改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子及其作用靶点和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及改善间充质干细胞成骨能力的RNA分 子及其作用靶点和应用。

背景技术

创伤和疾病等原因导致的骨组织缺损是临床常见且较难处理的问题，如何促 进骨组织缺损的修复一直是相关领域学者的研究重点。近年来，通过组织工程技 术的应用，相关问题得到了一定程度的解决。通过给予受损部位填充模拟细胞外 基质的生物材料，植入具有分化为新生组织能力的种子细胞，来实现受损伤组织 的修复，已经被基础研究和临床应用证明为一项较为有效的治疗策略。

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，在适宜的条件下可以 分化成为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等成熟细胞。间充质干细胞的这种 多向分化的特性，使其有可能成为修复多种组织损伤的种子细胞。间充质干细胞 还具有高度增殖的能力，可以在较短的时间内从较少数量扩增至临床治疗所需数 量，满足临床治疗的需要。由于间充质干细胞便于扩增，在体内外可以分化为多 种组织细胞，目前，它已经成为再生医学领域的研究热点。研究人员运用间充质 干细胞治疗先天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常等疾病，并且取得了满意 的效果（Chiu LH,Lai WF,Chang SF,Wong CC,Fan CY,Fang CL,Tsai YH.The  effect of type II collagen on MSC osteogenic differentiation and bone defect repair. Biomaterials.2014;35(9):2680-2691.McCoy RJ,Widaa A,Watters KM,Wuerstle M, Stallings RL,Duffy GP,O'Brien FJ.Orchestrating osteogenic differentiation of  mesenchymal stem cells--identification of placental growth factor as a  mechanosensitive gene with a pro-osteogenic role.Stem Cells. 2013;31(11):2420-2431.Pereira RF,O'Hara MD,Laptev AV,Halford KW,Pollard  MD,Class R,Simon D,Livezey K,Prockop DJ.Marrow stromal cells as a source of  progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of  osteogenesis imperfecta.Proc Natl Acad Sci U S A.1998;95(3):1142-1147.）。但是， 随着对间充质干细胞研究的深入，越来越多的未知领域展现出来，等待深入研究。

间充质干细胞的骨修复作用常常受到局部微环境的调节。外伤和感染所致的 骨缺损常常导致骨组织感染，骨缺损局部常常伴随着炎性细胞因子浸润。而自身 免疫性疾病导致的骨质破坏也常常伴有局部骨组织内炎性细胞因子的增高。炎性 细胞因子如肿瘤坏死因子和白细胞介素1等常常抑制间充质干细胞向成骨细胞分 化，影响骨再生修复。因此，发现新的作用靶点，促进间充质干细胞在炎性微环 境向成骨细胞分化，改善骨再生修复的效果，是相关领域科学研究和临床应用的 重要问题。

最近通过研究发现：细胞间粘附分子1(intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1)是一个调控间充质干细胞向成骨细胞分化的靶点。ICAM-1属粘附分子 免疫球蛋白超家族(IgSF)，能够介导淋巴细胞粘附与迁移，在机体免疫过程和炎 性反应中起重要作用。近来有研究表明ICAM-1是间充质干细胞发挥免疫抑制作 用的关键分子。然而，关于ICAM-1对于间充质干细胞自身的生物学特性尤其是 分化能力是否具有调节作用及其作用机制却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改善间充质干细胞成骨能力的小RNA分子。

本发明的第二个目的在于提供上述小RNA分子的作用靶点。

本发明的第三个目的在于提供一种间充质干细胞。

本发明的第四个目的在于提供上述小RNA分子在制备改善间充质干细胞成 骨能力药物中的应用。

本发明的第五个目的在于提供小RNA分子在制备治疗炎症因素引起的骨质 疏松，骨质破坏，骨愈合缓慢药物中的应用。

本发明的第六个目的在于提供上述间充质干细胞在制备治疗炎症因素引起 的骨质疏松、骨质破坏、骨愈合缓慢，天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常 药物中的应用的应用。

实现本发明的技术方案如下：

一种改善间充质干细胞成骨能力的小RNA分子，所述小RNA分子为靶向 ICAM-1的mRNA的反义核酸，其序列为

5’-UUUGACAGACUUCACCACCTT-3’（SEQ ID NO.1）。

上述小RNA分子的作用靶点，所述作用靶点为ICAM-1的mRNA序列中一 段，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

作用靶点的序列为5’-GGUGGUGAAGUCUGUCAAA-3’（SEQ ID NO.2）。

一种间充质干细胞，其含有上述的小RNA分子。

上述间充质干细胞在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松、骨质破坏、骨愈合 缓慢，天性成骨不全，骨缺损，骨软骨发育异常药物中的应用。

上述小RNA分子在制备改善间充质干细胞成骨能力药物中的应用。

上述小RNA分子在制备治疗炎症因素引起的骨质疏松，骨质破坏，骨愈合 缓慢药物中的应用。

本发明的小RNA分子可以通过RNA人工合成的方法制备。

本发明的小RNA分子能够特异性抑制ICAM-1在间充质干细胞上的表达， 并显著解除ICAM-1的对于骨形成的抑制作用，促进间充质干细胞向成骨细胞分 化。本发明的小RNA分子有助于改善间充质干细胞在炎性微环境的成骨能力， 促进骨再生，有利于骨修复。本发明中的方法操作简单、靶标明确、方便实用， 能够显著促进间充质干细胞向成骨细胞分化，对于改善炎性微环境中的骨修复具 有积极意义。

附图说明

图1为类风湿关节腔液抑制间充质干细胞的早期成骨（碱性磷酸酶染色）和 晚期成骨（Von kossa）能力；图中标尺均代表100微米。

图2为类风湿关节腔液抑制成骨过程中的重要蛋白Runx2(图2A)和OCN(图 2B)的表达。（*,P＜0.05，**,P＜0.01）。

图3为类风湿关节腔液诱导间充质干细胞内的ICAM-1的mRNA表达；图 3A为ICAM-1的mRNA表达与类风湿关节腔液的浓度关系；图3B为类风湿关 节腔液诱导间充质干细胞内的ICAM-1的mRNA表达随时间的变化；图3C为类 风湿关节炎关节腔液诱导间充质干细胞表面的ICAM-1的蛋白表达（*,P＜0.05， **,P＜0.01）。

图4为给予靶向ICAM-1的反义序列核酸和无义序列核酸对间充质干细胞的 成骨能力的影响，图中标尺均代表100微米。

图5为给予靶向ICAM-1的反义序列核酸可以改善间充质干细胞内Runx2(图 5A)和OCN(图5B)的表达（*,P＜0.05）。

图6为采用基因工程导入ICAM-1能够抑制间充质干细胞的早期成骨（碱性 磷酸酶染色）和晚期成骨（Von kossa）能力，图中标尺均代表100微米。

图7为采用基因工程导入ICAM-1能够抑制成骨过程中的重要蛋白Runx2(图 7A)和OCN(图7B)的表达。（*,P＜0.05，**,P＜0.01）。

图8为靶向ICAM-1的反义序列核酸改善间充质干细胞的成骨能力，图中标 尺均代表100微米。

图9为靶向ICAM-1的反义序列核酸改善间充质干细胞内Runx2(图9A)和 OCN(图9B)的表达（*,P＜0.05，**,P＜0.01）。

具体实施方式

以下将通过具体实施例对本发明做进一步说明，如未特别指明，实施例中所 用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人熟知的常 规手段。

实施例1 本发明的小RNA分子的制备

经发明人研究结果表明ICAM-1能够抑制间充质干细胞的成骨分化。以炎性 物质（类风湿关节炎病人的关节腔液）刺激间充质干细胞，再将间充质干细胞向 成骨细胞诱导分化，以此模拟炎性微环境中的成骨过程。经研究发现间充质干细 胞中的ICAM-1的蛋白和mRNA表达水平均显著升高，于此同时，间充质干细胞 的成骨分化能力显著降低。为了进一步验证ICAM-1对于成骨分化的抑制作用， 采用基因操作技术把ICAM-1转染入间充质干细胞内，使ICAM-1在间充质干细胞 中高表达。结果发现高表达ICAM-1抑制间充质干细胞的成骨能力。丝裂原活化 的蛋白激酶(MAPK)通路与细胞的增殖和分化密切相关，为了揭示ICAM-1抑制 成骨活动的分子机制，为了进一步确认，研究了ICAM-1抑制间充质干细胞成骨 能力的分子机制，结果表明ICAM-1通过活化ERK/MAPK通路来抑制成骨活动。

本发明的改善间充质干细胞成骨能力的RNA分子是针对ICAM-1的mRNA 的反义核酸。其作用靶点是ICAM-1的mRNA序列中特异的一段序列

5’-GGUGGUGAAGUCUGUCAAA-3’，针对靶点设计反义序列，即本发明 的小RNA分子的序列为5’-GGUGGUGAAGUCUGUCAAATT-3’（SEQ ID  NO.1）。

上述小RNA分子委托广州瑞博公司直接合成，合成后进行干燥处理成 干粉。

实施例2 含有本发明的小RNA分子的间充质干细胞的制备

本发明的含有上述小RNA分子的间充质干细胞，其可以通过将小RNA分 子连同转染试剂Lipofectamine2000共同转染间充质干细胞得到。

其中，所述小RNA分子的转染终浓度可以为10-100nM,优选为50nM, Lipofectamine2000的转染终浓度可以为10-100μL/mL，优选为50μL/mL。转染 时间为24-96hours，优选为48hours。

转染过程中使用的间充质干细胞培养基是向α-MEM培养基中添加胎牛血 清，使胎牛血清的终浓度为5-20%（体积百分含量）得到的培养基；培养基优选 为向α-MEM培养基中添加胎牛血清，胎牛血清的终浓度为10%（体积百分含量） 得到的培养基。

α-MEM培养基的组成：1Lα-MEM培养基含12.1gα-MEM粉末、终浓度为 2mmol/L的L-谷氨酰胺（L-glutamine）和终浓度为25mmol/L的HEPES buffer 和2.4g NaHCO₃。

所述培养的条件可以为温度为35-38℃、CO₂浓度为5-15%（体积百分含量）、 饱和湿度、培养的时间是3-4天；所述温度优选为37℃，所述CO₂浓度优选为 5%。

上述方法中所述间充质干细胞具体可以为人，小鼠，大鼠，兔，狗和猴间 充质干细胞。

实施例3 针对ICAM-1的反义核酸序列改善炎性微环境中间充质干细胞的 成骨分化能力

1、制备无细胞关节腔液

类风湿关节炎是一类自身免疫性疾病，以侵犯四肢关节并最终导致关节骨质 破坏为主要特征。病人的关节腔内常常充满了炎性关节腔液，有研究表明其中包 含有大量的炎性细胞因子如白细胞介素1和肿瘤坏死因子α等，是模拟炎性微环 境中骨代谢的有力工具（Rivollier A,Mazzorana M,Tebib J,Piperno M,Aitsiselmi T, Rabourdin-Combe C,Jurdic P,Servet-Delprat C.Immature dendritic cell  transdifferentiation into osteoclasts:a novel pathway sustained by the rheumatoid  arthritis microenvironment.Blood.2004;104(13):4029-4037.），因此，本发明根据国 际惯例采用了类风湿关节炎病人的关节腔液和间充质干细胞共同培养，观察炎性 微环境中间充质干细胞的成骨情况及其和ICAM-1之间的关系。20位知情同意 的志愿者，均符合1987年美国风湿学会诊断标准，未经抗炎治疗。取关节腔液 样本的方式为无菌条件下穿刺抽取至抗凝管。

将抗凝的关节腔液样本以6000G离心20分钟，取上清液，弃细胞，将上清 过滤后，冻存于-70℃冰箱备用。

2、用无细胞关节腔液刺激间充质干细胞

把小鼠间充质干细胞C3H10T1/2(购买自美国ATCC公司)，按2×10⁵/孔接 种于6孔培养板，把间充质干细胞培养基（由α-MEM培养基和胎牛血清组成， 均购自美国GIBCO公司，胎牛血清的终浓度为5-20%（体积百分含量））和无细 胞关节腔液按照不同的体积比混合(100:0;95：5;90：10;80：20),每个培养孔加 入3ml，刺激24小时。

3、成骨分化的定向诱导与鉴定

每孔加入成骨诱导体系（地塞米松0.1μmol/L、β-甘油磷酸钠盐10mmol /L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）3ml，每2天全量换液，培养第2周按碱性磷酸 酶(ALP)检测试剂盒操作步骤进行ALP染色，培养3周给予Von kossa染色。ALP 染色是成骨早期的检测指标，而Von kossa染色反映的是成骨晚期的时候钙盐沉 积的情况。如图1所示，当类风湿关节炎病人的关节腔液浓度从0提升到5%， 10%和20%的时候，间充质干细胞的ALP染色逐渐变淡，说明早期成骨活动下 降，而Von kossa染色的结果也表明，随着关节腔液浓度的提升，晚期成骨活动 也受到了抑制。图中微标尺均代表100μm。

4、检测成骨分化的重要调节蛋白

Runx2和OCN是促进成骨分化的重要调节蛋白，检测它们的表达情况可以 从分子层面判断间充质干细胞的成骨分化情况。诱导10天后，全量吸出诱导液， 加入3mlPBS，轻轻摇晃培养板，洗涤剩余诱导液。然后每个培养孔加入1ml的 Trizol,提取RNA，根据PrimeScript逆转录试剂盒说明书，将总RNA逆转录为 cDNA，利用SYBR Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM试剂盒并以60℃为退 火温度进行real-time PCR。引物序列详见表1。结果以平均数±标准差表示，组 间比较采用Student’s t test。图2A和图2B显示的是随着类风湿关节炎病人的关 节腔液浓度不断提升，Runx2和OCN的表达水平逐渐下降。关节腔液刺激各组 与未刺激组相比，下降幅度均具有统计学意义。(*,P＜0.05;**,P＜0.01)。

表1 为基因real-time PCR的引物和条件

5、关节腔液上调间充质干细胞中ICAM-1基因的表达和细胞表面的表达

ICAM-1是一种细胞间粘附分子，一般认为，只有当其表达在细胞表面时才 可能发挥调节作用。本部分通过定量PCR检测ICAM-1的基因表达，通过流式 细胞术检测ICAM-1在细胞表面的表达。

（1）把小鼠间充质干细胞C3H10T1/2(购买自美国ATCC公司)，按2×10⁵/孔 接种于6孔培养板，把间充质干细胞培养基（由α-MEM培养基和胎牛血清组成， 胎牛血清的终浓度为10%，均购自美国GIBCO公司）和无细胞关节腔液按照不 同的体积比混合(100:0;95：5;90：10;80：20),每个培养孔加入3ml，刺激24 或者72小时。

（2）全量吸出刺激液，加入3mlPBS，轻轻摇晃培养板，洗涤剩余诱导液。 然后每个培养孔加入1ml的Trizol，提取RNA，根据PrimeScript逆转录试剂盒 说明书，将总RNA逆转录为cDNA，利用SYBR Green JumpStartTM Taq  ReadyMixTM试剂盒并以60℃为退火温度进行real-time PCR。ICAM-1引物序 列详见表1。结果以平均数±标准差表示，组间比较采用Student’s t test。结果如 图3A所示，随着关节腔液浓度不断提升，ICAM-1的表达水平逐渐上升。关节 腔液刺激各组与未刺激组相比，上升幅度均具有统计学意义。(*,P＜0.05;**,P＜ 0.01)。如图3B所示，随着关节腔液刺激时间的延长，ICAM-1的表达水平逐渐 上升。关节腔液刺激各组与未刺激组相比，上升幅度均具有统计学意义。(*,P ＜0.05;**,P＜0.01)。

（3）收集2×10⁵细胞/EP管（1.5ml），按照说明书要求，加入PE标记的抗 小鼠ICAM-1(anti-mouse ICAM-1)和相应的同型对照抗体(IgG2a PE)，4℃避光孵 育30分钟。用PBS洗细胞两遍，4℃离心机300g转速，流式细胞术上机分析。

结果如图3C所示，随着关节腔液浓度不断提升，ICAM-1在细胞表面的表 达水平逐渐上升。关节腔液刺激各组与未刺激组相比，上升幅度均具有统计学意 义。(*,P＜0.05;**,P＜0.01)。

7、采用ICAM-1的反义序列核酸转染，检测成骨活动的恢复

（1）把小鼠间充质干细胞C3H10T1/2(购买自美国ATCC公司)，按2×10⁵/孔 接种于6孔培养板，把间充质干细胞培养基（由α-MEM培养基和胎牛血清组成， 胎牛血清的终浓度为10%，均购自美国GIBCO公司）和无细胞关节腔液按照不 同的体积比混合(100:0;95：5;90：10;80：20),每个培养孔加入3ml，刺激24 小时。

（2）将商业化合成的针对ICAM-1的反义序列核酸（ICAM-1SiRNA，本发 明的小RNA分子，序列如SEQ ID NO.1所示）干粉离心，加入无RNA酶的去 离子水溶解，将储存浓度配制为50μM。采用一段不规则的无义序列核酸作为对 照(NC)。

（3）优选反义核酸终浓度为50nM。按照6孔培养板单孔添加3ml培养基 来计算，取3μl储存浓度为50μM的反义序列核酸溶液和3μl储存浓度为50μM 的Lipofectamine2000混合，室温孵育15分钟。

（4）把混合液加入6孔培养板内，轻轻混匀。

（5）转染48小时后进行成骨诱导分化。

（6）诱导第2周按ALP检测试剂盒操作步骤进行ALP染色，诱导3周给 予Von kossa染色。

（7）诱导10天后，提取RNA逆转录，通过定量PCR检测RUNX2和OCN 的表达情况。

成骨活动结果如图4所示，与转染了NC的间充质干细胞相比，转染了 ICAM-1SiRNA的间充质干细胞内ALP和Von kossa染色均有所增强，表明抑制 了ICAM-1之后，间充质干细胞的早期和晚期成骨能力均有所恢复。

RUNX2和OCN的表达情况如图5A和图5B所示，与关节腔液刺激组和NC 转染组相比，ICAM-1SiRNA组的间充质干细胞内RUNX2和OCN的表达均有 所恢复，差异具有统计学意义。(*,P＜0.05)。表明抑制了ICAM-1之后，可以在 分子层面促进成骨活动恢复。

实施例4 针对ICAM-1的反义核酸序列可以改善基因工程建立的高表达 ICAM-1的间充质干细胞的成骨分化能力

高表达ICAM-1的小鼠间充质干细胞（ICAM-1^high MSC）及其空载体对照间 充质干细胞（empty vector MSC）根据已发表的方法构建（徐芬芬，朱恒，陈 继德，等。ICAM-1基因转染对小鼠间充质干细胞成脂分化功能的影响。中华血 液学杂志。2013;34(5):435-438.）。也可以通过购买渠道获得。

1、成骨分化的定向诱导与鉴定

把小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、empty vector MSC和ICAM-1^high MSC， 按2×10⁵/孔接种于6孔培养板，每孔加入成骨诱导体系（地塞米松0.1μmol/L、 β-甘油磷酸钠盐10mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50μmol/L）3ml，每2天全量换液， 培养第2周按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒操作步骤进行ALP染色，培养3周给 予Von kossa染色。如图6所示，与间充质干细胞和empty vector MSC相比， ICAM-1^high MSC的ALP染色变淡，说明早期成骨活动下降，而Von kossa染色 的结果也表明，ICAM-1^high MSC晚期成骨活动也受到了抑制。图中微标尺均代 表100μm。

2、检测成骨分化的重要调节蛋白

诱导10天后，全量吸出诱导液，加入3mlPBS，轻轻摇晃培养板，洗涤剩余 诱导液。然后每个培养孔加入1ml的Trizol,提取RNA，根据PrimeScript逆转录 试剂盒说明书，将总RNA逆转录为cDNA，利用SYBR Green JumpStartTM Taq  ReadyMixTM试剂盒并以60℃为退火温度进行real-time PCR。RUNX2和OCN 引物序列详见表1。结果以平均数±标准差表示，组间比较采用Student’s t test。

结果如图7A和7B所示，与间充质干细胞和empty vector MSC相比， ICAM-1^high MSC的Runx2和OCN表达均下调，这种差异具有统计学意义。(*,P ＜0.05;**,P＜0.01)。

3、采用ICAM-1的反义序列核酸转染，检测成骨活动的恢复

（1）把小鼠间充质干细胞C3H10T1/2、empty vector MSC和ICAM-1^highMSC，按2×10⁵/孔接种于6孔培养板。

（2）将商业化合成的针对ICAM-1的反义序列核酸（ICAM-1SiRNA，本发 明的小RNA分子，序列如SEQ ID NO.1所示）干粉离心，加入无RNA酶的去 离子水溶解，将储存浓度配制为50μM。采用一段不规则的无义序列核酸作为对 照(NC)。

（3）优选反义核酸终浓度为50nM。按照6孔培养板单孔添加3ml培养基 来计算，取3μl储存浓度为50μM的反义序列核酸溶液和3μl储存浓度为50μM 的Lipofectamine2000混合，室温孵育15分钟。

（4）把混合液加入6孔培养板内，轻轻混匀。

（5）转染48小时后进行成骨诱导分化。

（6）诱导第2周按ALP检测试剂盒操作步骤进行ALP染色，诱导3周给 予Von kossa染色。

（7）诱导10天后，提取RNA逆转录，通过定量PCR检测RUNX2和OCN 的表达情况。

成骨活动结果如图8所示，与转染了NC的ICAM-1^high MSC相比，转染了 ICAM-1SiRNA的ICAM-1^high MSC内ALP和Von kossa染色均有所增强，表明 SiRNA抑制了ICAM-1之后，间充质干细胞的早期和晚期成骨能力均有所恢复。

RUNX2和OCN的表达情况如图9A和图9B所示，与ICAM-1^high MSC和转 染了NC的ICAM-1^high MSC相比，转染了ICAM-1SiRNA组的ICAM-1^high MSC 内RUNX2和OCN的表达均有所恢复，差异具有统计学意义。(*,P＜0.05;**,P ＜0.01)。表明抑制了ICAM-1之后，可以在分子层面促进成骨活动恢复。