一种诗琳通含笑离体培养再生植株方法

技术领域

本发明涉及一种的植株的离体培养再生植株方法，具体涉及一种诗琳通含笑的离体培养再生植株方法，属于生物离体组织培养育苗技术领域。 

背景技术

诗琳通含笑（学名：Michelia sirindhorniae (Noot. et Chal.) N. H. Xia et X. H. Zhangj）目前，国际上还普遍使用诗琳通木兰（Magnolia sirindhorniae Noot. & Chalermglin）是世界珍稀濒危木兰科品种之一，是极度濒危树种，原产地泰国，属常绿乔木，叶、花都非常芳香，可提炼名贵的植物香精。

诗琳通含笑为木兰科常绿大乔木，树干挺直，高可达30-35 m，花朵呈象牙白，单朵花可开2-3天，花期在6-7月。诗琳通含笑喜生于高湿的淡水沼泽林中，是木兰科大家族中唯一能在水中生长的树种，且生长快速，其木质优良名贵，泰国当地的皇宫贵族都以拥有诗琳通制作的高档家具或物品为荣。诗琳通含笑是泰国国王因为比较宠爱自己的女儿诗琳通公主，以其名字命名了这个泰国珍贵濒危木科珍惜树种。诗琳通含笑也因此被称为“泰国之宝”，并因其珍贵而稀少被世界自然保护联盟列为保护树种。2012年被中国（中山）南方绿化博览会评为形态最佳乔木金奖。诗琳通含笑是优良的用材和庭园观赏树种。

目前，木兰科植物的组培繁殖存在污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低的难题，而对于诗琳通含笑这类濒危树种的繁殖这些更是阻碍其繁殖技术发展的瓶颈。

发明内容

本发明目的在于提供一种诗琳通含笑的离体培养再生植株方法，以保存和抢救世界珍稀濒危木兰科品种，实现极度濒危木兰科树种的繁殖，为研究木兰科植物大树嫩枝进行组织培养，克服污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低等组培繁殖技术提供宝贵的学术研究经验。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：一种诗琳通含笑离体培养再生植株方法，包括以下步骤：

（1）采取外植体及其材料处理：采取生长健壮，无病虫害的诗琳通含笑7年生大树主杆上萌发出的嫩枝条，经保鲜处理后，低温带回实验室；所述材料处理是剪去嫩枝条上的叶片，用新洁尔灭清洗后用流水冲洗，切成2cm带1-2个腋芽的茎段；

（2）建立无菌繁殖体：将修剪好的茎段经培养、诱导，建立无菌繁殖体；

（3）增殖培养：将获得的无菌繁殖体接种于增殖培养基中培养；

（4）生根培养：将增殖培养后获得的丛生芽接种于生根培养基中培养；

（5）移植；

（6）幼苗培育。

步骤（2）所述建立无菌繁殖体的具体方法是：将修剪好的茎段在实验室里用0.1%的氯化汞消毒灭菌3-10分钟，再用无菌水洗3-4次，一瓶一段接种于初代培养基MS1上，在室温为20-30℃，每日光照8-12小时，光照强度800-2000LX的条件下培养15-30天，从叶腋萌发出绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，诱导出腋芽和不定芽并能够连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立。

步骤（3）所述增殖培养是：将无菌繁殖体接种于增殖培养基MS2中，放置在人为控制室温为20-30℃，每日光照8-12小时，光照强度800-2000LX的条件下培养15-30天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养15-30天后，芽丛增殖倍数2-4倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖。

步骤（4）所述生根培养是：当丛生芽高在15mm以上时，将芽从基部切下，分割成单株接种于生根培养基MS3中，放置在室温20-30℃，每日光照8-12小时，光照强度在1000-10000LX的条件下15-20天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中促根并炼苗20-30天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株。

步骤（5）所述移植是指将生根的组培瓶苗移栽到育苗杯中，完成瓶苗从人工控制培养条件给养到幼苗自养的过程，具体方法是：将瓶中的幼苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水。

所述基质是由泥炭土与椰糠按2:1的比例充分混合得到。

所述移植是将根系生长良好的瓶苗移入温室驯化后再进行，将开始出根的瓶苗直接移入温室驯化，瓶苗在温室里驯化、炼苗的过程中继续生长出根，可提前8-12天将驯化好的瓶苗进行移植。

步骤（6）所述幼苗培育是指瓶苗在移植后保持基质湿润，空气相对湿度在95%以上，防止叶片失水，之后逐步控制基质水分，相对湿度控制在80%-60%，控制培养温度25-28℃，荫棚用70%的遮光网遮光。

步骤（6）所述幼苗培育是在移植后第三天采用0.1%百菌清喷雾消毒灭菌，能有效防止病菌滋生，之后每隔10-15天喷雾一次；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次。

步骤（6）所述幼苗培育是移植后生长稳定了，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，移至大一号花盆培育大苗。

本发明所述MS1培养基配方为初代培养基，可按每1升含以下营养元素的药品种类和质量的比例，溶解于水中配制成初代培养基，PH调至5.8

加水至1000ml ，另外辅加：6-苄基腺嘌呤 0.5-5.0mg/l，萘乙酸 0.01-0.5mg/l。

本发明所述MS2 培养基配方为增殖培养基，可按每1升含以下营养元素的药品种类和质量的比例，溶解于水中配制成增殖培养基，PH调至5.8

加水至1000ml ，另外辅加：6-苄基腺嘌呤  0.2-2.0mg/l，3-吲哚丁酸0.01-0.5mg/l。

本发明所述MS3 培养基配方为诱导生根培养基，可按每1升含以下营养元素的药品种类和质量的比例，溶解于水中配制成生根培养基，PH调至5.8

加水至1000ml ，另外辅加：3-吲哚丁酸  0.2-2.0mg/l，萘乙酸0.05-0.8mg/l。

本发明的诗琳通含笑离体培养再生植株方法诱导率和成活率高，步骤简便可行，对保存和抢救世界珍稀濒危木兰科品种和繁殖极度濒危树种有着非常迫切和重要意义，为研究木兰科植物大树嫩枝进行组织培养，克服污染率高、褐化严重、诱导率低、移植成活率低等组培繁殖技术具有极其宝贵的学术研究价值。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1 采用以下步骤实现诗琳通含笑的离体培养再生植株：

（1）采取外植体及其材料处理：在广东省徐闻县神州木兰园内采取生长健壮，无病虫害的诗琳通含笑7年生大树主杆上萌发出的嫩枝条，经现场保鲜处理后，低温带回实验室；在实验室剪去嫩枝条上的叶片，用新洁尔灭清洗后用流水冲洗，切成2cm的带1-2个腋芽的茎段；

（2）建立无菌繁殖体：将修剪好的茎段在实验室里用0.1%的氯化汞消毒灭菌3分钟，再用无菌水洗4次，一瓶一段接种于初代培养基MS1上，在室温为30℃，每日光照8小时，光照强度2000LX的条件下培养15天，从叶腋萌发出绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，诱导出腋芽和不定芽并能够连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立；

（3）增殖培养：将无菌繁殖体接种于增殖培养基MS2中，放置在人为控制室温为30℃，每日光照8小时，光照强度1000LX的条件下培养28天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数4倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖；

（4）生根培养：当丛生芽高在15mm以上时，将芽从基部切下，分割成单株接种于生根培养基MS3中，放置在室温28℃，每日光照10小时，光照强度在1000LX的条件下15天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中促根并炼苗30天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株；

（5）移植：

a配制育苗基质：将泥炭土与椰糠按2:1的比例充分混合，将混合基质填装到荫棚内的育苗杯中备用；

b将开始出根的瓶苗直接移入温室驯化，驯化后将生根的组培瓶苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水；

（6）幼苗培育：移植后，进行水分、肥及防病菌的管理：

a水分管理：瓶苗在移植后保持基质湿润，空气相对湿度在95%，相对湿度控制在60%，控制培养温度28℃，荫棚用70%的遮光网遮光；

b肥及防病菌的管理：在移植后第三天采用0.1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔15天喷雾一次；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次；

c待生长稳定了，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，移至大一号花盆培育大苗。

实施例2 采用以下步骤实现诗琳通含笑的离体培养再生植株：

（1）采取外植体及其材料处理：在广东省徐闻县神州木兰园内采取生长健壮，无病虫害的诗琳通含笑7年生大树主杆上萌发出的嫩枝条，经现场保鲜处理后，低温带回实验室；在实验室剪去嫩枝条上的叶片，用新洁尔灭清洗后用流水冲洗，切成2cm的带1-2个腋芽的茎段；

（2）建立无菌繁殖体：将修剪好的茎段在实验室里用0.1%的氯化汞消毒灭菌10分钟，再用无菌水洗3次，一瓶一段接种于初代培养基MS1上，在室温为20℃，每日光照12小时，光照强度1000LX的条件下培养20天，从叶腋萌发出绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，诱导出腋芽和不定芽并能够连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立；

（3）增殖培养：将无菌繁殖体接种于增殖培养基MS2中，放置在人为控制室温为24℃，每日光照10小时，光照强度800LX的条件下培养30天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养30天后，芽丛增殖倍数3倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖；

（4）生根培养：当丛生芽高在15mm以上时，将芽从基部切下，分割成单株接种于生根培养基MS3中，放置在室温26℃，每日光照8小时，光照强度在20000LX的条件下17天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中促根并炼苗28天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株；

（5）移植：

a配制育苗基质：将泥炭土与椰糠按2:1的比例充分混合，将混合基质填装到荫棚内的育苗杯中备用；

b将开始出根的瓶苗直接移入温室驯化，驯化后将生根的组培瓶苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水；

（6）幼苗培育：移植后，进行水分、肥及防病菌的管理：

a水分管理：瓶苗在移植后保持基质湿润，空气相对湿度在95%，相对湿度控制在88%，控制培养温度25℃，荫棚用70%的遮光网遮光；

b肥及防病菌的管理：在移植后第三天采用0.1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔15天喷雾一次；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次；

c待生长稳定了，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，移至大一号花盆培育大苗。

实施例3采用以下步骤实现诗琳通含笑的离体培养再生植株：

（1）采取外植体及其材料处理：在广东省徐闻县神州木兰园内采取生长健壮，无病虫害的诗琳通含笑7年生大树主杆上萌发出的嫩枝条，经现场保鲜处理后，低温带回实验室；在实验室剪去嫩枝条上的叶片，用新洁尔灭清洗后用流水冲洗，切成2cm的带1-2个腋芽的茎段；

（2）建立无菌繁殖体：将修剪好的茎段在实验室里用0.1%的氯化汞消毒灭菌5分钟，再用无菌水洗3次，一瓶一段接种于初代培养基MS1上，在室温为26℃，每日光照10小时，光照强度800LX的条件下培养30天，从叶腋萌发出绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，诱导出腋芽和不定芽并能够连续生长繁殖，完成无菌繁殖体的建立；

（3）增殖培养：将无菌繁殖体接种于增殖培养基MS2中，放置在人为控制室温为30℃，每日光照12小时，光照强度1200LX的条件下培养15天，从叶腋萌发出无菌绿芽，剪取绿芽接种于增殖培养基MS2上，芽丛增殖，培养22天后，芽丛增殖倍数4倍，在无菌条件下再将其分割转接，经过反复继代培养扩大繁殖；

（4）生根培养：当丛生芽高在15mm以上时，将芽从基部切下，分割成单株接种于生根培养基MS3中，放置在室温26℃，每日光照8小时，光照强度在4000LX的条件下20天，苗开始出根，再放置到75%遮荫条件下温室中促根并炼苗20天，生根瓶苗叶片展开，茎芽生长健壮，形成完整植株；

（5）移植：

a配制育苗基质：将泥炭土与椰糠按2:1的比例充分混合，将混合基质填装到荫棚内的育苗杯中备用；

b将开始出根的瓶苗直接移入温室驯化，驯化后将生根的组培瓶苗小心取出，洗净黏在苗上的培养基，移植到填满基质的育苗杯中，每一杯种植一株苗，移植覆土深度刚好盖住根系，一般不超过1厘米，压紧基质，使苗根和基质紧密接触，移植完成后淋透定苗水；

（6）幼苗培育：移植后，进行水分、肥及防病菌的管理：

a水分管理：瓶苗在移植后保持基质湿润，空气相对湿度在98%，相对湿度控制在80%，控制培养温度28℃，荫棚用70%的遮光网遮光；

b肥及防病菌的管理：在移植后第三天采用0.1%百菌清喷雾消毒灭菌，之后每隔15天喷雾一次；当有新芽萌发、新根长出时，喷施1500倍营养液，根据幼苗生长状况，每隔半个月喷施一次；

c待生长稳定了，长出新芽和新根后，逐步增加光照强度，直到进行全光照常规管理，幼苗培育至15厘米高时，移至大一号花盆培育大苗。