤b1)

其中R²如上所定义，

当R¹为C₁-C₆亚烷基COOM时，随后反应如下：

步骤b2)

其中R²如上所定义，

当R¹为C₁-C₆烷基时，随后反应如下：

步骤b3)

其中R²如上所定义。

步骤a1)通常在选自乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙酸乙酯、N,N-二甲基 甲酰胺、二氯甲烷和三氯甲烷的溶剂中在选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、 吡啶和三乙胺的碱存在下加热回流进行。化合物BrR²COOC₂H₅与化合物 1(大豆甙元)的摩尔比通常为2-4。反应时间通常为10-20小时。通常而言， 每g化合物1使用10-500ml溶剂。碱的用量通常为每mol化合物1使用 2-8mol碱。

步骤b1)通常在选自甲醇、乙醇、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺的溶剂中 加热回流进行。肼与化合物2的摩尔比通常为5-50。每g化合物2通常使 用10-500ml溶剂。反应时间通常为10-20小时。

步骤b2)通常在选自甲醇、乙醇、乙腈和N,N-二甲基甲酰胺的溶剂中 加热回流进行。化合物H₂N-C₁-C₆亚烷基-COOM与化合物2的摩尔比通 常为5-20。每g化合物2通常使用10-500ml溶剂。反应时间通常为10-30 小时。

此外，步骤b2)还可按如下进行：首先使化合物2与相应的氨基羧酸 反应，然后使所得产物与碱金属或碱土金属化合物反应使羧基成盐而得到 本发明化合物。碱金属或碱土金属化合物的实例为碱金属或碱土金属的氢 氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，优选钾、钠或钙的氢氧化物、碳酸盐或碳酸 氢盐，最优选氢氧化钠。

步骤b3)通常在室温至70℃下在选自甲醇、乙醇、乙腈和N,N-二甲基 甲酰胺的溶剂中进行。化合物C₁-C₆烷基NH₂与化合物2的摩尔比通常为 5-500，优选50-200。每g化合物2通常使用10-500ml溶剂。反应时间通 常为10-20小时。

最后，本发明涉及通式I的化合物作为抗氧化剂的用途。

本发明化合物的抗氧化性能研究通过该化合物对自由基清除的能力来 进行判断。本发明选用三种常见的自由基作为本发明化合物作用的对象， 即超氧阴离子自由基(O₂^-·)、羟基自由基(·OH)、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基 (DPPH·)。

超氧阴离子自由基(O₂^-·)是一类很广泛的活性氧自由基，本发明采用邻 苯三酚在碱性体系中发生自氧化的方法产生超氧阴离子自由基(O₂^-·)以供 实验检测用。邻苯三酚在酸性环境中相当稳定，而在碱性条件下能迅速自 氧化，并在自氧化过程中产生O₂^-·，自由基继续加速其自氧化反应，如果 及时清除自由基，就会抑制其自氧化反应速率。文献表明，pH＝8.2的 0.05mmol/L Tris-HCl缓冲溶液和邻苯三酚溶液在200~800nm波长范围内 基本没有明显吸收，而邻苯三酚在pH＝8.2的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶 液中发生自氧化后，在319nm波长处出现了一个很强的吸收峰，不仅证明 了邻苯三酚能在碱性条件下迅速发生自氧化反应产生O₂^-·，而且这种自氧 化反应能产生具有紫外吸收的产物，便于通过紫外吸收监测。

羟基自由基(·OH)是已知的最强的氧化剂，它比高锰酸钾和重铬酸钾的 氧化性还强，H₂O₂在紫外光照射下会发生分解反应，生成羟基自由基 (·OH)，它容易进攻芳环化合物——对苯二甲酸(TA)，生成具有荧光的羟 基－对苯二甲酸。而在实验条件下，TA本身的荧光很弱，基本可以忽略。 因此，通过监测产物的荧光强度就可以确定体系中·OH的相对含量。当体 系中有抗氧化剂样品存在时，H₂O₂产生的部分·OH与样品反应，生成无荧 光物质的同时，也减少了前面提到的·OH与对苯二甲酸反应产物的生成。 通过测定加入样品后溶液荧光强度的变化，便能间接反映出样品对·OH自 由基的清除能力。

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)是一种较为稳定的自由基，分子结 构中有未成对电子，其乙醇溶液(蓝紫色)在517nm处有最大吸收。当未成 对电子被其它自由基电子配对后，吸收值降低，其褪色程度与其所接受的 电子数成定量关系。当与抗自由基活性物质作用时(pH为5.0-6.5)，其吸收 值降低越多，则表明抗自由基活性物质的活性越强。本发明采用分光光度 法测定本发明化合物对DPPH·的清除作用。

下面通过实施例进一步说明本发明，但不必看作是对本发明范围的限 制。

实施例1

4′,7-二氧乙酸乙酯异黄酮的制备

在100mL圆底烧瓶中，加入2.5g(10mmol)大豆甙元，5.5g(40mmol) 干燥的无水碳酸钾，80mL无水乙腈，室温搅拌30min，然后用移液管移 取3.3mL(20mmol)溴乙酸乙酯逐滴加入反应瓶中，常温搅拌10min，以使 其完全溶解，之后加热回流。TLC监测反应进程(展开剂为乙酸乙酯：石 油醚＝1：2)，直至原料大豆甙元基本消失时(时间大约12h)，停止加热， 继续搅拌直至自然冷却至室温。然后在约10mmHg下减压旋转蒸干溶剂乙 腈，将得到的固体用蒸馏水洗至中性，除去碳酸钾，抽滤得白色固体。再 将此白色固体加入到30mL 3M氢氧化钠水溶液中充分搅拌洗涤，抽滤得 淡黄色固体。再将此淡黄色固体用水洗至中性，得到白色固体，室温真空 干燥，得粗产品4.3g。将粗产品用约15mL无水乙醇重结晶，以白色片状 晶体得到3.5547g的标题化合物，产率为82.80%。重复上述反应一次，将 所得产物合并，总计得到7.0324g标题化合物。

实施例2

4′,7-二氧乙酰肼异黄酮(L1)的制备

在250mL圆底烧瓶中，加入3g(7mmol)4′,7-二氧乙酸乙酯异黄酮以及 60mL无水乙醇，电磁搅拌，反应液为白色浑浊。用移液管移取10mL 80% 水合肼溶液(约165mmol)逐滴加入反应瓶中，室温搅拌，然后加热回流， 此时反应物全部溶解呈无色澄清溶液。TLC监测反应进程(展开剂为乙酸 乙酯：石油醚＝1：2)，直至原料点4′,7-二氧乙酸乙酯异黄酮基本消失时(时 间大约12h)，停止加热，继续搅拌直至自然冷却至室温。然后在约10mmHg 下减压旋转蒸干溶剂乙醇及未反应完的水合肼，此时肼不能完全蒸干除去， 最后得无色透明油状物。向此油状物中加入蒸馏水洗涤，立即有大量白色 固体生成，静置过夜，以使其沉淀完全。然后真空抽滤，蒸馏水洗涤，干 燥，得粗产品2.503g。将所得粗产品用无水乙醇重结晶，以白色粉末状固 体得到2.2336g L1，产率为80.2%。m.p.：132.2~133.1℃；IR(KBr，υ， cm^-1)：3452，3315，2927，1640，1626，1572，1365，1240，920；¹HNMR (DMSO，500Hz，δ)：8.09(2H，s，N-H)，7.68(1H，d，Ar-H)，7.54(1H， s，-OCH=)，7.31(2H，d，Ar-H)，7.06(2H，d，Ar-H)，6.78(2H，d， Ar-H)，4.70(4H，s，-C_H2-)，2.0(4H，s，-NH₂)。对C₁₉H₁₈N₄O₆(F.W.= 398.37)的分析计算值(%)：C，57.28；H，4.55；N，14.06；实测值(%)：C， 57.19；H，4.61；N，14.15。

实施例3

4′,7-二氧乙酰甘氨酸钠异黄酮(L2)的制备

在100mL圆底烧瓶中加入1g(2.3mmol)4′,7-二氧乙酸乙酯异黄酮，通 过电磁搅拌在60ml乙醇中加热溶解，得无色澄清液。然后在含1.7g(23mmol) 甘氨酸的水溶液中加入0.92g NaOH(23mmol)，将所得溶液加入圆底烧瓶 中，加入后圆底烧瓶中的溶液立即变为亮黄色澄清液，加热回流1天。反 应结束后，在约10mmHg下减压旋转蒸发除去溶剂乙醇和水，得浅黄色固 体。所得固体用少量无水乙醇洗涤，真空抽滤，干燥，得粗产品。所得粗 产品用5%氯化钠水溶液重结晶，以白色粉末得到0.7498g L2，产率为 67.3%。m.p.>300℃；IR(KBr，υ，cm^-1)：3449，3186，1725，1635，1453， 1365，1215，895；¹HNMR(DMSO，500Hz，δ)：7.89(2H，s，N-H)，7.68(1H， d，Ar-H)，7.42(1H，s，-OCH=)，7.24(2H，d，Ar-H)，7.11(2H，q， Ar-H)，6.80(2H，d，Ar-H)，4.81(2H，s，-O-CH₂-CO)，4.73(2H，s， -O-CH₂-CO)，4.15(2H，d，-NH-CH₂-CO)，4.07(2H，d，-NH-CH₂-)。对 C₂₃H₁₈N₂O₁₀Na₂(F.W.=528.38)的分析计算值(%)：C，52.28；H，3.43； N，5.30；实测值(%)：C，52.36；H，3.38；N，5.27。

实施例4

4′,7-二氧(N-甲基乙酰胺)异黄酮(L3)的制备

在100mL圆底烧瓶中，加入0.64g(1.4mmol)4′,7-二氧乙酸乙酯异黄 酮以及60mL无水乙醇，电磁搅拌，反应液为白色浑浊。用移液管移取10mL 甲胺的乙醇溶液(浓度：31%-35%)(易挥发，大过量)逐滴加入反应瓶中， 先室温搅拌30min，使甲胺尽量多的溶解在乙醇中，然后缓慢升温至60℃ 左右，此时反应物全部溶解呈浅黄色溶液。TLC监测反应进程(展开剂为 乙酸乙酯：石油醚＝1：2)，直至原料点4′,7-二氧乙酸乙酯异黄酮基本消失 时(时间大约为12h)，停止加热，继续搅拌直至自然冷却至室温。然后在约 10mmHg下减压旋转蒸干溶剂乙醇以及未反应完的甲胺，将得到的固体用 蒸馏水洗涤，抽滤得浅黄色固体，室温真空干燥，得粗产品。将粗产品用 无水乙醇重结晶两次，以浅黄色固体粉末得到0.3216g L3，产率为57.95%。 m.p.：116.2~116.9℃；IR(KBr，υ，cm^-1)：3441，3090，1637，1625，1580， 1385，1265，834；¹HNMR(DMSO，500Hz，δ)：8.15(2H，s，N-H)，8.02 (1H，d，Ar-H)，7.60(1H，s，-OCH=)，7.54(2H，d，Ar-H)，7.16(2H， q，Ar-H)，6.74(2H，d，Ar-H)，4.85(4H，s，-CH₂-)，2.74(6H，s，-CH₃)。 对C₂₁H₂₀N₂O₆(F.W.=396.39)的分析计算值(%)：C，63.63；H，5.09；N， 7.07；实测值(%)：C，63.60；H，5.12；N，7.11。

实施例5

来自实施例2-4的本发明化合物L1、L2和L3对超氧阴离子自由基(O₂^-·)的清除能力实验

本发明化合物各样品溶液采用DMF配制而成，浓度均为 1.0×10^-2mol/L，邻苯三酚溶液浓度为1.0×10^-2mol/L(以10mmol/L HCl溶液 作溶剂配制)，缓冲溶液为pH=8.2的0.1mol/L Tris-HCl缓冲溶液。

具体做法是：在严格保温30℃下，取0.1mol/L Tris-HCl缓冲溶液5mL， 然后加入不同体积事先配好的各种样品溶液。最后加入0.1mL 1.0×10^-2mol/L邻苯三酚溶液，用一次水定容到10mL。30℃下静置4分钟， 立即测量紫外吸光度。测定加样品的体系吸光度时分别以对应浓度的样品 的Tris-HCl缓冲溶液为参照溶液，未加样品溶液组以相应Tris-HCl缓冲 溶液作为参照溶液。由此得到如图1-3所示的邻苯三酚自氧化光谱图。

清除率按下式计算：

清除率=(A₀-A)/A₀×100%

其中：A₀为未加本发明化合物样品溶液的邻苯三酚自氧化体系4分钟 时在319nm波长处的紫外吸光度，A为加入本发明化合物样品溶液的邻苯 三酚自氧化体系4分钟时在319nm波长处的紫外吸光度。

以清除率为纵坐标，样品浓度为横坐标作图，得到图4-6中的实验曲 线，通过非线性S回归拟合，得到相应的拟合曲线，从而可得清除率为50% 时的样品浓度，即半数清除率IC₅₀值。L1、L2和L3对O₂^-·清除活性的IC₅₀值分别为9.22×10^-6M、10.79×10^-6M和10.07×10^-6M。

图1-3中在319nm波长处的最强峰均为未加任何本发明化合物的邻苯 三酚的自氧化吸收峰，由图1-6中曲线的变化趋势，我们可以看出随着样 品浓度的逐渐增大，邻苯三酚自氧化吸收峰逐渐减弱，清除作用逐渐增强， 显示了邻苯三酚自氧化被抑制的程度越来越大，体现了样品清除超氧阴离 子自由基的能力。

实施例6

来自实施例2-4的本发明化合物L1、L2和L3对羟基自由基(·OH)的清除能力实验

本发明化合物各样品溶液采用DMF配制而成，浓度均为 1.0×10^-3mol/L，H₂O₂水溶液浓度为20mmol/L，对苯二甲酸溶液的浓度为 2mmol/L(用PB缓冲溶液作溶剂配制得到)，PB缓冲溶液：pH=7.6， 0.05mol/L KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液。

具体做法是：取0.2mL 20mmol/L H₂O₂，然后分别加入事先配好的不 同体积的各种样品溶液。最后加入0.2mL 2mmol/L对苯二甲酸，用一次水 定容到10mL。摇匀后迅速放到紫外灯下，用254nm波长照射20min。严 格控制照射的时间，取出放置20分钟，然后迅速测定溶液的荧光强度。由 此得到如图7-9所示的体系的荧光光谱。

荧光条件：激发波长(Ex)312nm，发射波长(Em)427nm。狭缝：EX＝ 3nm，EM＝3nm。

样品对·OH自由基的清除率按如下公式计算：

样品对·OH自由基的清除率=(F₀–F)/F₀×100%

其中F₀表示未加本发明化合物样品溶液的体系在427nm波长处的荧 光强度，F表示加入本发明化合物样品溶液的体系在427nm波长处的荧光 强度。

以清除率为纵坐标，相应样品浓度为横坐标作图，得到图10-12中的 实验曲线，通过非线性S回归拟合，得到相应的拟合曲线，从而可得清除 率为50%时的样品浓度，即半数清除率IC₅₀值。L1、L2和L3对·OH自 由基清除活性的IC₅₀值分别为4.30×10^-7M、6.83×10^-7M和10.83×10^-7M。

图7-9中在427nm波长处最强峰均位于未加本发明化合物的体系的荧 光光谱上，由图7-12中曲线的变化趋势，我们可以看出随着样品浓度的逐 渐增大，体系的荧光强度渐渐降低，清除作用逐渐增强，显示了·OH氧化 对苯二甲酸的反应逐渐被抑制，体现了样品清除羟基自由基(·OH)的能力。

实施例7

来自实施例2-4的本发明化合物L1、L2和L3对1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)的清除能力实验

本发明化合物各样品溶液采用DMF配制而成，浓度均为 1.0×10^-2mol/L，DPPH·溶液的浓度为2.0×10^-4mol/L(用无水乙醇作溶剂配制 得到)。

具体做法是：在10.0mL的比色管中分别加入2mL已配好的 2×10^-4mol/L的DPPH·自由基的乙醇溶液，然后分别加入配好的 1×10^-2mol/L的样品溶液，加入的体积依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、 1.2、1.4、1.6、1.8mL，最后用无水乙醇定容至10mL。将所得溶液摇匀， 室温反应30min后，用紫外-可见分光光度计测定吸光度。测定加了本发明 化合物样品溶液的体系的吸光度时以相应浓度的样品溶液做参比，测定未 加本发明化合物样品溶液的体系的吸光度时以乙醇做参比。加入不同体积 的样品溶液的体系的紫外吸收光谱图如图13-15所示。

清除率S按以下公式计算：

S＝(A₀–A)/A₀×100%

其中：A₀为未加本发明化合物样品溶液的体系在517nm波长处的紫外吸 光度，A为加了本发明化合物样品溶液的体系在517nm波长处的紫外吸光 度。

以清除率S对相应样品的浓度作图得到图16-18中的实验曲线，通过 非线性S回归拟合，得到相应的拟合曲线，从而可得清除率为50%时的样 品浓度，即半数清除率IC₅₀值。L1、L2和L3对DPPH·清除活性的IC₅₀值分别为1.58×10^-3M、1.31×10^-3M和2.31×10^-3M。

图13-15中在517nm波长处的最强峰均为未加任何本发明化合物时 DPPH·的吸收峰，由图13-18中曲线的变化趋势，我们可以看出随着样品 浓度的逐渐增大，DPPH·的吸收峰逐渐降低，体现了样品对DPPH·自由基 的清除活性不断增强。

由实验结果可以看出，本发明中得到的三种异黄酮酰胺衍生物对自由 基均具有良好的清除能力，三种化合物均是具有潜在开发价值的异黄酮衍 生物。