一种水稻转录因子在改良水稻高产性状中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子Os01g60960.1基因的应 用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一半以 上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分 子生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。 当前水稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐 减弱，而水稻转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。

在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁 殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于 受精后的胚珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选 择性的基因表达过程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。

Os01g60960.1是LBD家族的一员，但是由于LBD基因是新发现的植物所特有的一 个基因家族，有关LOB结构域在高等植物发育中的确切功能尚不清楚。但是，对 已克隆的几个LBD基因功能的初步分析还是为我们了解其功能提供了部分线索。 LOB是第一个分离的属于LBD基因家族的基因，其在转座子插入引发的功能丧失 的情况下不能观察到明显的表型突变，表明LOB在拟南芥的发育过程中存在一定 程度的功能冗余。但以花椰菜病毒的35S强启动子与LOB编码序列构建的融合表 达载体转化野生型植株，可观察到植株矮小、叶片向上卷曲、叶柄和花梗变短、花 器官畸形等明显表型的变化(Shuai et al.，2002)。拟南芥中另一个LBD基因家族成 员——AS2，其突变体as2呈现出叶片不对称发育或畸形、叶脉发育不完全等表型， 则揭示了部分LBD基因可能参与了高等植物器官的形态建成(Serrano-Cartagena et  al.，1999；Ori et al.，2000；Sun et al.，2000；Semiarti et al.，2001：Xu et al.，2003)。 异位过表达AS2的转基因拟南芥植株出现了较短的初生根、狭小而上卷的子叶、叶 片和花萼远轴面形成毛刺状增生物、花梗向下弯曲等表型；同时，组织显微观察还 揭示AS2的过表达干扰了侧生器官正常近远轴极性的建立，导致远轴面的细胞类型 被近轴面的细胞类型部分替代(Lin et al.，2003；Nakazawa et al.，2003)。AS2在拟 南芥中亲缘关系最近的同源基因ASL1(亦称LBD36)，同样是LBD基因家族成员， 其过表达会引起花和角果下垂的表型(Chalfun-Junior et al.，2005；Nakazawa et al.， 2003)。ASL1的功能丧失突变体asl1没有观察到明显的异常表型，但asl1/as2双 突变体表现出花萼窄小、内部花器官暴露、花萼和花瓣向外卷曲、提前开花等突变 表型，这表明ASL1、As2同时参与了花器官的发育并在该阶段存在一定的功能冗 余(Chalfun-Junior et al.，2005)。

水稻中克隆的第一个LBD基因——ARL1(ADVENTITIOUS ROOTLESS1)，或 称CRL1(CROWN ROOTLESS1)，其功能丧失突变表现为不能形成正常的不定根/ 从生根、生长素敏感性的丧失、根生长的向地性的丧失等表型，但地上部没有明显 的形态异常(Liu et al.，2005；Inukai et al.，2005)。最近研究也分离了水稻中的一个 LBD基因家族成员，初步命名为DH1(DEGENERATED HULL1)，dh1突变体呈现 颖花的颖壳缺失或颖壳发育的提前终止、雌雄蕊数目异常、部分雄性不育等表型； 过量表达DH1的转基因水稻表现为植株矮小、节间和颖花的枝梗缩短、叶片向下 低垂等表型(李爱宏，2006，私人通讯)。这些结果表明水稻中的LBD基因，与拟南 芥相比，在侧生器官的发育方面可能有着更加重要的作用。

VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研 究中。转录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为 转录抑制子。当转录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能， 从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。

发明内容

本发明提供一种水稻转录因子在改良水稻高产性状中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为 （VP16）₄-Linker-Os01g60960.1；

其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQ ID No.9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No.3所示；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；Os01g60960.1 为水稻转录因子Os01g60960.1。

所述水稻转录因子Os01g60960.1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

其中，(VP16)₄即VP64，是由4个VP16功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu）以Gly Ser两个氨基酸间隔融合在一起组成的增强子，其序列如SEQ ID No.10所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。

所述载体的构建方法如下：

（1）在植物转录因子数据库中找到Os01g60960.1基因，根据其序列设计PCR扩 增引物对，其为正向引物F：5'- CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3'和反向引物R：5'- CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3'；

（2）以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得Os01g60960.1全序列；

（3）将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因 完全相同的序列；

（4）以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64-Gateway表达单元、35S promoter-asRED表达单元和35S promoter-hyg 表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No.5所示；

（5）通过LR反应将Os01g60960.1构建到其目地基因的N端融合了VP64标签的植 物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得载体ubi：VP64-Os01g60960.1，载体全序列如 SEQ ID No.6所示。

携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach， 1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463 页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition）。

本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。

本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方 法，将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化， 转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻 植株。

本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻高产性状。

本发明还提供了用于扩增水稻转录因子Os01g60960.1基因的引物对，其为正向引 物F：5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3'和反向引物 R：5'-CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3'。

本发明还进一步提供水稻转录因子Os01g60960.1基因在调控水稻高产性状中的 应用。

前述的应用，是将水稻转录因子Os01g60960.1基因的CDS序列通过Gateway系统 构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻产量。

本发明首次利用转录因子激活基序VP64（即4个转录因子激活基序VP16）与水 稻转录因子Os01g60960.1基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而 改良水稻高产性状，提高水稻的产量。对于详细阐明调水稻高产机理具有重要的理 论价值，因此在生产实践中也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中nVP64-hyg-asRED载体图谱；

图2为本发明实施例1中ubi：VP64-Os01g60960.1载体图谱；

图3为本发明PCR检测VP64-Os01g60960.1转基因阳性株系，其中WT为野生型水 稻‘kitaake’，V2590H-24、V2590H-44为VP64-Os01g60960.1转基因水稻株系；

图4为本发明转基因材料高产性状的表型比较，其中左边第一盆WT为野生型水 稻‘kitaake’，左边第二盆V2590H-24、左边第三盆V2590H-44为转基因水稻株系；

图5为本发明转基因材料高产性状数据统计分析，其中WT为野生型水稻 ‘kitaake’，V2590H-24、V2590H-44为转基因水稻株系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验过程中所用到的载体来源：

pDONER购自invitrogen；

35S promoter-asRED中国农科院提供；

ubi promoter-VP64中国农科院提供；

35S promoter-hyg中国农科院提供；

ubi：VP64-Os01g60960.1通过Gateway克隆方法构建到ubi promoter-VP64载体上；

工程菌EHA105由中国农科院提供。

实施例1Os01g60960.1基因的分离和植物表达载体构建

在植物转录因子数据库中找到Os01g60960.1基因，根据其序列设计PCR扩增引 物，根据其序列设计PCR扩增引物（F1：5'- CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCCACAGAGAGGGAAAGAC-3'和反向引物R1：5'- CAAGAAAGCTGGGTCACCAAAGTATGCAGCATGCTC-3'）。以野生型日本晴水稻 总cDNA为模板，进行PCR获得Os01g60960.1全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1 所示。

按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮PCR， 第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F1和R1），而第二轮的模板 用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5'adaptor： 5'-GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3'adaptor： 5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将PCR产物克隆到连接 pDONER克隆载体（购自Invitrogen）上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序 列。通过LR反应将Os01g60960.1构建到nVP64-hyg-asRED（图1，载体全序列如SEQ ID No.5所示）上，获得载体ubi：VP64-Os01g60960.1（图2，载体全序列如SEQ ID No.6 所示）。

实施例2转基因水稻植株的获得

取水稻‘kitaake’成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织 为受体材料，采用农杆菌介导法将ubi：VP64-Os01g60960.1转入水稻愈伤组织中，用 含有100μM的乙酰丁香酮和O.D.值为0.7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液 浸泡过的愈伤组织置于共培养基上进行共培养，25℃暗培养3d后置于筛选培养基上 培养约30d，每10d继代一次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d， 每10d继代一次。将分化出绿色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长 出发达根系后炼苗，并计算转化所获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。

其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L 2,4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配 制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2,4D+0.5g/L谷氨酰 胺+0.6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L蔗糖，以水配制，调pH至5.2后加入植 物凝胶4g/L。灭菌后，50℃左右加入AS（乙酰丁香酮）100～200μg/mL。

筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2.5mg/L2, 4D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素（购自上海纽津生物 技术有限公司）。

分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0.05 mg/L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖， 以水配制，调pH至5.8～5.9后加入植物凝胶4g/L。

实施例3转基因阳性株系的鉴定

为了检测Os01g60960.1基因是否整合至水稻基因组中，分别提取野生型和转基 因水稻叶片DNA，在基因两端的植物表达载体上设计一段引物进行PCR反应，鉴定 转基因植株，对PCR产物进行检测，结果发现，转基因水稻均扩增出目的条带（图 3），而野生型水稻中无此目的条带，PCR产物经测序分析为正确的目的基因序列， 由此确定Os01g60960.1基因已通过农杆菌介导的方法插入到水稻基因组中。

实施例4转基因水稻表型分析和考种分析

将转基因和野生型水稻进行比较，从表型上可以明显的看出转基因植株比野生 型高，并且在花周期上表现出适当晚花（图4）。通过考种的数据分析结果可以明显 的看出转基因水稻的单株产量与野生型相比有明显的提高（图5）。其中一个株系野 生型的平均单株产量为7.25g，转基因植株的平均单株产量为13.61g。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。