公开/公告号CN103792375A
专利类型发明专利
公开/公告日2014-05-14
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申请/专利权人 华中科技大学同济医学院附属同济医院;
申请/专利号CN201410042817.5
申请日2014-01-29
分类号G01N33/74;A61K31/58;A61P11/06;
代理机构武汉开元知识产权代理有限公司;
代理人樊戎
地址 430000 湖北省武汉市解放大道1095号
入库时间 2024-02-19 23:58:24
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-07-07
授权
授权
2016-01-06
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/74 申请日:20140129
实质审查的生效
2014-05-14
公开
公开
技术领域
本发明属于医学领域,具体涉及支气管哮喘患者对吸入激素反应敏感 性的预测。
背景技术
支气管哮喘是常见的呼吸系统疾病,由于空气污染等因素,发病率逐渐 上升。支气管哮喘急性发作时可危及到患者的生命,是内科急危重症的重要 病种之一。目前治疗支气管哮喘的主要药物之一是吸入激素,但是临床实践 中发现,吸入激素仅对一部分哮喘病人有明显疗效,而对其余的哮喘病人没 有明显的治疗作用[参见:1.Szefler SJ,Martin RJ,King TS,Boushey HA, Cherniack RM,Chinchilli VM,Craig TJ,et al.Significant variability in response to inhaled corticosteroids for persistent asthma.J Allergy Clin Immunol.2002 Mar;109(3):410-8]。因此,寻找预测支气管哮喘患者对吸入激素反应敏感性 的生物标记物有重要的临床意义。
目前已有的可能预测哮喘患者对吸入激素反应敏感性的标记物是通过 纤维支气管镜刷片标本或者诱导痰标本中Th2相关基因(CLCA1,POSTN, SERPINB2)的表达水平的检测[参见:Woodruff PG,Modrek B,Choy DF,Jia G, Abbas AR,Ellwanger A,Koth LL,Arron JR,Fahy JV.T-helper type2-driven inflammation defines major subphenotypes of asthma.Am J Respir Crit Care Med.2009Sep1;180(5):388-95;Peters MC,Mekonnen ZK,Yuan S,Bhakta NR, Woodruff PG,Fahy JV.Measures of gene expression in sputum cells can identify T(H)2-high and T(H)2-low subtypes of asthma.J Allergy Clin Immunol.2013 Sep24.pii:S0091-6749(13)01209-8]。但是,纤维支气管镜刷片标本的检测 属于有创伤性检查,需要进行局部麻醉,然后在患者气道内插入纤维支气 管镜获取刷片标本,再提取刷片标本细胞中的RNA,通过RT-PCR的方法 检测相关基因的表达。因此通过纤维支气管镜刷片标本中相关基因的表达 水平检测来预测哮喘患者对激素敏感性的方法在哮喘患者中难以推广。诱 导痰的检测费时费力,每个哮喘患者收集一次诱导痰标本需要1小时左右 的时间,然后再分离诱导痰中的细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR的方 法检测相关基因的表达,因此该方法的使用也受到很大的限制。目前亟待 一种有效预测哮喘对吸入激素反应敏感性的无创简便的检测方法,同时又 有较高的敏感性和特异性的生物标记物。
发明內容
本发明的任务是提供一种哮喘分型的方法。本发明的另一个任务是提 供一种用于鉴别哮喘患者对激素治疗敏感性的生物学标记物,即寻找预测 支气管哮喘患者对吸入激素反应敏感性的有效而且无创快捷的新型生物标 记物。
本发明提供哮喘分型的方法是:检测哮喘患者外周血白细胞介素25 (interleukin-25,IL-25)的表达水平,外周血IL-25水平大于55pg/ml为激 素敏感型;外周血IL-25水平小于55pg/ml为激素不敏感型。激素敏感型患 者对吸入激素敏感,通过吸入激素治疗肺功能可以明显改善。激素不敏感 型患者吸入激素治疗肺功能无明显改善。本发明提供的预测支气管哮喘患 者对吸入激素反应敏感性的有效而且无创快捷的新型生物标记物是外周血 IL-25。
我们检测哮喘患者外周血IL-25的表达水平,并且把IL-25的表达与哮 喘患者对激素的反应性进行了系统的相关性分析,来评价IL-25能否成为鉴 别哮喘患者对激素治疗敏感性的生物学标记物。我们发现在使用吸入性激 素之后,IL-25水平高的哮喘患者肺功能改善明显,而IL-25表达低的哮喘 患者肺功能没有明显的改善。所以,检测哮喘患者外周血IL-25的水平,是 一种可以有效预测哮喘患者对吸入激素反应的新型生物标记物。而且,外 周血IL-25的检测属于无创检测,通过ELISA检测方法简便快捷。除此之 外,IL-25的抗体作为哮喘的治疗药物正在研制过程之中,外周血IL-25的 检测同样将指导IL-25抗体将来适用于哪些哮喘患者。
方法:
我们收集了32例健康对照者和79例哮喘患者。在签署知情同意书后, 所有对照和哮喘患者进行基础肺功能(FEV1%,PD20等)的测定,并且收 集外周血标本。哮喘患者给予吸入性糖皮质激素(ICS)布地奈德吸入 (200μg,一天两次)治疗8周,分别在第4周、第8周检测肺功能及收集 外周血,通过吸入性糖皮质激素治疗前后肺功能的改善程度来确定对哮喘 患者吸入性糖皮质激素的敏感性,并且对收集的外周血标本通过ELISA方 法进行IL-25的检测。然后对外周血IL-25水平与吸入性糖皮质激素治疗前 后肺功能的改善程度之间的关系。
外周血IL-25的ELISA测定方法如下:
标本收集:
1.收集血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。
2.血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血,高血脂标本。
3.标本应清澈透明,悬浮物应离心去除。
4.标本收集后若不及时检测,按一次使用量分装,冻存于-20℃, -70℃电冰箱内,避免反复冻融,3-6月内检测。
检测前准备工作:
1.提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温。
2.用双蒸水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。
3.标准品:加入标准品&标本通用稀释液1.0ml至冻干标准品中,静置 15分钟,待其充分溶解后,轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)。然后根据需要进 行稀释。(标准曲线使用以下浓度:2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、 0pg/ml)。复溶标准品原液(2000pg/ml)若未用完的废弃。
4.生物素化抗体工作液:按当次试验所需要得用量,使用前20分钟, 用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。当日使 用。
5.酶结合物工作液:按当次试验所需要的用量,使用前20分钟,用酶 结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液。当日使用。
操作步骤:
1.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。
2.空白孔加标准品&标本通用稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓 度标准品(100ul/孔),用封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育90分钟。
3.提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4.洗板5次。
5.空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液 (100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱孵育60分钟。
6.提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25℃)放置。
7.洗板5次。
8.空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。 用新封板胶纸封住反应孔,36℃孵箱,避光孵育30分钟。
9.打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序。
10.洗板5次。
11.加入显色底物(TMB)100ul/孔,避光36℃孵箱,避光孵育15分钟。
12.加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。
结果判断:
1.每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。
2.以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,手工绘制或用软件绘制标 准曲线。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
3.若标本OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应 乘以稀释倍数。
结果:与正常对照组相比,部分哮喘患者外周血IL-25水平明显升高 (>55pg/ml),我们称为“IL-25高”哮喘患者。部分哮喘患者外周血IL-25 水平与正常对照组在相同范围内(≤55pg/ml),我们称为“IL-25低”哮喘 患者(参见附图1)。外周血IL-25水平高(>55pg/ml)的哮喘患者肺功能 明显改善,FEV1增加0.35-0.37L,PD20增加0.50-0.52mg。而外周血IL-25 水平低(≤55pg/ml)的哮喘患者肺功能没有明显改善,FEV1仅增加 0.11-0.12L,PD20仅增加0.03-0.04mg(参见附图2和3)。
结论:外周血IL-25水平是预测哮喘患者对吸入激素反应敏感性的新型 生物标记物。如果外周血IL-25水平大于55pg/ml,该患者对吸入激素敏感, 通过吸入激素治疗肺功能可以明显改善;如果IL-25水平小于55pg/ml,该 患者对吸入激素不敏感,通过吸入激素治疗肺功能无明显改善,应当采取 除吸入激素外的其他治疗方法,如白三烯受体拮抗剂等。
本发明揭示外周血IL-25水平是预测哮喘患者对吸入激素反应敏感性 的新型生物标记物。如果外周血IL-25水平大于55pg/ml,该患者对吸入激 素敏感,通过吸入激素治疗肺功能可以明显改善;如果IL-25水平小于 55pg/ml,该患者对吸入激素不敏感,通过吸入激素治疗肺功能无明显改善, 应当采取除吸入激素外的其他治疗方法,如白三烯受体拮抗剂等。本发明 相比现有技术具有如下优点:本发明证实了外周血IL-25可以做为预测支气 管哮喘患者对吸入性糖皮质激素敏感性的新型生物标记物,该指标为无创 快捷和有效的检测方法,比现有技术具有显著的进步。
本发明结果揭示:如果支气管哮喘患者外周血IL-25的水平低于 55pg/ml,则认为是激素不敏感型哮喘,即“IL-25低”的哮喘患者,不适宜使 用吸入性糖皮质激素治疗,建议使用其他治疗方法,如白三烯受体拮抗剂 等。本发明支气管哮喘分型方法,可以快速预测哪些支气管哮喘患者适合 采用吸入性糖皮质激素进行治疗,提高支气管哮喘的治疗效果。
根据本发明结果,得到了一种治疗哮喘方法,该方法是对外周血IL-25 水平大于55pg/ml的哮喘患者施以吸入性糖皮质激素治疗。具体可以使用布 地奈德每次200μg,一天两次,疗程为24周。
附图说明
图1.正常对照组和哮喘患者外周血IL-25水平检测结果。与正常对照 组相比,部分哮喘患者外周血IL-25水平明显升高(>55pg/ml,IL-25高哮 喘患者),部分哮喘患者外周血IL-25水平与正常对照组在相同范围内 (≤55pg/ml,IL-25低哮喘患者)。
图2.IL-25高和IL-25低的哮喘患者使用吸入激素后肺功能FEV1的变 化。通过检测IL-25高哮喘组(>55pg/ml)、IL-25低哮喘组(≤55pg/ml)在 使用吸入激素前(0)和使用吸入激素4周和8周后肺功能FEV1的变化, 结果显示:与IL-25-low哮喘组相比,IL-25-high哮喘组在使用吸入激素4 周和8周后肺功能FEV1的改善更加显著(P<0.05)。
图3.IL-25高和IL-25低的哮喘患者使用吸入激素后肺功能PD20的变 化。通过检测IL-25高哮喘组、IL-25低哮喘组在使用吸入激素前(0)和使 用吸入激素4周和8周后肺功能PD20的变化,结果显示:与IL-25低哮喘 组相比,IL-25高哮喘组在使用吸入激素4周和8周后肺功能PD20的改善 更加显著(P<0.05)。
具体实施方式
实施例1
对哮喘专科医生确诊为支气管哮喘的79例患者,抽取患者外周血2ml, 通过ELISA方法测定患者外周血IL-25的水平,其中38例外周血IL-25的 水平高于55pg/ml(“IL-25高”),定为激素敏感型哮喘,对这38例激素敏 感型哮喘患者进行吸入性糖皮质激素治疗,使用布地奈德(200μg,一天两 次)治疗8周。外周血IL-25高的哮喘患者在治疗后肺功能明显改善,FEV1 增加0.35-0.37L,PD20增加0.50-0.52mg(参见附图2和3)。
其余41例外周血IL-25的水平低于55pg/ml(“IL-25低”),定为激素不 敏感型哮喘,对这41例激素不敏感型哮喘患者进行吸入性糖皮质激素治疗, 使用布地奈德(200μg,一天两次)治疗8周,治疗后肺功能改善不明显, FEV1仅增加0.11-0.12L,PD20仅增加0.03-0.04mg(参见附图2和3)。
机译: 外周血白细胞介素25水平在哮喘分类中的应用及分类方法
机译: 诊断人类个体中癌症可持续性的方法,确定用于评估癌症敏感性的标记物,对核酸样品进行基因分型,以评估人类中是否存在不纯的水,并确定患者的治疗过程个体,以评估个体对癌症的敏感性,使用寡核苷酸探针,计算机可识别的介质,以及在指示剂中指示指示剂的装置。 。
机译: 寡核苷酸的应用及方法在红细胞系统基因组分型中的应用