法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-04-12
授权
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2015-11-18
专利申请权的转移 IPC(主分类):A61K31/7048 登记生效日:20151026 变更前: 变更后: 申请日:20140423
专利申请权、专利权的转移
2014-09-17
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/7048 申请日:20140423
实质审查的生效
2014-08-20
公开
公开
技术领域
本发明涉及黄芩苷在制备治疗急性溶血性尿毒综合征药物中的应用，属于医药领域。
背景技术
黄芩苷(Baicalin)是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有明显的抗真菌 活性，尤其对酵母型真菌具选择性作用，最低抑菌浓度(MIC)在70-100μg/ml之间。但未见 黄芩苷用于治疗由大肠杆菌引起的急性溶血性尿毒综合征的报道。
急性溶血性尿毒综合征通常是由大肠杆菌分泌的II型志贺毒素引起的肾脏损伤，通常是 严重的并发症，一般在老年人和儿童较容易发病，病死率极高。近年来由于抗生素的大量使 用导致大肠杆菌耐药菌株越来越多，临床上对大肠杆菌感染的治疗面临严峻的挑战，而通常 抗生素能够促进耐药性大肠杆菌II型志贺毒素的分泌，进而导致疾病的进一步加重。因此， 寻找新型、安全的治疗药物迫在眉睫。黄芩苷是来源于我国传统中药材黄芩、木蝴蝶等的成 分，本发明研究证实了黄芩苷对大肠杆菌II型志贺毒素，尤其是耐药性大肠杆菌II型志贺毒 素引起的急性溶血性尿毒综合征具有较好的治疗效果。
发明内容
黄芩苷的分子结构如下：
本发明发现了黄芩苷对大肠杆菌II型志贺毒素引起的急性溶血性尿毒综合征具有较好的 治疗效果。尤其是耐药性大肠杆菌II型志贺毒素引起的急性溶血性尿毒综合征具有更好的治 疗效果。
本发明同时提供了黄芩苷在制备治疗急性溶血性尿毒综合征药物中的应用。
本发明技术方案优选黄芩苷在制备由大肠杆菌II型志贺毒素引起的急性溶血性尿毒综合 征药物中的应用。
本发明可将黄芩苷和药学上可接受的辅料制备成各种剂型。本发明所述药物，包括药学 上可接受的任何剂型。
本发明优选将黄芩苷制备成注射剂、胶囊、片剂、粉针剂等剂型。
本发明与用抗生素治疗相比较，使用黄芩苷治疗具有无耐药性，治愈率高的优点。
附图说明
图1.分子对接发现黄芩苷结合于Stx2A亚基酶活性中心(左图为黄芩苷与Stx2的结合方式， 右图为黄芩苷与Stx2的结合位点)。
图2.复合物体系自由能贡献分析(横轴为氨基酸种类，纵轴为自由能变化；Etotal为总结合 能，Evdw为范德华力，Eele为静电作用力，Esol为非极性溶剂化能)。
图3.黄芩苷诱导蓖麻毒素A亚基形成多聚体。
图4.黄芩苷对小鼠急性尿毒综合征存活率的影响(横坐标为观察时间，纵坐标为存活率，d 的单位为天，PBS为阴性对照组，Stx为感染未给药组，Stx+BAI为给药组)。
图5.注射黄芩苷后急性尿毒综合征小鼠肾脏病理组织学变化(PBS为阴性对照组，Stx为感 染未给药组，Stx+BAI为给药组)。
图6.黄芩苷对急性尿毒综合征小鼠肾功能的影响(横坐标为处理方式，纵坐标为浓度，Con 为阴性对照组，Stx+BAI为给药组，Stx为感染未给药组)。
具体实施方式
通过对Hela细胞的保护作用以及小鼠性溶血性尿毒综合征模型证实了黄芩苷治疗II型志 贺毒素感染的作用。
1.黄芩苷对Hela细胞的保护作用
将培养的Hela细胞以每孔15000个细胞铺到96孔细胞培养板中，培养24小时完全贴壁后每 孔加入纯化的II型志贺毒素50pg，并加入不同梯度的黄芩苷溶液，置于CO2培养箱中培养72小 时后离心去除细胞培养液上清检测其乳酸脱氢酶释放量，通过乳酸脱氢酶释放评价其对细胞 的保护作用。结果显示黄芩苷能显著抑制II型志贺毒素导致的Hela细胞毒性作用，并呈现剂量 依赖性。加入不同浓度的黄芩苷后Hela细胞的存活率如下表1：
表1.黄芩苷对II型志贺毒素导致的Hela细胞毒性的抑制作用
2.黄芩苷抗II型志贺毒素机制分析及靶点确证
应用分子模拟和对接发现黄芩苷能结合到II型志贺毒素的活性口袋中，从而抑制了其 活性的发挥，通过分解复合物体系的自由能，发现对复合物体系自由能贡献较大的氨基酸是 77位酪氨酸和204位精氨酸。进一步将得到的数据应用点突变技术和荧光淬灭技术进行验证， 结果发现计算机模拟结果和验证结果一致。黄芩苷结合到II型志贺毒素的77和204位的氨 基酸导致其失去酶活性从而抑制了其活性作用的发挥，黄芩苷与II型志贺毒素结合位点见图 1，结合能分析见图2。
3.结构生物学靶点确证
本研究得到了II型志贺毒素结构和功能类似蛋白蓖麻毒素A亚基的晶体，并解析了蓖麻 毒素A亚基和黄芩苷复合物的晶体结构，通过结构分析发现黄芩苷促使蓖麻毒素A亚基形成 多聚体而失去活性(附图3)，黄芩苷与蓖麻毒素A亚基的结合位点为R189,T190,R193,Y194, R235和R258；通过序列比对发现，黄芩苷与II型志贺毒素的结合位点为R179,Q180,S183, E184和V218。
4.小鼠急性溶血性尿毒综合征实验治疗学研究
4.1小鼠急性溶血性尿毒综合征模型
BALB/C小鼠(雄性，18-22g)经乙醚麻醉后，经腹腔给予纯化的II型志贺毒素蛋白，小 鼠平躺直至苏醒，建立小鼠急性溶血性尿毒综合征模型。存活率试验、病理学试验及肾功能 评价试验给予50ng纯化的II型志贺毒素蛋白。
4.2保护率试验
保护率试验分为三组，每组20只BALB/C雄性小鼠，灭菌PBS为阴性对照组，Stx为感 染未给药组，Stx+BAI为治疗组。给药组小鼠在注射II型志贺毒素蛋白6h后皮下注射200mg/kg 的黄芩苷，每6h给药一次，共给药96h。阳性对照组(Stx组)注射毒素后给予100μl的灭 菌PBS，统计其存活率。结果表明，经黄芩苷处理后，显著提高小鼠急性溶血性尿毒综合征 的存活率，见图4。
4.3病理组织学实验
试验分为三组，每组20只BALB/C雄性小鼠，灭菌PBS为阴性对照组，Stx为感染未给药组，Stx+BAI 为治疗组。给药组小鼠在注射II型志贺毒素蛋白6h后皮下注射200mg/kg的黄芩苷，每6h给药一 次，共给药72h。阳性对照组(Stx组)给与100μl的灭菌PBS，每组10只小鼠，感染72小时后 将小鼠麻醉致死取肾脏做病理切片观察其病理变化。结果发现，阳性对照组小鼠肾脏有出血， 肾小管上皮细胞有大量细胞脱落，肾小球消失；而给药组肾组织仅有少量出血，与正常组小 鼠比较无明显差异；见图5。
4.4肾功能评价试验
试验分为三组，每组20只BALB/C雄性小鼠，灭菌PBS为阴性对照组，Stx为感染未给药组，Stx+BAI 为治疗组。给药组小鼠在注射II型志贺毒素蛋白6h后皮下注射200mg/kg的黄芩苷，每6h给药一 次，共给药72h。阳性对照组(Stx组)给与100μl的灭菌PBS，每组10只小鼠。通过评价小鼠 血清中肌酐、尿素氮的含量来评价黄芩苷对模型小鼠肾功能的改善。结果发现，给药组肌酐、 尿素氮含量与阴性对照组小鼠比较无显著差异(P>0.05)，而阳性组小鼠与阴性组则差异极显著 (P<0.01)，见图6。
机译： 黄ICAL苷在药物治疗急性溶血性尿毒症综合征中的应用
机译： 黄ICAL苷在药物治疗急性溶血性尿毒症综合征中的应用
机译： 黄ical苷在制备治疗急性溶血性尿毒症综合征的药物中的用途
