昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分的提取方法和抗菌活性筛选方法

技术领域

本发明涉及一种昆虫和节肢动物体内脂溶性提取工艺,特别是涉及一 种在提取昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分过程中，选择合适的溶剂和 适宜的温度等因素，而不影响其有效成分的结构和活性。

背景技术

昆虫天然产物的研究，是近些年来天然产物领域研究的新方向。相对 于研究原料的种类丰富，但产量较贫瘠；另外昆虫体内成分属微量，但可 能结构复杂；虫体在不同虫龄期，次生代谢物作为物质基础，可能出现的 结构变化等等，综上昆虫特点，当前制约昆虫天然产物研究的瓶颈，被认 为主要是昆虫和节肢动物体内的有效成分的提取方法的建立，以及对分离 纯化出的活性成分的生物学评价。鉴于对昆虫天然产物的研究，国内外仍 在探索阶段。我们先前建立的“两段溶剂提取法”（中国发明专利：一种昆 虫或节肢动物次生代谢物的提取方法中国发明专利201110249570.0），可 有效地对极性的活性成分进行分离纯化及结构鉴定研究。非极性的二氯甲 烷脂溶性提取物，抗菌活性测定受到溶剂二氯甲烷和昆虫大量虫蜡成分的 影响。

通过我们的研究发现，昆虫体内存在着活性小分子天然化合物具有生 物学多样性活性，而且多为极性化合物。非极性的脂溶性化合物，如三萜 类、酯类等化合物多呈微量，通常与昆虫的虫蜡部分共存。而这些虫蜡多 为油脂或脂肪酸成分，它们又是昆虫脂溶性成分的主要和大量物质，自身 没有生物活性，而且影响其它活性脂溶性成分的提取，因此为获取这些油 脂成分中可能存在着的微量的活性化合物，必须进行预处理除去大量的昆 虫的油脂。

本发明旨在解决昆虫和节肢动物体内脂溶性提取物的除油工艺 问题，为分离纯化其中微量天然有效化合物成分，并进行生物活性评价等 奠定基础。这个前处理过程中，必须保证对这些微量有效活性成分的不丢 失，进一步还要考虑，在提取过程中由于采用的溶剂法，溶剂和温度的因 素，影响到它们的结构和活性的改变，因此这个提取技术是本发明的关键。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新的昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成 分的提取方法和抗菌活性筛选方法，所要解决的技术问题是解决昆虫和节 肢动物体内脂溶性提取物的除油工艺问题，为分离纯化其中微量天然有效 化合物成分，并进行生物活性评价等奠定基础。这个前处理过程中，必须 保证对这些微量有效活性成分的不丢失，进一步还要考虑，在提取过程中 由于采用的溶剂法，溶剂和温度的因素，不会影响到它们的结构和活性 的改变，非常适于实用。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据 本发明提出的其包含以下步骤：取干燥后的昆虫或节肢动物体虫体，在室 温下用二氯甲烷浸提2次，每次浸提48-72小时并辅以超声操作；浸提液 经真空抽滤，合并滤液，减压回收溶剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏；将所得 的粗浸膏置于蒸发皿中，在40-50℃条件下，水浴加热6-8h，至浸膏中的 二氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1:2-4的体积混合，然后转移到 分液漏斗中，加入石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相，按照上述 操作再次萃取1-2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至水浴 上约40-50℃烘干，得到去除虫蜡的昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分。

本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。

前述的昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分的提取方法,其中所述的 昆虫为黑蚂蚁或五谷虫；所述的节肢动物体为蝼蛄或全蝎。

本发明的目的及解决其技术问题还采用以下技术方案来实现。依据本 发明提出的将权利要求1-2所述的昆虫和节肢动物体浸膏加入70%的甲 醇，分别配成15mg/ml和25mg/ml的供试品；抗菌活性筛选分别以革兰氏 阳性菌和革兰氏阴性菌菌株为研究对象，以相应的抗生素为阳性对照，70% 的甲醇为空白对照，抗菌活性强度均以平板法测定的抑菌圈直径大小衡量 对比。

借由上述技术方案，本发明昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分的提 取方法和抗菌活性筛选方法至少具有下列优点及有益效果：本发明的整个 工艺除油率高达97%以上，为昆虫脂溶性提取物的抗菌活性研究及进一步的 分离纯化奠定了技术基础。该发明解决了之前昆虫脂溶性提取物中因含油 太多，造成分离纯化不便等诸多问题，同时除油后的脂溶性提取物能溶于 70%的甲醇，70%的甲醇本身无抑菌活性，便于同昆虫的70%甲醇提取物进行 抗菌活性对照。该方法对昆虫脂溶性部位中的有效成分的分离和鉴定提供 了方便和技术可行性。

综上所述，本发明其包含取干燥后的昆虫或节肢动物体虫体，在室温 下用二氯甲烷浸提2次；浸提液经真空抽滤，合并滤液，减压回收溶 剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏；将所得的粗浸膏置于蒸发皿中，在40-50℃条 件下，水浴加热6-8h，再将粗浸膏与蒸馏水按1:2-4的体积混合，然后转 移到分液漏斗中，经萃取静置分层，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸 发皿中至水浴上约40-50℃烘干，得去除虫蜡的昆虫和节肢动物体中脂溶性 有效成分。抗菌活性筛选以革兰氏阳性菌和阴性菌菌株等为研究对象，以 抗生素为阳性对照，70%的甲醇为空白对照，抗菌活性强度均以平板法测定 的抑菌圈直径大小衡量对比。本发明在技术上有显著的进步，并具有明显 的积极效果,诚为一新颖、进步、实用的新设计。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的 技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和 其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，详细说明 如下。

附图说明

无

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功 效,以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的昆虫和节肢动物体中脂溶性 有效成分的提取方法和抗菌活性筛选方法其具体实施方式、提取方法、步 骤、特征及其功效，详细说明如后。

本发明为了保证在提取分离过程中，有效成分的不丢失和活性不受影 响，我们对昆虫的脂溶性成分，根据相似相容原理，我们采取常用的二氯 甲烷溶剂提取法。这样一方面可以保证昆虫或节肢动物体内的所有脂溶性 成分，包括油脂尽可能的被全部提取出来；另一方面考虑到只有二氯甲烷 不仅脂溶性最强，而且沸点又低（减压下40℃以下，常压至水浴40-50℃ 下烘干），完全可以将溶剂全部从提取物中除净。这样才能保证下一步抗菌 活性的筛选，没有溶剂的影响的可靠性。另外通常60℃以下，所有生物学 活性不受影响。进一步昆虫和节肢动物体中脂溶性提取物中，含有的大量 虫蜡或油脂用石油醚萃取法除去，得到的无油脂的部位成为昆虫和节肢动 物体中脂溶性有效成分。

整个发明技术可划分为三个关键步骤如下：

1.昆虫或节肢动物体二氯甲烷提取物的制备：

称取干燥后的昆虫虫体或0.5kg，在室温下用二氯甲烷浸提2次，每 次2天（辅以超声操作）。浸提液真空抽滤，合并滤液，减压下回收溶 剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏。

2.二氯甲烷脂溶性昆虫提取物的除油的方法：

将所得的粗浸膏置蒸发皿中，水浴加热（40-50℃）6h，至浸膏中的 二氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1：2的体积混合，然后转移到分 液漏斗中，加入适量石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相按照上述 操作再次萃取2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至水浴40-50 ℃下烘干，得到去除虫蜡的脂溶性微量成分的部位，为浸膏状，以下简称 昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分。

3.昆虫和节肢动物体中脂溶性有效成分的抗菌活性筛选方法

称取60mg的浸膏加70%的甲醇，分别配成15mg/ml和25mg/ml的供试 品，作抗菌活性试验筛选。抗菌活性筛选分别以革兰氏阳性菌和革兰氏阴 性菌菌株为研究对象，以相应抗生素为阳性对照，70%的甲醇为空白对 照，抗菌活性强度均以平板法测定的抑菌圈直径大小衡量对比。

本发明的整个工艺除油率高达97%以上，为昆虫脂溶性提取物的抗菌活 性研究及进一步的分离纯化奠定了技术基础。该发明解决了之前昆虫脂溶 性提取物中因含油太多，造成分离纯化不便等诸多问题，同时除油后的脂 溶性提取物能溶于70%的甲醇，70%的甲醇本身无抑菌活性，便于同昆虫的 70%甲醇提取物进行抗菌活性对照。该方法对昆虫脂溶性部位中的有效成分 的分离和鉴定提供了方便和技术可行性。

实施例1.

黑蚂蚁脂溶性提取物的除油工艺及有效成分的供试品的制备：

称取干燥后的黑蚂蚁0.5-0.8kg，在室温下用二氯甲烷浸提2次，每次 2-3天（辅以超声操作）。浸提液真空抽滤，合并滤液，减压下回收溶 剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏。

将所得的粗浸膏置蒸发皿中，水浴加热（40-50℃）6-8h，至浸膏中的 二氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1：2-4的体积混合，然后转移到 分液漏斗中，加入适量石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相，按照 上述操作再次萃,1-2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至水 浴上约60℃烘干，得黑蚂蚁脂溶性提取物浸膏为有效成分。

称取60mg的浸膏（有效成分）加70%的甲醇，分别配成15mg/ml和 25mg/ml的供试品，作抗菌活性试验筛选。其抗菌活性结果见表1中。

实施例2：

蝼蛄脂溶性提取物的除油工艺及有效成分的供试品的制备：

称取干燥后的蝼蛄虫体0.5-0.8kg，在室温下用二氯甲烷浸提2 次，每次2-3天（辅以超声操作）。浸提液真空抽滤，合并滤液，减压下回 收溶剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏。

将所得的粗浸膏置蒸发皿中，水浴加热（50℃）6-8h，至浸膏中的二 氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1：2-4的体积混合，然后转移到分 液漏斗中，加入适量石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相，按照上 述操作再次萃,1-2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至水浴 上约60℃烘干，得蝼蛄脂溶性提取物浸膏为有效成分.

称取60mg的浸膏加70%的甲醇，分别配成15mg/ml和25mg/ml的供试 品，作抗菌活性试验筛选。其抗菌活性结果见表1中.

实施例3：

五谷虫脂溶性提取物的除油工艺及有效成分的供试品的制备：

称取干燥后的五谷虫0.5-0.8kg，在室温下用二氯甲烷浸提2次，每 次2-3天（辅以超声操作）。浸提液真空抽滤，合并滤液，减压下回收 溶剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏。

将所得的粗浸膏置蒸发皿中，水浴加热（40-60℃）6-8h，至浸膏中的 二氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1：2-4的体积混合，然后转移到 分液漏斗中，加入适量石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相，按照 上述操作再次萃取1-2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至 水浴上约60℃烘干，得五谷虫脂溶性提取物浸膏为有效成分。

称取60mg的浸膏加70%的甲醇，分别配成15mg/ml和25mg/ml的供试 品，作抗菌活性试验筛选。

上述制备的各种昆虫脂溶性提取物有效成分的不同浓度的供试品，为 抗菌活性筛选的受试样品，其抗菌活性结果见表1中.

实施例4：

全蝎脂溶性提取物的除油工艺及有效成分的供试品的制备：

称取干燥后的全蝎0.5-0.8kg，在室温下用二氯甲烷浸提2次，每次 2-3天（辅以超声操作）。浸提液真空抽滤，合并滤液，减压下回收 溶剂，得昆虫二氯甲烷粗浸膏。

将所得的粗浸膏置蒸发皿中，水浴加热（55℃）6-8h，至浸膏中的二 氯甲烷挥发完全；将粗浸膏与蒸馏水按1：2-4的体积混合，然后转移到分 液漏斗中，加入适量石油醚震摇萃取，静置后分层，取下层水相，按照上 述操作再次萃,1-2次，回收水相；将水相浓缩后，转移到蒸发皿中至水浴 上约60℃烘干，得五谷虫脂溶性提取物浸膏为有效成分。

称取60mg的浸膏加70%的甲醇，分别配成15mg/ml和25mg/ml的供试 品，作抗菌活性试验筛选。

上述制备的各种昆虫和脂溶性提取物有效成分的不同浓度的供试 品，为抗菌活性筛选的受试样品，其抗菌活性结果见表1中。

从表1.的活性筛选中可以看出，两种昆虫（黑蚂蚁和五谷虫）的脂溶 性提取物和两种节肢动物体中（蝼蛄和全蝎）脂溶性有效成分，经过活性 筛选只有黑蚂蚁的脂溶性提取物中的有效成分对革兰氏阳性菌和革兰氏阴 性菌均有抗菌活性，其它昆虫和节肢动物脂溶性提取物有效成分均没有任 何抗菌的活性。该结果黑蚂蚁，将成为进一步的昆虫抗菌活性成分的分离 与鉴定研究的对象。

表1.四种昆虫二氯甲烷提取物有效成分对受试菌种的抑菌圈

Tab.3-3The diameter of antibacterial rings of CH2Cl2 extraction  from eight kinds of insects

表中：

B.subtilis,（枯草芽孢杆菌）;SA,（金黄色葡萄球菌）.

E.coli,（大肠杆菌）;P.aeruginosa,（铜绿假单胞菌）.

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式 上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发 明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利 用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但 凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。