一种摩加夫芽胞杆菌及微生物菌剂和它们的应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种摩加夫芽胞杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。 

背景技术

土地盐碱化是影响农业生产和生态环境的严重问题。全世界约有20%的耕地和接近50%的灌溉农田产量严重受土壤高浓度盐碱的影响。在中国，约有1亿亩次生盐渍化农田，占耕地总面积的10%。如何确实改良和有效利用盐碱地，提高农林业生产的经济、社会和生态效益，是现代农林业所关注的重大问题。 

在国内外盐碱地改良研究领域，先后提出了“种稻改碱”农业改良措施，“灌水洗盐”工程改良措施，以及利用石膏、氯化钙、工业废酸、燃煤烟气脱硫物等化学改良措施。这些措施见效快，取得了显著成果。但是改良成本高，资源耗费大，且产生养分流失、污染下游、改良效果不稳定、容易返盐等问题。 

近年来，在长期研究成果的基础上，人们从恢复生态学的角度逐渐认识到把盐碱地的改良和利用结合起来，即“寓改良到利用中，改良与利用并行”，以生物利用为核心的生态恢复技术是未来盐碱地改良修复的突破口。目前，生物改良包括种植耐盐碱植物、使用微生物菌肥等。而开发高效的微生物菌肥制剂，首先就要获得耐受盐碱且对盐碱具有去除作用的微生物菌株，但是，现有的微生物菌株去除盐碱的效果仍然较差。 

发明内容

为了克服现有的微生物菌株去除盐碱的效果较差的缺陷，本发明提供了一种摩加夫芽胞杆菌，该摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）的保藏编号为CCTCC NO.M2013499。 

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC NO.M2013499的摩加夫芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillus lincheniformis）和解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 

本发明还提供了如上所述的摩加夫芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在盐碱地改良中的应用。 

本发明还提供了如上所述的摩加夫芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的应用。 

通过上述技术方案，本发明可以更加有效地去除盐碱，例如可以将土壤脱盐率提高至55%以上。 

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 

生物材料保藏 

本发明的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）是本发明的发明人从山东陵县土壤中分离的纯培养物，其保藏编号为CCTCC NO.M2013499，保藏日期为2013年10月24日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，分类命名为摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）。 

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。 

本发明提供了一种摩加夫芽胞杆菌，该摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）的保藏编号为CCTCC NO.M2013499。 

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂包含培养基和菌体，所述菌体包括保藏编号为CCTCC NO.M2013499的摩加夫芽胞杆菌，且所述菌体还包括枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillus lincheniformis）和解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 

其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，每克所述微生物菌剂所含的总活菌数可以为2-20×10⁷CFU。 

优选地，以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份。在该优选情况下，所述微生物菌剂具有更加优良的去除盐碱的能力。 

根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能够用于培养摩加夫芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”（Microbiology Culture Media Manual）的记载制备得到。例如，牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH值7.0-7.2，121℃灭菌30min；发酵培养基：葡萄糖15g，淀粉1g，豆饼粉25g，硫酸锰1g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，pH值7.0-7.2，115℃灭菌15min。 

其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将摩加夫芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌分别接种于培养基中进行培养。其中，可以在各自独立的培养体系中分别培养摩加夫芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌，并将分别培养得到的微生物按照比例 混合。优选情况下，通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后的混合，使得到的每克微生物菌剂的总活菌数为2-20×10⁷CFU。 

根据本发明，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将枯草芽孢杆菌在种子培养基（LB培养基）中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的生产培养基（葡萄糖5g，豆粕30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2）中接种2-5重量份的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的菌液，37℃培养，直至枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的活菌数为2-20×10⁷个/克的培养基。 

所述地衣芽孢杆菌（Bacillcus lincheniformis）的培养方法没有特别的限制为本领域技术人员所公知，例如，可以先将地衣芽孢杆菌在种子培养基（LB培养基）中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份的培养基（玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1：15，葡萄糖1.50g，pH值7.5）中接种2-5重量份的地衣芽孢杆菌（Bacillcus lincheniformis）的菌液，37℃培养，直至地衣芽孢杆菌（Bacillcus lincheniformis）的活菌数为2-20×10⁷个/克的培养基。 

所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将解淀粉芽孢杆菌在种子培养基（LB培养基）中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液，然后在100重量份培养基（豆饼粉50g，蔗糖20g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g，pH7.0-7.2）中接种2-5重量份的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌株，37℃培养，直至解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的活菌数为2-10×20⁷个/克的培养基。 

所述摩加夫芽孢杆菌的培养方法没有特别的限制，例如，可以先将摩加夫芽孢杆菌在种子培养基（LB培养基）中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8， 得到菌液，然后在100重量份培养基（葡萄糖15g，淀粉1g，豆饼粉25g，硫酸锰1g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，pH7.0-7.2）中接种2-5重量份的摩加夫芽孢杆菌的菌株，37℃培养，直至摩加夫芽孢杆菌的活菌数为2-20×20⁷个/克的培养基。 

通过在各自独立的培养体系中的培养及培养后按照比例的混合，所述混合的条件没有特别的限制，优选能够使得到的微生物菌剂满足以下条件：以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份。 

根据本发明，所述枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽胞杆菌（Bacillus lincheniformis）、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的菌种可以通过商购得到。例如，所述枯草芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC03221，所述地衣芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02698，所述解淀粉芽胞杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC10166。 

本发明还提供了如上所述的摩加夫芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在盐碱地改良中的应用。 

其中，所述盐碱地土壤中Cl^-的浓度可以为至少0.15mol/kg，pH值可以为8以上，本发明的摩加夫芽胞杆菌可以在具有0.15mol/kg以上Cl^-浓度和8以上的pH值的盐碱地土壤中良好生长并起到降低Cl-的作用。 

本发明还提供了如上所述的摩加夫芽胞杆菌和如上所述的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的应用。 

其中，所述植物可以为西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄、辣椒、茄子、水稻、苹果、梨、葡萄、桃、杏或草莓等等。 

以下通过实施例进一步详细说明本发明： 

实施例1 

本实施例用于说明本发明的摩加夫芽胞杆菌及其性能。 

将保藏编号为CCTCC NO.M2013499的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）接种到LB培养基（含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L）中，培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液。 

在LB培养基中加入NaCl调整NaCl的浓度为220g/L，并且加入NaOH调整pH值为9.5，得到盐碱胁迫培养基。 

将3mL上述菌液加入盐碱胁迫培养基中，使起始OD₆₀₀为0.1，于30℃，180转每分下振荡培养，每隔4h取样测定发酵液中菌密度(OD₆₀₀)。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、20、24小时的OD₆₀₀分别为0.1、0.12、0.16、0.23、0.38、0.55。由此说明，保藏编号为CCTCC NO.M2013499的摩加夫芽胞杆菌能够在NaCl的浓度为220g/L且pH值为9.5的盐碱胁迫培养基中良好生长。 

在LB培养基中加入无水氯化钙调整氯化钙的浓度为0.5g/L，加入MgSO₄调整MgSO₄的浓度为30g/L，并将pH值调整为9.5，得到盐碱清除测试培养基。 

将3mL上述菌液加入150mL的盐碱清除测试培养基中，于30℃，180转每分下振荡培养，隔24h后取样测定发酵液中Cl^-的浓度和pH值，结果显示，Cl^-的浓度下降了21.2%，pH值下降为8.2，证明保藏编号为CCTCC NO.M2013499的摩加夫芽胞杆菌具有优异的盐碱清除能力。 

对比例1 

将购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02076的摩加夫芽胞杆菌（Bacillus mojavensis）接种到LB培养基（含胰蛋白胨10g/L、酵母 提取物5g/L、NaCl10g/L）中，培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，，得到菌液。 

在LB培养基中加入NaCl调整NaCl的浓度为220g/L，并且加入NaOH调整pH值为9.5，得到盐碱胁迫培养基。 

将3mL上述菌液加入盐碱胁迫培养基中，使起始OD₆₀₀为0.1，于30℃，180转每分下振荡培养，每隔4h取样测定发酵液中菌密度(OD₆₀₀)。结果显示，发酵液第0、4、8、12、16、20、24小时的OD₆₀₀分别为0.1、0.1、0.1、0.1、0.1、0.1。由此说明，购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02076的摩加夫芽胞杆菌不能在NaCl的浓度为220g/L且pH值为9.5的盐碱胁迫培养基中生长。 

在LB培养基中加入无水氯化钙调整氯化钙的浓度为0.5g/L，加入MgSO₄调整MgSO₄的浓度为30g/L，并将pH值调整为9.5，得到盐碱清除测试培养基。 

将3mL上述菌液加入150mL的盐碱清除测试培养基中，于30℃，180转每分下振荡培养，隔24h后取样测定发酵液中Cl^-的浓度和pH值，结果显示，Cl^-的浓度下降了1.5%，pH值下降为9.3，证明购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02076的摩加夫芽胞杆菌基本不具有盐碱清除能力。 

实施例2 

本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。 

（1）在100重量份的培养基（葡萄糖5g，豆粕30g，蛋白胨2g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2）中接种5重量份的枯草芽胞杆菌菌液（购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC03221，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液），37℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽胞杆菌的活菌数为 2×10⁷CFU/克的培养基。 

（2）在100重量份的培养基（玉米浆0.45g，蛋白胨1.50g，豆饼粉浸汁为1：15，葡萄糖1.50g，pH值7.5）中接种5重量份的地衣芽胞杆菌菌液（购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02698，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液），37℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至地衣芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷CFU/克的培养基。 

（3）在100重量份的培养基（豆饼粉50g，蔗糖20g，硫酸铵5g，柠檬酸三钠2.5g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.05g，pH7.0-7.2）接种4重量份的解淀粉芽胞杆菌菌液（购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC10166，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液），37℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至解淀粉芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷CFU/克的培养基。 

（4）在100重量份的培养基（葡萄糖15g，淀粉1g，豆饼粉25g，硫酸锰1g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.5g，酵母膏0.2g，氯化铁0.1g，碳酸钙0.1g，pH7.0-7.2）中接种5重量份的摩加夫芽胞杆菌菌液（保藏编号为CCTCCNO.M2013499，在如上相同LB培养基中培养至菌密度OD₆₀₀值为0.6-0.8，得到菌液），37℃培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至摩加夫芽胞杆菌的活菌数为2×10⁷CFU/克的培养基。 

（5）将步骤（1）至（4）中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌按照比例进行混合，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.1份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.1份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.03份，得到本实施例的微生物菌剂。 

实施例3 

本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。 

按照实施例2的方法，将步骤（1）至（4）中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.5份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.05份，得到本实施例的微生物菌剂。 

实施例4 

本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。 

按照实施例2的方法，将步骤（1）至（4）中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01份，得到本实施例的微生物菌剂。 

实施例5 

本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。 

按照实施例2的方法，将步骤（1）至（4）中分别得到的枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌按照比例进行混合，所不同的是，混合比例使得到的微生物菌剂中，以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为5份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为1份，得到本实施例的微生物 菌剂。 

实施例6 

本实施例用于说明本发明的微生物菌剂及其性能。 

按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，将步骤（2）至（4）中分别得到的地衣芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、摩加夫芽胞杆菌按照比例进行混合，但不加入枯草芽胞杆菌，得到本实施例的微生物菌剂。 

对比例2 

按照实施例2的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的摩加夫芽胞杆菌为购自中国农业微生物菌种保藏中心且编号为ACCC02076的摩加夫芽胞杆菌。 

测试实施例1 

本测试实施例通过室外盆栽实验测定实施例2-6和对比例2的微生物菌剂在盐碱地改良中的效果。 

室外盆栽使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮0.561g/kg、全磷1.14g/kg、全钾14.98g/kg、速效氮39.19mg/kg、速效磷16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。并且，在基质土壤中添加NaCl溶液，使得Cl^-的浓度为0.19mol/kg，添加NaOH，使得pH值为9.0，得到实验土壤。盆栽试验盆高21cm、上直径20cm、下直径13cm，每盆加土3.8kg，分别加入实施例2-6和对比例2的微生物菌剂0.05kg。 

在盆中种入紫花苜蓿，当紫花苜蓿平均株高达到20cm时，按照《NY/T1121.17-2006土壤检测第17部分：土壤氯离子含量的测定》中的方法测定土壤中的Cl-的浓度，并计算Cl^-的去除率，结果如表1所示。 

表1 

从表1的数据可以看出，本发明的微生物菌剂具有优良的盐碱地改良效果，并且，在优选以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份的情况下，所述微生物菌剂具有更加优良的去除盐碱的能力。 

测试实施例2 

本测试实施例通过室外盆栽实验测定实施例2-6和对比例2的微生物菌剂在增加植物耐旱性中的效果。 

使用测试实施例1的基质土壤制作营养土盆钵，将番茄种子催芽48h(25℃)后,将移入营养土盆钵中，至于温室中生长15天后移苗至新的营养土盆钵（每个盆钵3.8kg土壤，移植4株番茄）中，隔天浇200mL水。移苗15天后，每个盆钵分别加入实施例2-6和对比例2的微生物菌剂0.05kg，正常浇水6天之后，断水20天后，测定番茄叶片相对含水量，结果如表2所示。 

表2 

从表2的数据可以看出，本发明的微生物菌剂具有优良的增加植物耐旱性效果，并且，在优选以活菌体的数目计，相对于每份所述摩加夫芽胞杆菌，所述枯草芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述地衣芽胞杆菌的含量为0.05-0.2份，所述解淀粉芽胞杆菌的含量为0.01-0.05份的情况下，所述微生物菌剂具有更加优良的增加植物耐旱性的能力。 

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。 

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。 

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。