一种用于检测保健食品中不得检出的致病菌核苷酸片段的引物和探针

技术领域

本发明涉及一种用于检测保健食品中“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针。 

背景技术

保健(功能)食品是食品的一个种类，具有一般食品的共性，能调节人体的机能，适于特定人群食用，但不以治疗疾病为目的。在保健品的生产、销售与进出口贸易中，致病菌的污染亦成为重要的安全隐患。现行有效的保健（功能）食品通用标准GB16740-1997中规定致病菌（指肠道致病菌和致病性球菌）不得检出。我国将致病菌按其是否致病、致病力强弱、感染途径、危害人体的严重性、传染性的大小、当地人群的免疫水平、有无免疫制剂和特效治疗药物等分为1、2、3类和非致病菌，目前无微生物属于第1类致病菌。第2、3类致病菌中的肠道致病菌、致病性球菌和常见的医源性条件致病菌主要种属及其代表性致病性菌株如下表1所示。由于食品行业长期执行的“不得检出”的标准，因此对常见致病菌均具有高效灵敏检出效果的通用型方法在保健食品的致病菌检测中十分必要，不仅能降低逐项检测致病菌造成的巨大工作量，也能降低检测成本缩短检测时间，在致病菌污染的监控方面起着重要的作用。 

表1保健食品中常见的“不得检出”致病菌种属 

到目前为止，至少发现20个种属的60多种细菌存在VBNC（viable but non-culture）状态，处于此状态的致病菌不具备可培养性但却仍具备致病性，传统的基于生化培养的检测方法无法检出，采用通用型核酸探针可避免VBNC状态菌的漏检。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。对多种致病菌同时检测有两种方式，一种是多重荧光PCR，但多重荧光PCR使用的是带荧光标记的核酸探针面临多组引物之间相互干扰、引物间的碱基配对进行非特异性扩增，不同种类核酸片段扩增效率不一致，高浓度模板对低浓度模板产生竞争性抑制等问题，还未能满足对多种致病菌的同时检测；另一种是核酸探针与基因芯片的结合，但基因芯片技术要求一套完整的引物与核酸探针，设计芯片和结果分析过程都比较复杂，且制作成本昂贵。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针，该引物和探针具有高度的特异性、敏感性、快速简便、费用较低等特点，还能同时对保健食品中常见的“不得检出”的多种致病菌核苷酸片段进行检测。 

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针，所述的引物由上游引物Bac F1a和下游引物Bac R1组成，所述的上游引物Bac F1a的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述的下游引物Bac R1的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；所述的探针为Bac Pb1探针，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。 

本发明用于检测保健食品中常见的“不得检出”的致病菌核苷酸片段的引物和探针还可以是：本发明所述的引物的上游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的上游引物Bac F1a向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基组成；所述的下游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的下游引物Bac R1向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基组成；所述的探针由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所述的Bac Pb1探针向3’端方向延 伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基组成。 

本发明的具体原理是利用一对靶核苷酸序列的特异性引物和一个特异性荧光探针，采用耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTP）等成分，并应用PCR技术实现靶核苷酸序列的核酸片段扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团所吸收，而在PCR扩增过程中，Taq酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使荧光报告基团游离于反应体系中，脱离了荧光淬灭基团的屏蔽作用，荧光报告基团的荧光信号就可以由仪器检测到，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而判定待测样本中靶核苷酸序列的存在。 

与现有技术相比，本发明具有如下优点： 

（1）本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可达100个拷贝/mL，说明其具有良好的灵敏度； 

（2）本发明提供的引物和探针对于不含有30种致病菌而含其他非致病性细菌、酵母或霉菌的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性； 

（3）由于本发明采用30个属的致病菌的16S rRNA基因的保守区设计引物探针，避免了假阴性结果的产生； 

（4）本发明引物和探针基本可全部检出保健食品中常见的“不得检出”的致病菌，在保健食品生产、销售和贸易中对保健食品原料和产品的微生物污染状态监控起到重要的作用； 

（5）由于本发明采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方法如PCR－电泳等易于形成气溶胶污染而造成假阳性结果；由于对PCR产物进行实时监测，大大节省了监测时间，节约了人力物力； 

（6）本发明中的引物和探针为通用型引物和探针，能用于检测常见致病菌，可避免成本昂贵的基因芯片技术，也能适应高通量的致病菌检测； 

（7）本发明中的通用型引物和探针针对的靶标细菌种类较多且比较典型，具有高度的特异性、敏感性、快速简便、费用较低等优点，既可保证样品检测的准确性和可靠性，又可节省大量的人力、物力和财力，有巨大的社会经济效益， 极具推广应用价值； 

（8）本发明中的通用型引物和探针在临床和食品尤其是保健食品微生物污染的监测中可起到非常关键的筛查作用，实用性强。 

附图说明

图1是实施例1中常见细菌属进化系统分析树； 

图2是实施例2中金黄色葡萄球菌荧光PCR反应扩增曲线； 

图3是实施例4中沙门氏菌和单增李斯特菌荧光PCR反应扩增曲线。 

具体实施方式

实施例1 

引物和探针设计 

1、引物和探针设计：通过分别对所有已知的30个属240余种常见致病菌（具体如上表1所示）的基因组序列进行比较分析（如图1所示），16S rRNA基因是所有原核生物的特征性基因，在细菌分类学方面扮演着重要的角色。应用DNAStar SeqMan软件对所有菌种序列的比对结果显示，表1中所列出的菌种的16S rRNA序列大致可分成4组：除弯曲杆菌为4组外（与其他革兰氏阴性菌16S rRNA同源性较低），表中所有革兰氏阴性菌，均为1组，但部分布氏杆菌、极少数弧菌分在2组；革兰氏阳性菌分在2，3组。 

抽取每种菌属的保守序列再做比对，结果与上述分析相符，同组的同源性较高（见图1）。与埃希式杆菌属同源性最高的属依次为：志贺氏菌属，沙门氏菌属和阪崎杆菌。Campylobacter与其他菌属同源性最低，其次是Brucella。选择无二级结构且高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。最优引物、探针序列组合如下： 

上游引物Bac F1a:CATGAAGYYGGARTCGCTAGTAATC 

下游引物Bac R1:CTACGGCTACCTTGTTACGACTTC 

探针Bac Pb：FAM-5’CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG3’-BHQ1。 

具体如序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所示。 

2、反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：取金黄色葡萄球菌标准菌株复苏后培养48小时，取培养液1mL 进行10倍梯度稀释，选取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6共6个稀释度作为系列阳性模板，分别提取基因组核酸，再分别用上述检测序列区域中的最长的扩增片段的引物和探针进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。 

2.1引物浓度的优化在反应体系中，将细菌通用型的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为0.2μmol/L。 

2.2镁离子浓度的优化在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl₂的浓度从1mmol/L至2.5mmol/L以0.5mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。 

2.3Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。 

2.4dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。 

2.5探针浓度的优化在反应体系中，将细菌通用型的探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳探针终浓度为0.1μmol/L。 

利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μL体系，所需各组分及相应浓度见表2。 

表2优化后的PCR反应体系 

注：a.在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。 

b.使用的仪器不同，应将反应参数作适当调整。 

3、仪器检测通道的选择：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管 荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。 

4、PCR条件选择如下： 

95℃2min，1个循环； 

95℃5sec，60℃40sec，40个循环。 

5、检测步骤： 

(1)选取引物和探针，引物和探针如序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中所示； 

(2)制备待测模板，可采用酚－氯仿法提取各种来源样品中致病菌的基因组DNA； 

(3)反应体系的建立：a、确定最佳引物浓度；b、确定镁离子浓度；c、确定Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量；d、确定dNTPs浓度；e、确定探针浓度，具体浓度见表2； 

(4)选择仪器的检测通道； 

(5)上机检测。 

实施例2 

选取引物对Bac F1a/Bac R1和探针Bac Pb1，以金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌等典型的食品中可能污染的致病菌为例，研究该引物与探针系统的灵敏度问题。分别将待检的9种致病菌培养液用酚－氯仿法抽提基因组DNA，具体步骤如下： 

(1)分别将待检的9种致病菌增菌液（约1mL）加入1.5mL的离心管中，12000rpm离心5分钟，去上清； 

(2)加入DNA裂解液700μL，充分混匀重悬，水浴煮沸5分钟； 

(3)加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液，充分混匀后离心，13000rpm离心5分钟； 

(4)将上清液移入另一个1.5mL的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，13000rpm离心5分钟； 

(5)将上清液移入另一个1.5mL的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，上 下颠倒混匀，13000rpm离心5分钟； 

(6)弃上清后用70％(体积百分含量)乙醇冲洗，13000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，倒置晾干； 

(7)在干燥后的离心管中加入50μLDNA溶解液充分混匀，作为DNA模板待用； 

在40μL荧光PCR反应体系中，分别加入以上提取的9种致病菌基因组DNA2μL，或加入任意一种以上9中致病菌基因组DNA2μL，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测，经检测，若待检培养液中含有9种致病菌中任意一种或以上则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可达到100个拷贝/mL，提示上述引物对和探针具有良好的灵敏度，其中图2为金黄色葡萄球菌荧光PCR反应扩增曲线。 

实施例3 

选取引物对Bac F1a/Bac R1和探针Bac Pb1，非致病性细菌（植物乳杆菌）、酵母（酿酒酵母）和霉菌（曲霉菌）研究该引物与探针系统的特异性问题。 

植物乳杆菌用实施例2中酚－氯仿法抽提基因组DNA。 

酿酒酵母与曲霉菌采用氯化苄提取基因组DNA，具体操作步骤为： 

(1)在1.5mL离心管中加入600μLDNA提取液（100mmol/L Tris-HCl，40mmol/L EDTA,pH=8.0）来悬浮菌体，振荡使之与菌体混匀； 

(2)加入10%SDS50μL，加入氯化苄300μL，剧烈振摇，使管中混合物成乳状，50～55℃水浴1h，每5min振荡混匀一次； 

(3)每管加入3mol/L的乙酸钠（pH=5.2）60μL，冰浴20min，12000r/min，4℃离心10min，取上清； 

(4)在上清液中加等体积的酚/氯仿混合液（v/v=1：1）抽提，12000r/min，4℃离心10min，取上清； 

(5)加1/10体积的乙酸钠及等体积的异丙醇，-20℃放置1h，12000r/min，4℃离心10min； 

(6)弃上清液并加入40μL75%乙醇，清洗管壁，12000r/min，4℃离心10min，弃上清干燥，加入适量Tris-EDTA缓冲液； 

在40μL荧光PCR反应体系中，分别加入以上提取的3种微生物的基因组 DNA2μL，或加入任意一种以上3种微生物的基因组DNA2μL，根据前述PCR反应条件进行荧光PCR检测。经检测，待检测液均无扩增信号，提示上述引物对和探针对常见的细菌性致病菌具有良好的特异性。 

实施例4 

对食物样品进行人工加菌污染后，检测食品样品中的致病菌。 

人工加菌步骤为：分别吸取250μL致病菌（沙门氏菌和单增李斯特菌）含量为1000和100CFU/mL的菌悬液均匀混在25mg经检测无目标菌污染的保健食品原料粉末中，则制成污染量分别为10和1CFU/mg的污染样品，静置15min以模拟自然状态下的污染。 

用增菌液对污染的食品样品进行增菌培养24h，按实施例1中的方法提取增菌液中的DNA，并用实施例1中的引物对Bac F1a/Bac R1和探针Bac Pb1对提取的DNA进行PCR检测。 

经检测，若待检食品原料中含有9种致病菌中任意一种或以上则显示阳性扩增曲线，提示上述引物对和探针对保健食品中污染的致病菌的检测具有良好的灵敏度和特异性；图3为沙门氏菌和单增李斯特菌荧光PCR反应扩增曲线。 

同样，上游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示的上游引物BacF1a向5’端方向延伸10个碱基，向3’端方向延伸10个碱基组成；下游引物由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示的下游引物Bac R1向3’端方向延伸10个碱基，向5’端方向延伸10个碱基组成；探针由碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所述的Bac Pb1探针向3’端方向延伸10个碱基和向5’端方向延伸10个碱基组成。这样的引物和探针也可以达到上述效果，如具有高度的特异性、敏感性、快速简便、费用较低等优点。 

以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。