分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的PCR引物组

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法。 

背景技术

长豇豆（Vigna unguiculata ssp. sesquipedalis (L.) Verd.）隶属蝶形花亚科（Fabaceae）菜豆族（Trib. Phasoleae DC.）豇豆属（Vigna Savi），是我国重要的夏季豆类蔬菜之一。由于主要食用部分为嫩荚，荚壁肥厚、种籽小、条荚均匀一致成为长豇豆商品嫩荚最重要的经济指标之一。然而长豇豆生产实际中常常遇到嫩荚发育过程中由于荚壁和种子的不均衡发育，特别是种子发育过早过快导致嫩荚在种子着生处凸起而其它区域凹陷的现象，称之为鼓粒（附图1）。嫩荚鼓粒严重影响嫩荚的外观品质，降低商品价值。豇豆嫩荚鼓粒的实质是豆荚中种子发育过早过快，导致种子占整个豆荚的比例过高。育种和生产实践表明，不同豇豆品种嫩荚鼓粒程度不同，选育和应用不易鼓粒的品种对豇豆生产具有重要意义。 

种子和果实的发育尤其是膨大和营养积累主要受光合产物的分配与利用所调控。蔗糖是植物光合产物在植物组织间运输和分配的主要形式，它作为养分和信号分子在植物的生长发育中发挥着至关重要的作用。研究表明，豆类作物嫩荚荚壁和种子对蔗糖的吸收和利用存在着显著的竞争关系，蔗糖在荚壁和种子间的分配、积累与代谢决定着种子在豆荚中所占的比例。蔗糖代谢与分配，包括韧皮部蔗糖卸载、蔗糖转化为己糖，以及己糖积累的过程受到蔗糖合成酶、蔗糖转化酶及蔗糖、己糖膜转运蛋白等众多因素的调控。蔗糖在植物体内必须先经蔗糖合成酶和转化酶分解为己糖后，才能用于植物的生长和发育。 

生理学研究发现易鼓粒豇豆品种在嫩荚发育早期比不易鼓粒品种具有更高的种皮细胞壁蔗糖转化酶（CWIN）活性和较高的胚细胞分裂活性。随后，由于易鼓粒品种种皮CWIN活性和胚己糖/蔗糖比值的快速下降导致其胚更早结束细胞分裂期和更早进入细胞膨大期，这是造成易鼓粒品种胚细胞具有更大体积的重要原因。因此，种皮CWIN在长豇豆嫩荚鼓粒中发挥着重要的作用，可以作为耐鼓粒育种的靶标。 

发明内容

针对豇豆耐鼓粒育种常规方法中单纯依靠在田间进行豆荚鼓粒性的目测或工具测量鉴定所存在的主观性强、易受环境影响、耗时费力、需要大量土地和人力资源等缺陷，本发明的一个目的是分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的PCR引物组，本发明的另外一个目的是提供采用上述引物组分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法。本发明的方法具有准确、快捷的特点。 

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的PCR引物组，该引物组的序列为上游引物：5'- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3'；下游引物：5'- CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3'。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 

分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）豇豆基因组DNA的提取：将各待检测豇豆样品用CTAB法提取基因组DNA后，分别保存，备用；

2）基因组DNA的PCR扩增：将豇豆各样品基因组DNA 20 ng，分别加入各PCR管中，并在各管中依次加入PCR引物组至终浓度各0.2 μM，dNTP 至终浓度0.25 mM，MgCl2 至终浓度2.0 mM，PCR缓冲液至终浓度为1倍，并加入Taq DNA聚合酶 1单位，最后加无菌重蒸水补足体积至20 μl后，在94℃预变性2 min，94℃变性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸30sec，36个循环，72℃延伸5min下进行扩增，产物4℃保存；所述的引物组的序列为上游引物：5'- TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3'；下游引物：5'- CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3'；

3）酶切产物的凝胶电泳分析：扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，上进行电泳分离，然后银染进行显色，数码相机照相记录结果；所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶为丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1；

4）豇豆样品耐鼓粒性的鉴定：依据PCR产物在凝胶上条带的模式，凡扩增产物为 180bp 片段的材料即为含豇豆耐鼓粒基因型的材料，凡不能获得PCR扩增产物的材料即为含豇豆不耐鼓粒基因型的材料；

5）耐鼓粒表型复选：对上述经分子标记筛选的植株进行正常水肥管理，待植株开花期每株选10朵花蕾进行挂牌，挂牌10天后用游标卡尺测量每条嫩荚的鼓粒程度，以每株10个嫩荚的平均值作为该株的鼓粒性程度值，去除由于标记选择误差造成的假阳性，并选留耐鼓粒性得到改善且农艺性状好的后代新株系。 

本发明的有益效果是： 

1. 苗期鉴定，减少工作量，节约成本：本发明获得了根据豇豆细胞壁蔗糖转化酶基因上小片段缺失设计的PCR分子标记，该标记与豇豆耐鼓粒性关联，可应用于耐鼓粒基因的辅助转育检测；该方法具有检测方便、揭示多态性能力稳定、费用低廉等优点；用此标记可在苗期检测耐鼓粒基因的存在与否从而预测植株的耐鼓粒性，能在早期淘汰大量的不耐鼓粒分离后代，可以将后续移栽、管理、鉴定等的工作量压力减少到最低限度。常规育成豇豆品种需6-8年的周期，应用分子标记辅助选择育种，可以在同一时间内分析多个品种，对给定世代的材料只需在苗期取样1-2周时间就可以明确分离后代中目标基因的存在与否，使新品种的选育能在3-4年内完成，大大节省了人力和物力；

    2. 提高了选择的准确性：传统育种方法需要对杂交后代的耐鼓粒性进行田间或温室逐个鉴定，由于嫩荚鼓粒表型易受环境的影响，表型鉴定常有一定的误差，利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对嫩荚鼓粒表型的影响，准确性得到较大提高。本方法在苗期应用分子标记检测进行初筛后又对中选植株在成株期进行一次表型复查，进一步提高了选择的准确性。

本发明特点（优点或创新点）是： 

利用DNA序列小片段缺失与嫩荚鼓粒程度表型值间的显著关联开发分子标记。苗期采用分子标记选择，检测需DNA量少而方便快速，能在早期剔除大多数非目标株，大大减少了后续田间工作量。分子标记方法可以对大量种质资源及其杂交、回交后代进行分析，较快地从大量目标株中选出育种亲本材料，缩短育种的世代和时间。所有具有与“之121” 细胞壁蔗糖转化酶基因上小片段缺失位点完全相同的耐鼓粒豇豆品系都可以用引物P-VuCWIN进行标记辅助选择。

[0010] 

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步的详细说明，但应该理解本发明并不受以下内容所限止。 

实施例1：

特异区分豇豆耐鼓粒性的分子标记及基于分子标记的豇豆耐鼓粒性筛选方法，该方法包括以下的步骤：

（1）与豇豆耐鼓粒性关联的分子标记位点的筛选：用Qiagen公司的植物DNA小量提取试剂盒依说明书所述方法提取耐鼓粒程度各异的36份豇豆品系的DNA；利用引物5’- CACTTCAGAGGATGGTTGG -3’和  5’- CCTTTCTATCTTATCACTAAACTACC -3’扩增豇豆细胞壁蔗糖转化酶基因片段并进行常规测序。对从各品系扩增所获序列进行比对鉴定出长度为4bp的小片段多态性位点 P-VuCWIN；

（2）将上述P-CWIN位点的基因型数据与同上所述36份豇豆品系在历年田间调查中获得的鼓粒程度值用Tassel软件的MLM的混合线性模型进行关联分析，获得该位点与鼓粒性状的关联性P值为0.04，符合 P<0.05的统计阈值，表明该标记位点与豇豆耐鼓粒性显著关联。

（3）特异性检测引物P-VuCWIN的设计：根据扩增出的豇豆细胞壁蔗糖转化酶基因片段设计跨越Indel-CWIN位点的上下游引物，序列如下： 

上游引物：5'-TTTCCATGGTAAAATTTTTTACC -3'；

下游引物：5'-CCATTCCAAGAACGATTTGGCT -3'。

（4）特异引物的PCR扩增与电泳检测：扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1）上进行电泳分离，然后银染进行显色，数码相机照相记录结果。凡扩增产物为 180bp 片段的材料即为含豇豆耐鼓粒基因型的材料；凡含豇豆不耐鼓粒基因型的材料，由于其基因序列与上游引物3’端末尾4个碱基中的3个不匹配，因此均不能获得扩增产物。 

实施例2

利用标记Indel-CWIN辅助筛选“之121”和‘之豇282’耐鼓粒杂交后代

（1）不耐鼓粒主栽品种与耐鼓粒资源的杂交和回交：挑选饱满的非耐鼓粒轮回亲本（‘之豇282’，农艺性状好，易鼓粒）和耐鼓粒供体亲本（“之121”，嫩荚不易鼓粒，但农艺性状较差）播于大田。待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为F₁。次年将F₁（5粒左右即可）和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后收取种子，即为BC₁F₁。第三年将 BC₁F₁(30粒左右)和轮回亲本种子播于大田，待开花后进行杂交，荚成熟后按株系收取种子，即为BC₂F₁，每株系收20粒左右种子。

（2）苗期分子标记选择：将上步获得的600粒左右 BC₂F₁分离后代种子，分单株播种于大田并逐一挂牌。种子发芽20天后取叶片样0.1克，液氮中研磨成粉末，用CTAB法提取DNA。首先配制CTAB缓冲液：100 mL 1 mol·L^-1 Tris pH 7.5，140 mL 5 mol·L^-1 NaCl，20 mL 0.5 mol·L^-1 EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H₂O，20 g CTAB。DNA提取时取10mg的新鲜叶片放入研钵中，加入150 μL CTAB缓冲液，用钵杵轻轻研磨，然后再加入150 μL CTAB缓冲液混匀；65℃水浴40min；加入300 μL 24:1氯仿/异戊醇，上下混匀5 min，使样品与氯仿充分混和；13000 r·min^-1离心5min；取上清液150 μL，加入在-20℃预冷的异丙醇200 μL，轻轻上下颠倒混匀； 10000~12000 r·min^-1离心3~4 min，弃上清液；让异丙醇挥发干净，加入50~100 μL含RNase的ddH₂O溶解DNA；然后用1%的琼脂糖电泳检测。用本发明中的分子标记进行PCR扩增，反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl₂ 1.5微升, 2.5mM dNTPs 2微升, Taq酶(5单位/微升) 0.2微升, 模板DNA 10纳克，加水至25微升。PCR反应体系为DNA 94℃预变性 3min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸展30sec，循环35次，最后72℃延伸10min。在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增。扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺=29：1）上进行电泳分离，然后银染进行显色，数码相机照相记录结果。凡扩增产物为 180bp 片段的材料即为含豇豆耐鼓粒基因型的材料予以保留，凡不能获得扩增产物的材料即为含豇豆不耐鼓粒基因型的材料予以丢弃。 

（3）成株期表型复选：对经上步分子标记筛选的植株进行正常水肥管理。植株开花期每株选10朵花蕾进行挂牌，挂牌10天后用游标卡尺测量每条嫩荚的鼓粒程度，以每株10个嫩荚的平均值作为该株的鼓粒性程度值。结合各株农艺性状，选择耐鼓粒性强且农艺性状优异的单株，自交获得 BC₃F₂，即为理论上农艺性状较优、耐鼓粒性得到改善且基因型较为纯合的新品系。 

（4）结果与分析：通过对14株经分子标记分析提示所携细胞壁转化酶基因为耐鼓粒基因型的分离后代进行田间鼓粒程度的鉴定，按公式：鼓粒程度 (%) = (L1  L2)/L2 × 100%计算鼓粒程度；结果表明有11株鼓粒程度<30%为耐鼓粒，3株为不耐鼓粒，表明分子标记检测的准确率在78%以上。再通过耐鼓粒表型复选和农艺性状筛选以弥补标记辅助选择的误差，最后获得了1个耐鼓粒优良新品系，命名为“FK3-1”。  

序列表

<110>浙江省农业科学院

<120>分子标记辅助选育豇豆耐鼓粒品种的方法及其使用的PCR引物组

<160>2

<210>1

<211>29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

TTTCCATGGT AAAATTTTTT ACC 23

<210>2

<211>22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

CCATTCCAAG AACGATTTGG CT 22