一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架及其制备方法。

背景技术

对于血管组织工程而言，生物可降解的支架起着支持并诱导细胞生长和繁衍、规 定再生组织形状和大小，并最终和机体组织结合在一起的作用，与细胞和生长因子一 起成为组织工程的三大要素。目前，虽然有许多采用不同材料支架的血管组织工程研 究报道，但是这些支架的结构和功能与天然血管的细胞外基质相比差距甚远，且至今 也未见与天然血管有相似结构和功能的组织工程血管支架的报道。

血管壁是由外膜、中膜和内膜所组成，其中的中膜是由高度取向的血管平滑肌细 胞层组成，而在这些细胞层里平滑肌细胞和细胞外基质沿圆周取向排列，起着血管所 呈现的结构支持作用。因此，要形成与天然血管中膜具有相似结构和功能的组织工程 血管，就必须要求支架能提供类似天然血管中膜对平滑肌细胞所提供的仿生结构和微 环境，使血管平滑肌细胞和细胞外基质在这样的支架上沿圆周取向排列，早期能够保 持合成表型，使细胞快速生长和繁衍；而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换， 从而使血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。

目前一般采用的仿生方法就是先制备表面呈不同取向角度排列结构的二维支架， 然后再将其卷绕成多层的管状结构，以此得到不同圆形层内具有不同斜度螺旋结构的 管形支架。但目前研究报道的均是具有单一微米取向结构或纳米结构表面拓扑形貌的 聚内酯二维支架。这种单一的表面拓扑形貌支架对于控制血管平滑肌细胞的粘附、生 长、空间组织和功能并不很理想。

此外，理想的支架应具备与天然组织相似的能分泌生长因子的功能。所以如果将 与中膜再生相关生长因子一起荷载到具有多重表面拓扑形貌的多孔聚内酯类支架上， 使它们按一定的时间和浓度释放以调控血管平滑肌细胞的增殖和分化，就有望成为具 有天然血管壁中血管平滑肌细胞的生物化学和物理信号微环境功能的仿生血管支架。

由于聚乙交酯(PLA)、聚丙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)以及它们的共聚物等聚内 酯聚合物具有良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率已获得我国和美 国等国家FDA的认证，成为可以应用于制备植入体内的医疗制品。因此用聚内酯类生物 降解高分子作为组织工程化血管支架的基材可以兼具安全性和有效性，具有应用前景。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种仿天然血管中膜层结构与功能的 组织工程支架及其制备方法。

本发明所提供的组织工程支架是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)制备载生长因子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒；或制备同时载生长 因子A和B的纳米颗粒；所述纳米颗粒为可降解纳米颗粒；

2)配制生物可降解聚合物的溶液，并向所述溶液中加入步骤1)制备的载生长因 子A的纳米颗粒和载生长因子B的纳米颗粒或同时载生长因子A和B的纳米颗粒，搅 拌均匀后浇铸到刻有平行排列沟槽的模具中，冷冻干燥去除溶剂，得到荷载生长因子 A和B且表面具有平行排列的沟槽的膜状多孔支架；

3)对所述膜状多孔支架进行表面处理，使支架表面具有纳米拓扑结构；

4)在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C，得到同时荷载生长因子 A\B\C、表面既具平行排列微米级沟槽结构、又具纳米拓扑结构的多孔结构的膜状物， 即所述仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架。

上述方法，步骤1)中载生长因子纳米颗粒的制备方法具体如下：将纳米颗粒浸 泡在生长因子A和/或B溶液中一段时间后，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载生长因 子的纳米颗粒，载生长因子A和/或B的纳米颗粒中生长因子A或B的质量含量为 0.005-2.0％。

所述纳米颗粒具体可选自下述任意一种：明胶纳米颗粒、胶原纳米颗粒和二氧化 硅纳米颗粒。

所述明胶纳米颗粒和胶原纳米颗粒的粒径均为400-1000纳米。其由乳液-冷凝法 制备，采用的乳化温度为35-45℃，搅拌速率为4-6千转/分钟，乳化时间为2-10 分钟。

所述二氧化硅纳米颗粒的粒径为30-300纳米，其由溶胶-凝胶法制备得到。

步骤2)中生物可降解聚合物与载生长因子的纳米颗粒质量比为0.8-20。

本发明中所述生长因子A、生长因子B、生长因子C不相同但均为可促进血管中膜 再生的生长因子。具体可选自下述任意一种：bFGF、PDGF-BB和TGF-β1。

生长因子溶液的浓度可为50ng/ml-500μg/ml，浸泡时间为5-300分钟。

上述方法，步骤2)中所述生物可降解聚合物为聚内酯。具体可选自下述任意一 种单体形成的均聚物和至少两种单体形成的共聚物中的任意一种：乙交酯(GA)、L-乳 酸(LLA)、DL-乳酸(DLLA)和己内酯(CL)。

所述生物可降解聚合物的溶液的浓度可为2.0-9.0g/100ml。

所述生物可降解聚合物的溶液中的溶剂是由第一溶剂和第二溶剂组成的混合溶 剂；其中，第一溶剂选自下述至少一种：二氧六环、苯和四氢呋喃，第二溶剂选自下 述至少一种：丙酮、三氯甲烷、乙醇和水；所述混合溶剂中所述第二溶剂的体积含量 为2.0-10.0％。

步骤2)中所述刻有平行排列沟槽的模具中沟槽的宽为10-200微米，沟槽深为2 -50微米，相邻沟槽的间距为2-30微米。

上述方法，步骤3)中对所述膜状多孔支架进行表面处理的方法可选自下述至少 一种：等离子体处理法、水解处理法和等离子体处理-生物大分子锚定法。

等离子体处理-生物大分子锚定法是先对支架进行等离子体处理，然后再在支架 上锚定胶原、阳离子化明胶或层粘连蛋白等生物大分子的方法。

所述等离子体处理-生物大分子锚定法中所采用的生物大分子选自下述任意一 种：胶原、阳离子化明胶和层粘连蛋白。

在步骤3)处理后的膜状多孔支架上荷载生长因子C的方法可采用等离子体处理- 生长因子锚定法或大分子自组装法。

本发明所制备的仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架中生长因子A、生 长因子B和生长因子C的质量含量为0.001-0.5％。

所述支架表面平行排列沟槽的宽为10-200微米，沟槽深为2-50微米，相邻沟 槽的间距为2-30微米。所述支架为膜状多孔支架，其厚度为50-1000微米。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

1、本发明同时模拟天然血管中膜组织的结构与功能，构建兼具多孔结构、平行排 列微米级沟槽结构和纳米表面拓扑结构多重表面拓扑形貌，并且能够在一定时间以一 定的浓度释放出多种保持生物活性的生长因子，符合血管组织工程要求的支架。

2、本发明的组织工程支架由合成的可生物降解的聚内酯聚合物制备，聚内酯具有 良好的生物相容性、良好的机械性能和可调的降解速率，实现了支架的力学性能、降 解时间的可控性。

3、本发明在支架上以不同的方法同时荷载多种生长因子，使各种生长因子以一定 的浓度和时间保持活性释放。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料， 如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供的仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架的制备方法，步骤如 下：1)载生长因子纳米颗粒的制备：将纳米粒子浸泡在生长因子A和/或B溶液中一 段时间后，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载生长因子的纳米颗粒。

制备纳米粒的材料为明胶、胶原或二氧化硅。

明胶纳米粒子、胶原纳米粒子由乳液-冷凝法制备，粒径为400-1000纳米。采 用的乳化温度为40℃，搅拌速率为4-6千转/分钟，乳化时间为2-10分钟。

二氧化硅纳米粒子由溶胶-凝胶法制备，粒径为30-300纳米。

所述生长因子A、生长因子B和生长因子C各不相同，均可选自下述任意一种： bFGF、PDGF-BB和TGF-β1。

生长因子溶液的浓度可为50ng/ml-500μg/ml，浸泡时间为5-300分钟。

2)仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架制备：配制一定浓度的生物可降 解聚合物溶液，与载生长因子A和B纳米颗粒搅拌均匀后浇铸到刻有平行排列沟槽的 模具表面，通过冷冻行燥去除溶剂，进一步对支架进行表面处理后，再将支架浸泡在 生长因子C溶液中一段时间后，冷冻干燥得到具有仿天然血管中膜结构与功能的组织 工程支架。

所述生物可降解聚合物为生物可降解的聚内酯，具体可以为聚乙交酯(PGA)、聚 L-乳酸(PLLA)、聚DL-乳酸(PDLLA)、聚己内酯(PCL)，以及它们的共聚物。

所述聚合物溶液的浓度为2.0-9.0％(w/v)，溶剂则是由第一溶剂和第二溶剂组 成的混合溶剂，其中第一溶剂为二氧六环、苯、四氢呋喃或它们的混合物、第二溶剂 为丙酮、三氯甲烷、乙醇或水；混合溶剂中第二溶剂的含量为2.0-10.0％(v/v)。

所述表面处理的方法选自下述至少一种：等离子体处理技术、水解处理技术，或 等离子体处理-生物大分子锚定技术。

所述等离子体处理-生物大分子锚定表面处理技术中所采用的生物大分子具体是 胶原、阳离子化明胶或层粘连蛋白。

在这种仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架上培养的牛大动脉平滑肌细 胞，沿着沟槽方向生长，在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍， 而后期能使合成表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止 新内膜的形成。

在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通 过任何合适的方式进行组合。下列实施例旨在进一步描述本发明方法的各个方面。

实施例1、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架

第一步：载生长因子bFGF明胶颗粒的制备：5ml的质量浓度为10％明胶水溶液 滴加入175ml的橄榄油中，40℃和5千转/分钟下搅拌10分钟，然后将乳液冷却至室 温，持续搅拌30分钟，加入100ml丙酮，在5千转/分钟下继续搅拌1h，生成颗粒分 别用丙酮和4℃异丙醇洗涤后，离心收集。将得到的颗粒放入包含0.1％吐温60的2％ 戊二醛溶液中，4℃交联12小时。然后将颗粒放入100ml包含0.1％吐温60的10mM 氨基酸溶液中，37℃下搅拌30分钟。用质量浓度0.1％吐温60溶液洗涤后，离心冷冻 干燥，得到粒径为0.6-20微米的明胶颗粒。选取100mg粒径为600-1000纳米明胶颗 粒浸泡在500μl浓度为200μg/ml的bFGF溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得 到载bFGF的明胶颗粒，负载在100mg明胶颗粒上的bFGF为85.81μg。

第二步：载生长因子TGF-β1二氧化硅纳米颗粒制备：将200mg的十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB)、96ml的水和0.7ml的2M浓度的NaOH水溶液在80℃下混合， 保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80℃下600转/分搅拌下维持2 小时，停止加热并恢复至室温，离心收集生成的二氧化硅粒子，甲醇洗涤。将上述获 得的二氧化硅粒子，加入由25mL甲醇和1mL浓盐酸(质量浓度37％)组成的溶液 中，加热回流10h，停止加热并恢复至室温。离心收集，甲醇洗涤，得到的二氧化硅 的平均粒径为160nm。取100mg二氧化硅浸泡在500μl浓度为180μg/ml的TGF-β1 溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF-β1的二氧化硅纳米颗粒，负载 在100mg二氧化硅颗粒上的TGF-β1为81.60μg。

第三步：将PLGA(L-LA/GA＝70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配制成质量 浓度为5％的二氧六环溶液640μl，并加入30μl水混合均匀，加入载bFGF的纳米明 胶颗粒8mg和载TGF-β1的二氧化硅纳米粒子8mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3×3cm²表面具有平行排列沟槽的聚二甲基硅氧烷(PDMS)上，沟宽为50微米，沟槽深度5微 米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的 多孔膜，膜厚度为100微米。

第四步：在0.25M NaOH/乙醇(V/V＝1/1)混合溶剂中，20℃下，浸泡薄膜2小时， 用水洗涤并冷冻干燥后，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的 多孔膜状物。

第五步：在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，然后浸泡在2ml浓度 为30μg/ml的PDGF-BB中，1小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中 膜层结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(47mg)。实验样中bFGF、TGF-β1 及PDGF-BB的含量分别为6.87μg、6.48μg和33.60μg。

对照样1的制备：将PLGA(L-LA/GA＝70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配 制成浓度为5％三氯甲烷溶液640μl，浇铸到光滑的大小为3×3cm²四氟乙烯槽中，室 温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样1。

对照样2的制备：将PLGA(L-LA/GA＝70/30，mol/mol)(数均分子量为12万)配 制成浓度为5％二氧六环溶液640μl，并加入30μl水混合均匀，浇铸到3×3cm²PDMS表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间 距为5微米上，冷冻干燥使溶剂挥发，然后在0.25M NaOH/乙醇(V/V＝1/1)混合溶剂 中，20℃下，浸泡薄膜2小时，用水洗涤并在室温下干燥后，在功率为50W，氧气氛 下等离子体处理10分钟，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的 多孔膜状物，作为对照样2。

释放实验：支架(实验样)浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里， 每隔一定时间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果 显示：荷载在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均 能持续释放，bFGF能持续释放21天，释放量为79％；TGF-β1能持续释放28天， 释放量为81％；PDGF-BB能持续释放5天，释放量为85％。

体外细胞培养：将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样 上。实验结果显示：在对照样1上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；牛大 动脉平滑肌细胞在实验样上培养3天后，细胞增殖明显大于在两种对照样上的增殖， 细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚 集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌 球蛋白重链(SM-MHC)和h1-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究 结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑 肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表 型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。

实施例2、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架

第一步：按照实施例1的方法制备载生长因子bFGF明胶颗粒。

第二步：按照实施例1的方法制备载生长因子TGF-β1二氧化硅纳米颗粒。

第三步：将PGLC(GA/L-LA/CL＝63/27/10，mol/mol/mol)(数均分子量为8万)， 配制成浓度为6％四氢呋喃溶液630μl，并加入40μl三氯甲烷混合均匀，加入载bFGF 的纳米明胶颗粒8mg、和TGF-β1的二氧化硅纳米粒子8mg，搅拌均匀，浇铸到大小 为3×3cm2表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为80微米，沟槽深度5微米， 槽间距为10微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔 膜，膜厚度为80微米。

第四步：在功率为50W，氧气氛下等离子体处理10分钟，再浸泡在2ml浓度为 30μg/ml的PDGF-BB中，1小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜层 结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(50mg)。实验样中bFGF、TGF-β1及 PDGF-BB的含量分别为6.87μg、6.48μg和33.60μg。

对照样1的制备：将PGLC(GA/L-LA/CL＝63/27/10，mol/mol/mol)(数均分子量 为8万)配制成浓度为6％三氯甲烷630μl，浇铸到光滑的大小为3×3cm²四氟乙烯槽 中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样1。

对照样2的制备：将PGLC(GA/L-LA/CL＝63/27/10)(摩尔比，数均分子量为8万) 配制成浓度为6％四氢呋喃溶液630μl，并加入40μl三氯甲烷混合均匀，浇铸到3 ×3cm²PDMS表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为80微米，沟槽深度5微米， 槽间距为10微米，冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功率为50W，氧气氛下等离子体处 理10分钟，得到表面既具平行排列的微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物， 作为对照样2。

释放实验：支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时 间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：荷载 在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释 放，bFGF能持续释放23天，释放量为76％；TGF-β1能持续释放30天，释放量为72％； PDGF-BB能持续释放7天，释放量为75％。

体外细胞培养：将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样 上。实验结果显示：在对照样1上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养 3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，并 且细胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和 聚集。培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌 肌球蛋白重链(SM-MHC)和h1-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研 究结果表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平 滑肌细胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成 表型的细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。 实施例3、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架

第一步：载生长因子bFGF胶原颗粒的制备：5ml的质量浓度为12％胶原溶液(溶 剂为0.1N的乙酸水溶液)滴加入185ml的橄榄油中，40℃和5千转/分钟下搅拌10分 钟，然后将乳液冷却至室温，持续搅拌30分钟，加入100ml丙酮，在5千转/分钟下 继续搅拌1h。生成颗粒分别用丙酮和4℃异丙醇洗涤后，离心收集。将得到的颗粒放 入包含0.1％吐温60的2％戊二醛溶液中，4℃交联12小时。然后将颗粒放入100ml 包含0.1％吐温60的10mM氨基酸溶液中，37℃下搅拌30分钟。用0.1％吐温60溶液 洗涤后，离心冷冻干燥，得到粒径为0.4-6微米的胶原颗粒。选取100mg粒径为400 -1000纳米胶原颗粒浸泡在500μl浓度为200μg/ml的bFGF溶液中2小时，离心洗涤 并冷冻干燥后，得到载bFGF的胶原颗粒，负载在100mg胶原颗粒上的bFGF为 87.73μg。

第二步：载生长因子TGF-β1二氧化硅纳米颗粒制备：将200mg的十六烷基三甲 基溴化铵(CTAB)、96ml的水和0.7ml的2M浓度的NaOH水溶液在80℃下混合， 保持30min，然后加入0.6ml的正硅酸乙酯(TEOS)，80℃下2千转/分搅拌下维持2 小时，停止加热并恢复至室温，离心收集生成的介孔二氧化硅粒子，甲醇洗涤。将上 述获得的粒子，加入由25mL甲醇和1mL浓盐酸(质量浓度37％)组成的溶液中， 加热回流10h，停止加热并恢复至室温。离心收集，甲醇洗涤，得到的二氧化硅的平 均粒径为50nm。取100mg二氧化硅浸泡在500μl浓度为180μg/ml的TGF-β1溶液中 2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF-β1的二氧化硅纳米颗粒，负载在100mg 二氧化硅颗粒上的TGF-β1为85.61μg。

第三步：将PGC(GA/CL＝50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成浓度为8％ 苯溶液640μl，并加入30μl水混合均匀，加入载bFGF的纳米胶原颗粒5mg、和载 TGF-β1的二氧化硅纳米粒子5mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3×3cm²，表面具有平 行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻 干燥使溶剂挥发，得到表面具有平行排列的微米级沟槽的多孔膜状物，膜厚度为110 微米。

第四步：在功率为20W，氨气氛下等离子体处理10分钟，然后浸泡在2ml浓度 为0.1％的胶原溶液中(溶解胶原的溶剂为0.1N的乙酸水溶液)，其中胶原溶液中包 含60μg的PDGF-BB，1小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中膜结构 与功能的组织工程支架，即实验样(53mg)。实验样中bFGF、TGF-β1及PDGF-BB 的含量分别为4.39μg、4.28μg和30.26μg。

对照样1的制备：将PGC(GA/CL＝50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成 浓度为8％三氯甲烷溶液640μl，浇铸到光滑的大小为3×3cm²四氟乙烯槽中，室温 下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样1。

对照样2的制备：将PGC(GA/CL＝50/50，mol/mol)(数均分子量为5万)配制成 浓度为8％苯溶液640μl，并加入30μl水混合均匀，浇铸到3×3cm2 PDMS表面具 有平行排列沟槽的PDMS上，沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米， 冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功率为20W，氨气氛下等离子体处理10分钟，然后浸 泡在2ml浓度为0.1％胶原溶液中，1小时后取出洗涤后，得到表面既具平行排列的 微米级沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。

释放实验：支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时 间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：荷载 在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释 放，bFGF能持续释放18天，释放量为86％；TGF-β1能持续释放25天，释放量为82％； PDGF-BB能持续释放8天，释放量为85％。

体外细胞培养：将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样 上。实验结果显示：在对照样1上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养 3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，细 胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。 培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋 白重链(SM-MHC)和h1-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果 表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细 胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的 细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。

实施例4、制备仿天然血管中膜层结构与功能的组织工程支架

第一步：载生长因子TGF-β1明胶颗粒的制备：按照实施例1的方法制备明胶颗 粒。选取100mg粒径为600-1000纳米明胶颗粒浸泡在500μl浓度为400μg/ml的TGF-β1 溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载TGF-β1的明胶颗粒，负载在100mg 明胶颗粒上的TGF-β1为159.34μg。

第二步：载生长因子PDGF-BB二氧化硅纳米颗粒制备：按照实施例3的方法制 备二氧化硅纳米颗粒。取平均粒径为50nm的100mg二氧化硅浸泡在500μl浓度为 300μg/ml的PDGF-BB溶液中2小时，离心洗涤并冷冻干燥后，得到载PDGF-BB的 二氧化硅纳米颗粒，负载在100mg二氧化硅颗粒上的PDGF-BB为106.53μg。

第三步：将PLGA(L-LA/GA＝30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶解在苯和四 氢呋喃的混合溶剂(体积比为1∶1)中，配制成浓度为3％溶液640μl，并加入30μl水 混合均匀，加入载TGF-β1的明胶纳米颗粒5mg、和载PDGF-BB的二氧化硅纳米粒子 5mg，搅拌均匀，浇铸到大小为3×3cm²，表面具有平行排列沟槽的PDMS上，沟 宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，得到表面具 有平行排列的微米级沟槽的多孔膜状物，膜厚度为70微米。

第四步：在功率为20W，二氧化碳气氛下等离子体处理20分钟，然后浸泡在2ml 浓度为50μg/ml的bFGF中，1小时后取出薄膜并用水洗涤三遍，得到仿天然血管中 膜结构与功能的血管组织工程支架，即实验样(25mg)。实验样中bFGF、TGF-β1及 PDGF-BB的含量分别为56.30μg、5.33μg和30.26μg。

对照样1的制备：将PLGA(L-LA/GA＝30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶 解在氯仿中，配制成浓度为3％的氯仿溶液640μl，并浇铸到光滑的大小为3×3cm²四 氟乙烯槽中，室温下使溶剂挥发，得到表面光滑无孔的致密结构膜，作为对照样1。

对照样2的制备：将PLGA(L-LA/GA＝30/70，mol/mol)(数均分子量为15万)溶 解在苯和四氢呋喃的混合溶剂(体积比为1∶1)中，配制成浓度为3％溶液640μl，并加 入30μl水混合均匀，浇铸到大小为3×3cm²，表面具有平行排列沟槽的PDMS上， 沟宽为50微米，沟槽深度5微米，槽间距为5微米。冷冻干燥使溶剂挥发，然后在功 率为20W，二氧化碳气氛下等离子体处理20分钟，得到表面既具平行排列的微米级 沟槽、又具纳米拓扑结构的多孔膜状物，作为对照样2。

释放实验：支架浸泡在包含1％牛血清蛋白的磷酸缓冲液(pH 7.4)里，每隔一定时 间后收集释放介质，采用ELISA方法测定其中的生长因子的量。实验结果显示：荷载 在仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上的三种生长因子均能持续释 放，bFGF能持续释放7天，释放量为72％；TGF-β1能持续释放27天，释放量为79％； PDGF-BB能持续释放20天，释放量为85％。

体外细胞培养：将牛大动脉平滑肌细胞分别种植到对照样1、对照样2和实验样 上。实验结果显示：在对照样1上，平滑肌细胞和细胞外基质呈无规组织形态；培养 3天后，牛大动脉平滑肌细胞在实验样上的增殖明显大于在两种对照样上的增殖，细 胞沿着沟槽方向取向生长，而且平滑肌细胞骨架蛋白也沿着沟槽方向取向分布和聚集。 培养15天后，牛大动脉平滑肌细胞的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌肌球蛋 白重链(SM-MHC)和h1-calponin等分化标志蛋白表达在实验样上最强。此研究结果 表明在这种仿天然血管中膜层结构与功能的血管组织工程支架上，培养血管平滑肌细 胞在早期能够保持细胞的合成表型，使细胞快速生长和繁衍，而后期能使合成表型的 细胞向收缩表型转换，从而使再生的血管具有生理活性和阻止新内膜的形成。