载姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种固体脂质纳米粒，特别涉及一种含有抗肿瘤及逆转多药耐药活性 的姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒及制备方法，属于药品技术领域。

背景技术

P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的高表达是肿瘤多药耐药（Multidrug Resistance， MDR）最主要的机制。目前药剂学的研究热点是通过纳米药物载体来逆转MDR。近 年来，固体脂质纳米粒（Solid Lipid Nanoparticles，SLN）由于其独特的优势，成为一 种极有发展前景的新型给药载体。SLN是一种以在体内可降解的、天然或合成的固体 类脂材料作为载体，吸附或包裹药物而成的亚微型给药系统，粒径约在50-1000nm范 围内，制备方法有高压乳匀法、微乳法、溶剂乳化蒸发法以及乳化蒸发-低温固化法等。

姜黄素（Curcumin，Cur），是从姜科姜黄属植物姜黄的根茎中提取出的主要活性 成分。近年来，有关姜黄素抗肿瘤作用的研究越来越受到重视。目前姜黄素相关的专 利有：固体分散体（CN100340238C,2007）、纳米粒（CN101711740A,2010）、自乳化 制剂（CN101627969A,2010）、纳米混悬剂（CN102961368A,2013）、固体脂质纳米粒 （CN102949344A,2013）等，在增加药物生物利用度、提高治疗效果方面具有显著效 果，但姜黄素在体内作为P-gp的底物，易被排出细胞，故进一步抑制P-gp以增强其 疗效仍是需要解决的问题。国内外针对P-gp抑制剂进行了广泛的研究，如维拉帕米、 环孢素A等，但由于毒副作用大而限制了其临床应用。

胡椒碱（Piperine，Pip）被证实为许多药物生物利用度的增强剂，研究表明胡椒 碱能够抑制P-gp的功能。故本专利将胡椒碱和姜黄素联合使用，意在通过胡椒碱抑制 P-gp来减少姜黄素的外排，从而提高体内疗效。

近年来发现某些非离子型表面活性剂对P-gp有抑制作用，能够有效地逆转肿瘤细 胞的多药耐药性，因而广泛用于抗肿瘤药物的传递系统中。本发明选择具有P-gp抑制 作用的非离子型表面活性剂，如TPGS和Brij78作为制备固体脂质纳米粒的辅料，不 仅增强了姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒对肿瘤细胞耐药现象的逆转作用，同时提高 了纳米粒的稳定性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种逆转多药耐药的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳 米粒及其制备方法，该方法工艺简单，操作简便；制剂具有溶解度高、稳定性好、生 物利用度高，协同发挥药物疗效等特点。

为达上述目的，发明一种载姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒，由以下重量百分 比的组分制成：姜黄素0.1%～5%，胡椒碱0.1%～5%，固体脂质材料10%～70%，液 态油相5%～30%，乳化剂10%～60%，余量为水。

脂质材料是决定载药量的重要因素，结晶性良好的脂质材料会形成严密完美的晶 格，容纳药物的空间较小，而复杂的脂质材料可以形成大量缺陷的晶格，从而能够容 纳更多药物，使得包封率增加。本发明的固体脂质纳米粒，其中优选所述固体脂质材 料为甘油酯、磷脂、类固醇、蜡脂中的一种或两种以上任意比例的混合物。

进一步优选地，所述甘油酯选自单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘 油酯、山嵛酸甘油酯(Compritol888)、单棕榈酸甘油酯、双棕榈酸甘油酯、三棕榈酸甘 油酯、三油酸甘油酯、月桂酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯中的一种或两种以上的混合物； 所述磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂；类固醇为胆固醇；所述蜡脂为微晶石蜡、鲸蜡 醇棕榈酸酯、鲸蜡醇十六酸酯中的一种或两种以上的混合物。

本发明的固体脂质纳米粒，更优选所述固体脂质材料为单硬脂酸甘油酯和大豆卵 磷脂，优选其质量比为1:（1～3）。

液态脂质对药物具有较强的溶解能力，且可插入晶格中取代固态脂质分子，破坏 其晶格排列，降低结晶度，从而提高药物的包封率和载药量。本发明的固体脂质纳米 粒，其中优选所述液态油相选自注射用大豆油、油酸山梨醇酯、聚乙二醇月桂酸甘油 酯、三辛酸甘油酯、油酸甘油酯、亚油酸甘油酯、油酸、油酸乙酯中的一种，更优选 油酸。

乳化剂的用量与比例也是决定固体脂质纳米粒性能的重要因素，乳化剂能使体系 更加稳定，通常纳米粒的粒径随用量的增加而降低。本发明的固体脂质纳米粒，其中 优选所述的乳化剂选自聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（TPGS）、胆酸盐、脱氧胆酸 盐、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯蓖 麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种或两种以上任意比例的混合物；优选所述胆酸盐 选自胆酸钠、甘胆酸钠、牛黄胆酸钠中的一种或两种；所述聚山梨醇酯优选吐温-80、 吐温-60、吐温-40或吐温-20；聚氧乙烯脂肪醇醚优选Brij78、Brij58、Brij35或Brij30； 泊洛沙姆优选poloxamer188、poloxamer182或poloxamer108；聚氧乙烯脂肪酸酯优 选Myrj53或Myrj59。

进一步优选地，所述乳化剂为TPGS和Brij78，优选其质量比为1:（0.5～1.5）。

本发明的固体脂质纳米粒，纳米粒粒径小于200nm，粒度均匀，且较稳定。

本发明固体脂质纳米粒的制备方法，可采用以下不同方法中的任意一种制备得到：

（1）薄膜分散法：精密称定上述重量配比的姜黄素和胡椒碱、固体脂质材料和液 态油相，加入有机溶剂中，加热超声使其溶解构成有机相；将有机相转移至圆底烧瓶 中，控制水浴，减压蒸发除去有机溶剂成膜；取乳化剂溶于蒸馏水中，构成水相；将 水相加至圆底烧瓶中旋转洗脱，洗脱后的混悬液转移至烧杯中，超声后冷却固化即得；

（2）微乳法：将上述重量配比的固体脂质材料、液态油相和乳化剂置于玻璃瓶中， 加热使油相融化，超声使之乳化；将姜黄素和胡椒碱溶解于有机溶剂中，转移到含有 油相和乳化剂的玻璃瓶中，加热搅拌除去有机溶剂，加入预热的蒸馏水；继续加热搅 拌形成水包油微乳，将形成的载药纳米粒冷却固化，即得；

（3）乳化蒸发-低温固化法：精密称定上述重量配比的姜黄素和胡椒碱、固体脂 质材料和液态油相，加入有机溶剂中，加热超声使其溶解构成有机相；取乳化剂溶于 蒸馏水中，加热搅拌构成水相；在加热搅拌下将有机相缓慢注人水相中，待有机溶剂 挥发完全后继续搅拌；将所得的初乳置于冷水浴搅拌固化冷却（或2-5℃的冰箱中冷 却固化），即得载姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒。

本发明固体脂质纳米粒的制备方法，其中所述有机溶剂选自甲醇、无水乙醇、乙 醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一种或两种以上的混合溶液，优选为无水乙醇和乙酸 乙酯的混合溶液，质量比为1:（0.5～3）。

本发明还涉及上述固体脂质纳米粒的应用，将其用于制备医用注射剂或口服制剂， 所述注射剂或口服制剂单独或与其它抗肿瘤药物联合使用，以增强抗肿瘤药物的疗效， 并同时逆转肿瘤细胞的多药耐药现象。

与现有的剂型相比，本发明采用固体脂质纳米粒的优点是提高了姜黄素和胡椒碱 药物的溶解度、增加了固体脂质纳米粒中药物的稳定性以及体外释放度，提高了姜黄 素的抗肿瘤及逆转多药耐药效果。由于姜黄素分子结构中含有双键，酚羟基等多个活 性基团，胡椒碱也极不稳定，对光热敏感，故优选采用乳化蒸发-低温固化法，制备过 程条件温和，不影响药物的稳定性。同时，经过大量实验，采用上述薄膜分散法和微 乳法同样能得到包封率、粒径和纳米粒稳定性均符合要求的制剂。与其它现有的技术 相比，本发明采用这三种方法制备姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒，制备方法简单， 纳米粒粒径小于200nm，稳定性较好并有一定缓控释作用，方便贮存，可静脉注射或 口服给药，服用方便。本发明提供的载姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒可单独或与 其它抗肿瘤药物联合使用，增强抗肿瘤药物的疗效同时逆转肿瘤细胞的多药耐药现象。

下面结合附图对本发明的载姜黄素和胡椒碱的固体脂质纳米粒及其制备方法作进 一步说明。

附图说明

图1(Cur+Pip)-SLN透射电镜图；

图2A和图2B分别为姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米电位图及粒径图；

图3A和图3B姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒释放度测定结果（A姜黄素，B胡 椒碱；mean±SD，n=3；pH=5.5（▲），pH=7.4（■））。

具体实施方式

以下是实施例及其试验数据等，但本发明的内容并不局限于这些实施例的范围。

实施例1：

按照乳化蒸发-低温固化法，分别精密称定姜黄素5mg和胡椒碱5mg，单硬脂酸 甘油酯100mg和大豆卵磷脂150mg，油酸90mg，加入5mL有机溶剂（无水乙醇： 乙酸乙酯=3:2）中，加热超声使其溶解，超声后水浴加热搅拌构成有机相。取TPGS100 mg和Brij78150mg溶于蒸馏水中，加热搅拌构成水相。分别将有机相和水相加热至 约60℃，在加热搅拌下将有机相缓慢注人水相中，待有机溶剂挥发完全后继续搅拌。 将所得的初乳置于4℃冰箱中迅速冷却，即得固体脂质纳米粒的混悬液。

对实施例1得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，包括 Zeta电位、粒径、包封率和体外释放。

（1）形态观察

取(Cur+Pip)-SLN溶液1滴置于覆有支撑膜的铜网上，固定染色后，置于透射电镜 下观察其形态。结果见图1，结果表明，制得的(Cur+Pip)-SLN形态为类球形，大小均 匀，纳米粒之间基本无黏连。

（2）Zeta电位和粒径分布

取新鲜制备的(Cur+Pip)-SLN溶液，用适量蒸馏水稀释后，用Zetasizer Nano ZS90 粒径电位分析仪测定其电位和粒径。结果见图2A至图2B。

纳米粒的Zeta电位见图2A，Zeta电位为-23.5mV，结果表明，制备的纳米粒较 稳定。粒径分布见图2B，平均粒径为130.8nm。多分散系数为0.152，表明制备的纳 米粒粒径较小，粒度分布均匀。

（3）包封率

测定姜黄素和胡椒碱的包封率，(Cur+Pip)-SLN中姜黄素包封率为87.4%，胡椒碱 包封率为14.7%。

（4）体外释放实验

(Cur+Pip)-SLN的体外释放结果见图3A和图3B。由图可知，姜黄素和胡椒碱在 pH5.5的环境中释放更完全，表明两种药物在肿瘤环境中释放更快。96h时，姜黄素 在pH5.5的环境中累计百分率为83.7%，在pH7.4中累计百分率为71.5%。胡椒碱比 姜黄素释放的更快，24h时释放累计百分率均大于90%。结果表明制备的纳米粒能够 缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

本发明选择具有P-gp抑制作用的TPGS和Brij78作为制备固体脂质纳米粒的辅 料，显著提高了姜黄素和胡椒碱的体外溶出度，不仅增强了姜黄素和胡椒碱固体脂质 纳米粒对肿瘤细胞耐药现象的逆转作用，同时提高了纳米粒的稳定性。

实施例2：

按照微乳法，取单硬脂酸甘油酯100mg、蛋黄卵磷脂100mg和油酸90mg作为 油相，TPGS100mg和Brij7850mg作为乳化剂置于玻璃瓶中，加热使油相融化，超 声搅拌使之乳化。称量姜黄素10mg和胡椒碱5mg溶解于2mL无水乙醇中，转移到 含有油相和乳化剂的玻璃瓶中，加热搅拌除去无水乙醇，加入预热的蒸馏水。继续加 热搅拌形成水包油微乳，将形成的载药纳米粒直接冷却到室温，即得姜黄素和胡椒碱 固体脂质纳米粒。

将得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，结果表明其平均 粒径为168.5nm；Zeta电位为-20.1mV；姜黄素包封率为88.2%，胡椒碱包封率为14.1%； 体外释放实验表明纳米粒能够缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

实施例3：

按照薄膜分散法，分别称量姜黄素10mg和胡椒碱5mg，单硬脂酸甘油酯100mg 和大豆卵磷脂200mg，油酸110mg，加入5mL有机溶剂（无水乙醇：乙酸乙酯=2:1） 中，水浴加热超声使其溶解构成有机相。将有机相转移至圆底烧瓶中，控制水浴温度 约60℃，圆底烧瓶与水平面保持适宜夹角。打开真空泵抽取系统内空气，使有机溶剂 完全挥出，旋转蒸发成膜。取乳化剂TPGS90mg和Brij78120mg溶于蒸馏水中，构 成水相。将水相加至圆底烧瓶中旋转洗脱。将混悬液转移至烧杯中，水浴超声后，放 置4℃冰箱中冷却固化即得姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒。

将得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，结果表明其平均 粒径为152.4nm；Zeta电位为-22.3mV；姜黄素包封率为84.5%，胡椒碱包封率为12.7%； 体外释放实验表明纳米粒能够缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

实施例4：

制备方法：同实施例1乳化蒸发-低温固化法

将得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，结果表明其平均 粒径为142.4nm；Zeta电位为-23.2mV；姜黄素包封率为86.3%，胡椒碱包封率为13.8%； 体外释放实验表明纳米粒能够缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

实施例5：

制备方法：同实施例2微乳法

将得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，结果表明其平均 粒径为127.6nm；Zeta电位为-22.8mV；姜黄素包封率为82.7%，胡椒碱包封率为11.3%； 体外释放实验表明纳米粒能够缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

实施例6：

制备方法：同实施例3薄膜分散法

将得到的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的理化性质进行研究，结果表明其平均 粒径为147.2nm；Zeta电位为-24.5mV；姜黄素包封率为84.8%，胡椒碱包封率为13.7%； 体外释放实验表明纳米粒能够缓慢的释放药物，且释放较完全，具有良好的缓释性能。

经过大量试验证明，姜黄素含量在0.1%～5%，胡椒碱0.1%～5%，固体脂质材料 10%～70%，液态油相5%～30%，乳化剂在10%～60%范围内，得到的固体脂质纳米 粒均具有较好的理化性质。如具有较小的平均粒径、粒度均匀、且增加了其稳定性； 姜黄素和胡椒碱的包封率较好，显著提高了姜黄素和胡椒碱的体外溶出度，具有良好 的缓释性能。因此各组分的含量不限于上述实施例的列举，如姜黄素含量还可以是1%、 1.5%、2%、3%、4%、5%，胡椒碱的含量还可以是0.5%、1%、1.5%、2%、3%、4%、 5%，固体脂质材料的含量还可以是10%、15%、20%、30%、50%、70%，液态油相 的含量还可以是5%、10%、15%、20%、30%，乳化剂的含量还可以是10%、15%、 20%、30%、50%、60%。

经过大量试验证明，上述各组分的种类也不限于上述实施例的列举。如上述固体 脂质材料可以是甘油酯、磷脂、类固醇、蜡脂中的一种或两种以上任意比例的混合物， 得到的纳米粒物性较好，当选用单硬脂酸甘油酯和大豆卵磷脂时两者的质量比为1:（1 ～3）时，纳米粒的物性会更好。因此本发明中固体脂质材料单硬脂酸甘油酯和大豆卵 磷脂两者的质量比还可以是1:1、1:1.5、1:2、1:3等1:（1～3）之间任意的数值。

液态油相还可以是油酸山梨醇酯、聚乙二醇月桂酸甘油酯、三辛酸甘油酯、油酸 甘油酯、亚油酸甘油酯、油酸乙酯等，较优选油酸。

乳化剂还可以选用胆酸盐、脱氧胆酸盐、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯氢化蓖麻油中的一种或两种以上任意比例的混合物，当乳化剂为TPGS和Brij 78、质量比为1:（0.5～1.5）时，得到的纳米粒物性较好。因此，乳化剂中TPGS和 Brij78的质量比还可以是1:0.5、1:1、1:1.2、1:1.5等1:（0.5～1.5）之间任意的数值。

本发明固体脂质纳米粒可以采用上述薄膜分散法、微乳法和乳化蒸发-低温固化法 任一方法制备得到，优选乳化蒸发-低温固化法。制备工艺中用到的有机溶剂可选自甲 醇、无水乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿中的一种或两种以上的混合溶液，优选 质量比为1:（0.5～3）的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液。得到的固体脂质纳米粒粒径 小于200nm、粒度均匀且性能稳定。因此，有机溶剂中无水乙醇和乙酸乙酯的质量比 还可以是1:1、1:1.5、1:2、1:3等1:（0.5～3）之间任意的数值。

目前尚无姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒的公开报道，本发明采用固体脂质纳米 粒显著提高姜黄素和胡椒碱的体外溶出度，增加了其稳定性，同时本发明选择具有P-gp 抑制作用的Brij78以及TPGS作为辅料，增强对肿瘤细胞耐药现象的逆转作用。本发 明专利制备的姜黄素和胡椒碱固体脂质纳米粒为后期逆转细胞多药耐药的研究提供较 好的基础。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技 术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。