抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的shRNA及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基因干扰序列即抑制视网膜色素上皮细胞凋亡 的shRNA及其制备治疗和预防视网膜变性的药物中的应用。

背景技术

视网膜变性(Retinal degeneration)是由于视网膜细胞死亡引发的一系列眼睛疾病的统称， 包括视网膜色素变性和年龄相关性黄斑变性等。临床主要表现为夜盲、管状视野及中心视力 下降等。遗传因素在视网膜色素变性发病过程中发挥着重要作用，目前几无有效治疗方法。 在发达国家，年龄相关性黄斑是引起50岁及以上人群重度视力丧失的首要原因。在我国，随 着人口老龄化的加重，年龄相关性黄斑发病人数逐渐上升，因此其带来的危害正随着我国人 口老龄化逐年增加。目前针对视网膜变性的治疗措施十分有限，而在分子水平上细胞凋亡是 几乎所有视网膜变性的最终通路，因此抗细胞凋亡成为视网膜色素变性的治疗目标。

RNA干扰技术(RNA interferenc，RNAi)是通过小分子双链RNA(dsRNA)特异性靶向互 补目标基因转录本，进而诱导目标基因mRNA降解达到基因沉默的技术。人工合成或细胞内 转录生成小的双链RNA(siRNA)或者发夹型RNA(shRNA)进入细胞后与目的基因的靶序列结 合，被Dicer酶切割使得目的基因mRNA被降解。RNAi特异高效的抑制目的基因的表达展 现出广阔的前景。Josep Tabernero等将RNAi技术应用到人体实验中，研究者特异性的干扰 VEGF和KSP的表达后，明显的抑制了肝癌的发生(Tabernero J，et a1.First-in-humans trial ofan  RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement. Cancer Discov 2013，3：406-417.)。另外，RNAi技术还可以调节炎症反应，有报道证明RNAi  可能成为治疗急性肺炎的候选方案(Lomas-Neira J，et a1.，RNA interference as a potential  therapeutic treatment for inflammation associated lung injury.Int J Clin Exp Med，2008，1： 154-160.)。因此RNA干扰技术在医药领域有着广泛的应用。

发明内容

本发明提供了一种GADD45a基因的shRNA及其用途，该shRNA能够抑制GADD45a 基因的表达，从而抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡。

本发明抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的shRNA，根据GADD45a基因的mRNA序列，选 择靶点序列，并根据靶点序列设计相应的shRNA系列，如下所示。

SEQ ID No.1：

5’-T AACGTCGACCCCGATAACGTGTTCAAGAGACACGTTATCGGGGTCGACGTT  TTTTTTC-3’；

SEQ ID No.2：

5’-T AACATCCTGCGCGTCAGCAACTTCAAGAGAGTTGCTGACGCGCAGGATGTT  TTTTTTC-3’；

SEQ ID No.3：

5’-T AAAGTCGCTACATGGATCAATTTCAAGAGAATTGATCCATGTAGCGACTT  TTTTTTTC-3’。

本发明中，其序列如SEQ ID NO.1所示的抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的shRNA，其针 对的靶序列如SEQ ID NO.4所示，即AACGTCGACCCCGATAACGTG。

本发明中，其序列如SEQ ID NO.2所示的抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的shRNA，其针 对的靶序列如SEQ ID NO.5所示，即AACATCCTGCGCGTCAGCAAC。

本发明中，其序列如SEQ ID NO.3所示的抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的shRNA，其针 对的靶序列如SEQ ID NO.6所示，即AAAGTCGCTACATGGATCAAT。

本发明还公开了一种干扰GADD45a基因表达的载体，即可以转录形成该shRNA的载体， 命名为pLL3.7-GADD45a-shRNA，该载体包含如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3 所示的序列构成的shRNA序列，具体步骤如下：

我们在Invitrogen订购SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、 SEQ ID No.3所示shRNA序列及其 反义链，用无菌水稀释至100μM，各取1μL与98μL的退火缓冲液混合。98℃孵育10min， 自然冷却至室温。将pLL3.7质粒用HpaI和XhoI双酶切，回收大片段，将大片段与退火产物 用T4连接酶进行连接。取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。37℃培养16h，挑取单克隆摇 菌，提质粒，测序验证，载体构建图如图1所示。

本发明还公开了一种抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的慢病毒，该慢病毒是由包装质粒 psPAX2和包膜质粒pMD2G形成的蛋白包裹pLL3.7-GADD45a-shRNA的基因组所形成。

培养293T/17细胞(10cm培养皿)至60-70％密度后，用CaC12沉淀法包装慢病毒。将 pSPAX2、pMD2G和pLL3.7-GADD45a-shRNA质粒按以下比例混合。具体体系为pSPAX2： pMD2G：pLL3.7-GADD45a-shRNA=2：2：1。将质粒混合液缓慢加入2×HEPES缓冲液内， 滴加时间持续1min。将混合液置于室温静置10min。将质粒与HEPES的混合液缓慢加入 293T/17细胞培养液中。培养8h后换液，继续培养48h。收集病毒，2000rpm离心10min，去 除细胞。分装病毒，-80℃保存。

本发明还公开了一种光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的模型。用5000 Lux的光强照射 4.5h，可明显诱导视网膜色素上皮细胞的凋亡，细胞活力明显下降。JC-1染色显示绿色，表 明线粒体膜电位下降，提示细胞处于凋亡状态。

本发明还公开了光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的机理，即光照抑制AKT的磷酸化， 进而诱导GADD45a的表达，GADD45a诱导视网膜色素上皮细胞的凋亡。

本发明还公开了抑制视网膜色素上皮细胞凋亡的慢病毒的制备及其应用和效果。将慢病 毒感染视网膜色素上皮细8h，通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达。继续培养至24h， 检测GADD45a基因的抑制效率。用5000Lux的白光照射感染病毒的视网膜色素上皮细胞 4.5h，通过WST-1实验检测细胞活力，实验结果发现GADD45a基因抑制后，可明显的降低 光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡。

本发明提供一种GADD45a基因的发夹型小干扰RNA，如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2 或SEQ ID NO.3所示的shRNA，可以抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡，适用于制备 视网膜变性疾病的治疗或预防的药物。

在分子水平上，细胞凋亡是几乎所有视网膜变性的最终通路，因此抗凋亡成为视网膜变 性的治疗目标。本发明研究表明，在视网膜色素上皮细胞中，可见光明显地诱导GADD45a 的表达进而促进细胞凋亡。本发明公开的三段GADD45a基因的shRNA，分别如SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，能够通过RNA干扰途径(RNAi)特异性降低视网膜 色素上皮细胞中GADD45a的表达，明显地抑制光照诱导的细胞凋亡，表明该shRNA可以用 于制备治疗或预防视网膜变性的药物制品。利用这种发夹型小干扰RNA(shRNA)对GADD45a 基因进行特异性干扰后明显地抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞的凋亡，从而达到治疗视 网膜变性的目的，适用于视网膜色素变性和年龄相关性黄斑变性等视网膜疾病的预防和治疗。

附图说明

图1表示载体构建流程；

图2表示视网膜色素上皮细胞光刺激；

图3表示光照抑制视网膜色素上皮细胞活力(剂量依赖性实验)；

图4表示光照抑制视网膜色素上皮细胞活力(时间依赖性实验)；

图5表示光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡；

图6表示光照抑制AKT磷酸化；

图7表示LY294002增加光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡；

图8表示光照诱导GADD45a表达；

图9表示GADD45a的shRNA抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡；

图10表示GADD45a过表达诱导视网膜色素上皮细胞凋亡。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限 于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点 都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试 剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明 没有特别限制内容。

实施例1载体构建

根据GADD45a基因的mRNA序列，选择下述靶点序列，并根据靶点序列设计相应的 shRNA系列结构及其编码序列。

SEQ ID No.1：

5’-T AACGTCGACCCCGATAACGTGTTCAAGAGACACGTTATCGGGGTCGACGTT  TTTTTTC-3’；

SEQ ID No.2：

5’-T AACATCCTGCGCGTCAGCAACTTCAAGAGAGTTGCTGACGCGCAGGATGTT  TTTTTTC-3’；

SEQ ID No.3：

5’-T AAAGTCGCTACATGGATCAATTTCAAGAGAATTGATCCATGTAGCGACTT  TTTTTTTC-3’。

我们在Invitrogen订购SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、  SEQ ID No.3所示shRNA序列及其 反义链，用无菌水稀释至100μM，各取1μL与98μL的退火缓冲液混合。98℃孵育10min， 自然冷却至室温。将pLL3.7质粒用HpaI和XhoI双酶切，回收大片段，将大片段与退火产物 用T4连接酶进行连接。取连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。37℃培养16h，挑取单克隆摇 菌，提质粒，测序验证，载体构建图如图1所示。

实施例2慢病毒包装

培养293T/17细胞(10cm培养皿)至60-70％密度后，用CaCl2沉淀法包装慢病毒。将 pSPAX2、pMD2G和pLL3.7-GADD45a-shRNA质粒按以下比例混合。具体体系为pSPAX2： pMD2G：pLL3.7-GADD45a-shRNA=2：2：1。将质粒混合液缓慢加入2×HEPES缓冲液内， 滴加时间持续1min。将混合液置于室温静置10min。将质粒与HEPES的混合液缓慢加入 293T/17细胞培养液中。培养8h后换液，继续培养48h。收集病毒，2000rpm离心10min，去 除细胞。分装病毒，-80℃保存。

实施例3光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡

视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)培养45天至其长出色素，培养步骤如图2所示，即首先 用普通培养基培养细胞长至100％，换成分化培养基继续培养至其长出色素。用不同强度的白 光照射细胞不同的时间，用WST-1实验检测光照对细胞活力的影响，实验结果发现，光照成 剂量依赖性的诱导视网膜色素上皮细胞凋亡，如图3所示，同时光照也成时间依赖性的诱导 视网膜色素上皮细胞凋亡，如图4所示。

实施例4光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡

为了进一步检测光照对视网膜色素上皮细胞凋亡的影响，本发明使用JC-1染色，该方法 可以检测视网膜色素上皮细胞的线粒体膜电位，线粒体膜电位下降说明细胞处于凋亡状态， JC-1染色呈绿色，反之呈红色。实验结果如图5所示，表明，经光照(用5000 Lux的光强照 射4.5h)后，JC-1染色的视网膜色素上皮细胞中绿色明显增多，表明光照促进了视网膜色素 上皮细胞的凋亡。

实施例5光照抑制AKT的磷酸化促进视网膜色素上皮细胞

为了进一步检测光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡的分子机制，本发明应用RNA深处测 序法检测光照所激活的信号通路，实验结果显示AKT信号通路在光照诱导细胞凋亡中起到了 重要作用。免疫印迹结果，如图6所示，表明光照明显抑制AKT的磷酸化。进一步地，用 PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002处理细胞后，AKT磷酸化明显减少，细胞凋亡数量 明显增多，如图7所示，抑制剂LY294002增加了光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡。

实施例6光照诱导GADD45a的表达

本实施例检测光照照射视网膜色素上皮细胞后GADD45a的表达。实验结果表明，光照 明显地诱导了GADD45a的表达。进一步地，加入了PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002 之后，GADD45a的表达量明显上升，如图8所示，表明AKT信号位于GADD45a的上游。

实施例7 GADD45a的shRNA抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡

前述实施例表明GADD45a在光照诱导视网膜色素上皮细胞凋亡中起到了重要作用。本 实施例中，用实施例1和2所示载体包装的慢病毒在相同滴度下等体积混合，将病毒混合液 处理视网膜色素上皮细胞，然后用光照进行刺激。如图9所示，实验结果显示实施例1和2 所示载体包装的慢病毒抑制了GADD45的表达，同时也抑制了光照诱导的视网膜色素上皮细 胞凋亡。进一步地，采用基因过表达技术使GADD45a在视网膜色素上皮细胞内过量表达， 实验结果如图10所示，表明GADD45a过表达后会明显加重光照诱导的视网膜色素上皮细胞 的凋亡。

可见GADD45a基因在光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡中起到的重要作用， GADD45a可以作为治疗视网膜色素上皮细胞凋亡的重要靶点，针对GADD45a基因的靶点序 列形成的小发夹RNA(shRNA)可明显有效地抑制光照诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡，在 制备治疗或预防视网膜变性的药物中具有重要应用。