大豆事件pDAB9582.814.19.1和pDAB4468.04.16.1的昆虫抗性和除草剂耐受性育种叠加

发明背景

编码Cry1F和Cry1Ac synpro(Cry1Ac)的基因能够对转基因植物赋予昆虫 抗性，例如对鳞翅目(lepidopteran)昆虫的抗性；而编码PAT(膦丝菌素乙酰转 移酶)的基因能够对转基因植物赋予对除草剂膦丝菌素(草丁磷)的耐受性。 PAT已经在大豆中成功表达，既在生成昆虫抗性转基因作物中用作选择标志 物，又在转基因作物中赋予对除草剂草丁磷的商业水平的耐受性。编码 AAD-12(芳氧基烷羧酸酯/盐双加氧酶-12(aryloxyalkanoate dioxygenase-12)) 的基因在转基因植物中表达时能够赋予对苯氧基乙酸除草剂、2,4-D和 MCPA，和吡啶基氧乙酸(pyridyloxyacetic acid)除草剂，定草酯(triclopyr)和氟 草烟(fluroxypyr)的商业水平的耐受性。

已知外来基因在植物中的表达受到其在植物基因组中位置影响，这可能 是由于染色质结构(例如异染色质)或整合位点附近的转录调节元件(例如增 强子)的接近性所致(Weising等,Ann.Rev.Genet22:421-477,1988)。同时，转 基因在基因组中不同位置处的存在会以不同方式影响植物的总体表型。出于 此原因，经常有必要筛选大量事件以鉴定以引入的感兴趣基因的最佳表达为 特征的事件。例如，在植物中及在其它生物体中已经观察到事件间可以有引 入基因的表达水平的较宽变化。还可以有表达的空间或时间方式的差异，例 如转基因在各种植物组织中的相对表达差异，其不能对应于从引入的基因构 建体中存在的转录调节元件预期的方式。出于此原因，常见的是生成数百至 数千个不同事件，并且对那些事件筛选具有对于商业目的期望的转基因表达 水平和方式的单一事件。具有期望的转基因表达水平或方式的事件可用于将 转基因渐渗(introgress)入其它遗传背景中，其通过使用常规育种方法的有性 异性杂交(outcrossing)进行。此类杂交的后代维持初始转化体的转基因表达特 征。此策略用于确保完全适合于地方生长条件的多种品种的可靠基因表达。

期望能够检测特定事件或多种事件的存在以测定有性杂交的后代是否 含有转基因或感兴趣转基因的组。另外，用于检测特定事件或多种事件的方 法会有助于例如遵守要求自重组作物植物衍生的食物的销售前批准和标签 的规则，或者有助于用于环境监测，监测田间作物的性状，或者监测自作物 收获物衍生的产品，以及用于确保服从管理或合同条款的各方的顺应性。

有可能通过本领域中已知的任何核酸检测方法，包括但不限于聚合酶链 式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交来检测一种或多种转基因事件的存 在。这些检测方法一般聚焦于常用的遗传元件，诸如启动子、终止子、标志 物基因，等等，因为对于许多DNA构建体，编码区是可互换的。因此，此类 方法可能不可用于区别不同事件，特别是使用相同DNA构建体或非常相似的 构建体生成的那些事件，除非与插入的异源DNA相邻的侧翼DNA的DNA序 列是已知的。例如，对于玉米事件DAS-59122-7，事件特异性PCR测定法记 载于美国专利申请2006/0070139。会期望具有用于鉴定育种叠加(breeding  stack)大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的简单且有区别力的 方法。

发明概述

本发明涉及新的昆虫抗性和除草剂耐受性转基因大豆育种叠加事件，称 作大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1。此育种叠加包含插入大 豆细胞基因组内的特定位点中的如本文中描述的cry1F，cry1Ac和pat，和如 本文中和国际专利申请No.WO/2012/075426中描述的aad-12和pat。代表性大 豆种子已经以段落[0021]中标识的登录号保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。含有此事件的大豆植物的DNA包含本文中描述的接合(junction)/侧 翼序列，其表征大豆基因组内插入DNA的位置。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:15诊断大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1。更具 体而言，SEQ ID NO:1的bp1400/1401，bp1536/1537，SEQ ID NO:2的bp 152/153，SEQ ID NO:15的bp2730/2731，和SEQ ID NO:15的bp9121/9122处 接合周围的序列诊断大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1。下文 段落[00012]描述了包含含有大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的大豆DNA特征性的这些接合的序 列的例子。

在一个实施方案中，本发明提供了大豆植物或其部分，其对大豆夜蛾 (Pseudoplusia includens)(大豆尺蠖(soybean looper))有抗性，并且具有包含一 种或多种选自下组的序列的基因组：SEQ ID NO:1的bp1385-1415；SEQ ID  NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1的bp 1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；和SEQ ID  NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:15的bp 2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930； SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221；和SEQ ID  NO:15的bp8921-9321及其互补物。在另一个实施方案中，本发明提供了此 类植物的种子。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种控制昆虫的方法，其包括将昆 虫暴露于昆虫抗性大豆植物，由此以控制所述昆虫，其中所述大豆植物具有 含有一种或多种选自下组的序列的基因组：SEQ ID NO:1的bp1385-1415； SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1 的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；和 SEQ ID NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:15的 bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930； SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221；和SEQ ID  NO:15的bp8921-9321及其互补物；所述序列是大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1存在特征性的。大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中cry1F v3(cry1F)和cry1Ac synpro (cry1Ac)基因的存在赋予对例如大豆夜蛾(大豆尺蠖)，黎豆夜蛾(Anticarsia  gemmatalis)(黎豆毛虫(velvet bean caterpillar))，夜小卷蛾(Epinotia aporema)， Omoides indicatus，薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu)，草地夜蛾(Spodoptera  frugiperda)，Spodoptera cosmoides，南方灰翅夜蛾(Spodoptera eridania)，烟 芽夜蛾(Heliothis virescens)，美洲棉铃虫(Heliocoverpa zea)，Spilosoma  virginica和南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)的抗性。

在一个实施方案中，本发明提供了大豆植物，或其部分，其对苯氧乙酸 除草剂诸如2,4-D和MCPA有耐受性。在另一个实施方案中，本发明提供了大 豆植物，或其部分，其对吡啶基氧乙酸除草剂诸如定草酯和氟草烟有耐受性。 在这些实施方案中，大豆植物具有基因组，该基因组包含一种或多种选自下 组的序列：SEQ ID NO:1的bp1385-1415；SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ  ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp 137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；SEQ ID NO:2的bp3-303；和一种或多 种选自下组的序列：SEQ ID NO:15的bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp 2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930；SEQ ID NO:15的bp9071-9171； SEQ ID NO:15的bp9021-9221；及SEQ ID NO:15的bp8921-9321及其互补物。 在另一个实施方案中，本发明提供了此类植物的种子。

在另一种实施方案中，本发明提供了控制大豆作物中的杂草的方法，其 包括应用苯氧基乙酸除草剂诸如2,4-D和MCPA。在另一个实施方案中，本发 明提供了控制大豆作物中的杂草的方法，其包括对大豆作物应用苯氧基乙酸 除草剂，诸如定草酯和氟草烟，其中大豆作物包含具有基因组的大豆植物， 所述基因组含有一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp1385-1415； SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1 的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；SEQ  ID NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:15的bp 2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930； SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221；和SEQ ID  NO:15的bp8921-9321及其互补物。育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1中aad-12基因的存在赋予对苯氧基乙酸除草剂和吡啶基氧 乙酸除草剂的耐受性。

在另一个实施方案中，本发明提供了控制大豆作物中杂草的方法，其包 括对大豆作物应用草丁磷除草剂，所述大豆作物包含具有基因组的大豆植 物，所述基因组含有一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp 1385-1415；SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ  ID NO:1的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp 103-203；和SEQ ID NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID  NO:15的bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp 2530-2930；SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221； 和SEQ ID NO:15的bp8921-9321及其互补物，其诊断大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的存在。大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中pat v6(pat)基因的存在赋予对草丁 磷除草剂的耐受性。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种检测包含大豆DNA的样品中大 豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引物 接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1-1400或其互补物内的侧 翼序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:1的bp1401-1836或其互补物内 的插入物序列；并测定所述引物间生成的扩增子；或

(b)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引 物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp1-152或其互补物内的插 入物序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:2的bp153-1550或其互补物 内的侧翼序列；或

(c)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引 物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:15的bp2731-9121或其互补物 内的插入物序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:15的bp1-2730或其 互补物内的侧翼序列；或

(d)使所述样品与长度至少10bp的第一引物和长度至少10bp的第二引 物接触，所述第一引物选择性结合SEQ ID NO:15的bp2731-9121或其互补物 内的插入物序列，所述第二引物选择性结合SEQ ID NO:15的bp9122-10,198 或其互补物内的侧翼序列；和

(c)(e)测定所述引物间生成的扩增子。

在另一个实施方案中，本发明提供了检测大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的方法，其包括：

(a)使所述样品与第一引物和第二引物；及第三引物和第四引物接触， 所述第一引物选择性结合选自下组的侧翼序列：SEQ ID NO:1的bp1-1400和 SEQ ID NO:2的bp153-1550及其互补物，所述第二引物选择性结合SEQ ID  NO:3或其互补物；所述第三引物选择性结合SEQ ID NO:15的bp1–2730和 SEQ ID NO:15的bp9122–10,198的侧翼序列及其互补物，所述第四引物选择 性结合SEQ ID NO:15的2731–9121的插入物序列及其互补物。

(b)将所述样品进行聚合酶链式反应处理；并

(c)测定所述引物间生成的扩增子。

在另一个实施方案中，本发明提供了对大豆植物育种的方法，其包括： 将第一植物与第二大豆植物杂交以生成第三大豆植物，所述第一植物包含 DNA，该DNA包含一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:1的bp 1385-1415；SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ  ID NO:1的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp 103-203；和SEQ ID NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID  NO:15的bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp 2530-2930；SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221； 和SEQ ID NO:15的bp8921-9321及其互补物；并对所述第三大豆植物测定包 含一种或多种选自下组的序列的DNA的存在：SEQ ID NO:1的bp1385-1415； SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1 的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；SEQ  ID NO:2的bp3-303，SEQ ID NO:15的bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp 2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930；SEQ ID NO:15的bp9071-9171； SEQ ID NO:15的bp9021-9221；及SEQ ID NO:15的bp8921-9321及其互补物。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的分离的DNA分子。在SEQ ID NOS: 1、2、和15外，此类分子包括包含SEQ ID NO:1的bp1400-1401和SEQ ID NO:1 中相对于bp1400/1401接合的每个方向的至少10bp且长度至少25bp的分子； 包含SEQ ID NO:2的152–153和SEQ ID NO:2中相对于bp152/153接合的每 个方向的至少10bp且长度至少25bp的扩增子；包含SEQ ID NO:15的bp2730 –2731和SEQ ID NO:15中相对于bp2730/2731接合的每个方向的至少10bp且 长度至少25bp的扩增子；包含SEQ ID NO:15的bp9121–9122和SEQ ID  NO:15中相对于bp9121/9122接合的每个方向的至少10bp且长度至少25bp的 扩增子。例子是SEQ ID NO:1的bp1385-1415；SEQ ID NO:1的bp1350-1450； SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1的bp1200-1600；SEQ ID NO:2 的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；和SEQ ID NO:2的bp3-303；SEQ  ID NO:15的bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的 bp2530-2930；SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221； 和SEQ ID NO:15的bp8921-9321，及其互补物。

在另一个实施方案中，本发明提供了控制大豆谷粒、种子或种子粗粉中 的有害生物的方法，其包括在所述谷粒、种子或种子粗粉中包含大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1，如由包含一种或多种选自下组的序 列的DNA的所述谷粒、种子或种子粗粉证明的：SEQ ID NO:1的bp1385-1415； SEQ ID NO:1的bp1350-1450；SEQ ID NO:1的bp1300-1500；SEQ ID NO:1 的bp1200-1600；SEQ ID NO:2的bp137-168；SEQ ID NO:2的bp103-203；和 SEQ ID NO:2的bp3-303；和一种或多种选自下组的序列：SEQ ID NO:15的 bp2680-2780；SEQ ID NO:15的bp2630-2830；SEQ ID NO:15的bp2530-2930； SEQ ID NO:15的bp9071-9171；SEQ ID NO:15的bp9021-9221；和SEQ ID  NO:15的bp8921-9321及其互补物。

本发明还包括含有大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的 大豆植物细胞和植物部分，包括但不限于花粉、胚珠、花、枝条(shoot)、根、 和叶，及营养细胞的核、花粉细胞、种子和种子粗粉、和卵细胞。

在一些实施方案中，可以将育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1与其它性状组合，所述性状包括例如其它除草剂耐受性基 因和/或昆虫抑制性蛋白质和转录调节序列(即RNA干扰，dsRNA，转录因子， 等等)。可以经由植物育种，含有育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1的转基因植物的再转化，或通过靶向整合添加新性状将别 的性状叠加到植物基因组中。

其它实施方案包括切割包含育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1(包括例如pat基因表达盒)的多核苷酸序列。在切割多核苷 酸序列后，可以将经修饰的事件在特定的染色体位置再靶向，其中别的多核 苷酸序列与育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1叠加。

在一个实施方案中，本发明涵盖位于染色体02上在SEQ ID NO:1和2中列 出的侧翼序列之间的大豆染色体靶位点。

在一个实施方案中，本发明涵盖位于染色体04上在SEQ ID NO:15中所列 的侧翼序列间的大豆染色体靶位点。

在一个实施方案中，本发明涵盖生成转基因大豆植物的方法，其包括在 染色体02上在SEQ ID NO:1和2中列出的基因组序列之间，即SEQ ID NO:1的 bp1-1400和SEQ ID NO:2的bp153-1550之间的位置处插入异源核酸。

在一个实施方案中，本发明涵盖生成转基因大豆植物的方法，其包括在 染色体04上在SEQ ID NO:15中所列的基因组序列间，即SEQ ID NO:15的bp 1-2730和SEQ ID NO:15的bp9122–10,198之间的位置处插入异源核酸。

另外，本发明提供了用于检测(例如大豆)样品中的主题事件的存在的测 定法。测定法可以基于插入大豆基因组中的重组构建体的DNA序列，以及基 于在插入位点侧翼的基因组序列。还提供了可用于进行测定法的试剂盒和条 件。

本发明部分涉及源自在转基因大豆系中插入来自pDAB9582和 pDAB4468的T-DNA的边界区的DNA序列的克隆和分析。这些序列是独特的。 基于插入物和接合序列，可以生成事件特异性引物。PCR分析证明了这些事 件可以通过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来鉴定。如此， 这些和其它相关规程可以用于独特鉴定包含本发明事件的大豆系。

种子保藏

作为本公开内容的一部分，包含大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆系 的至少2500粒种子和包含大豆事件pDAB4468.04.16.1的大豆系的2500粒种 子已经保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC),10801University Boulevard, Manassas,VA,20110，并且公众不受限制地可得到(但是服从专利权)。保藏 物，称为ATCC保藏No.PTA-10442(pDAB4468.04.16.1)和ATCC保藏No. PTA-12006(pDAB9582.814.19.1)分别于2009年10月22日和2011年7月21日代 表Dow AgroSciences LLC生成。生成这些保藏物，并且为了专利规程的目的 就种子保藏物而言会依照布达佩斯条约的条款或者在布达佩斯条约的条款 下维持。

序列简述

SEQ ID NO:1是大豆事件pDAB9582.814.19.1的5’DNA侧翼边界序列。 核苷酸1-1400是基因组序列。核苷酸1401-1535是来自pDAB9582的重排序列。 核苷酸1536-1836是插入物序列。

SEQ ID NO:2是大豆事件pDAB9582.814.19.1的3’DNA侧翼边界序列。 核苷酸1-152是插入物序列。核苷酸153-1550是基因组序列。

SEQ ID NO:3是pDAB9582的DNA序列，其在下文表1中注释。

SEQ ID NO:4是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 81419_FW3。

SEQ ID NO:5是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 81419_RV1。

SEQ ID NO:6是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 81419_RV2。

SEQ ID NO:7是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 81419_RV3。

SEQ ID NO:8是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 5’IREnd-01。

SEQ ID NO:9是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 5’IREnd-02。

SEQ ID NO:10是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 AtUbi10RV1。

SEQ ID NO:11是用于确认5'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 AtUbi10RV2。

SEQ ID NO:12是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 3’PATEnd05。

SEQ ID NO:13是用于确认3'边界基因组DNA的寡核苷酸引物 3’PATEnd06。

SEQ ID NO:14是大豆事件9582.814.19.1的确认序列。包括5’基因组侧翼 序列，pDAB9582T链插入物，和3’基因组侧翼序列。

SEQ ID NO:15是大豆事件pDAB4468.04.16.1的确认序列。包括5’基因组 侧翼序列，pDAB4468T链插入物，和3’基因组侧翼序列。

附图简述

图1是含有cry1F、cry1Ac和pat表达盒的pDAB9582的质粒图。

图2描绘了用于确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的5’和3’边界序列的引 物位置。

图3描绘了大豆事件pDAB9582.814.19.1中的基因组序列重排。

发明详述

已经对大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1插入的侧翼序列 测序并表征。开发出事件特异性测定法。还已经将其定位至大豆基因组(大 豆基因组02和04)。可以将事件一起渐渗入别的良种系中。

如上文在发明部分中提到的，对植物基因组中引入并整合转基因牵涉一 些随机事件(因此名称“事件”代表表达的给定插入)。也就是说，凭借许多转 化技术诸如土壤杆菌(Agrobacterium)转化，生物射弹转化(即基因枪)，和碳 化硅介导的转化(即WHISKERSTM)，不可预测在基因组中转基因会在何处被 插入。如此，鉴定插入物两侧的侧翼植物基因组DNA对于鉴定具有给定插入 事件的植物可以是重要的。例如，可以设计PCR引物，其生成穿过插入物和 宿主基因组的接合区的PCR扩增子。可以使用此PCR扩增子来鉴定独特的或 不同类型的插入事件。

本文中提供的定义和实例是为了帮助描述本发明并指导本领域一般技 术人员实施本发明。除非另有记录，应根据相关领域的一般技术人员的常规 用法来理解术语。使用如列于37CFR§1.822的DNA碱基命名法。

如用于本文，术语“后代”指包含育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1:: pDAB4468.04.16.1的亲本植物的任何世代的后代。

转基因“事件”是通过用异源DNA，即包含感兴趣的转基因的核酸构建体 转化植物细胞，重新产生由将所述转基因插入植物基因组所得的植物群体， 并选择由插入特定基因组位置所表征的特定植物来产生。术语“事件”指含有 所述异源DNA的起始转化体和转化体后代。术语“事件”还指通过转化体和含 有基因组/转基因DNA的另一品种之间的有性异型杂交(outcross)产生的后 代。即使在与回归(recurrent)亲本的反复回交之后，插入的转基因DNA和来 自转化的亲本的侧翼基因组DNA(基因组/转基因DNA)仍存在于杂交后代的 相同染色体位置处。术语“事件”还指来自包含插入的DNA和直接邻接插入的 DNA的侧翼基因组序列的起始转化体及其后代的DNA，期待其会转移至下 述后代，所述后代作为一个含有所述插入的DNA的亲本系(例如起始转化体 和其自交所得的后代)和不含有该插入的DNA的亲本系有性杂交的结果而接 受了含有感兴趣的转基因的插入的DNA。

“接合序列”或“边界序列”跨越了插入基因组的DNA与来自插入点侧翼 的大豆天然基因组的DNA连接的点，其中植物基因物质中一种或其他接合序 列的鉴定或检测足以对所述事件具诊断性。包括了跨越本文中所述的大豆事 件中的插入和类似长度的侧翼DNA的DNA序列。本文中提供了此类诊断性 序列的具体实例；然而，其他与插入的接合或插入和基因组序列的接合重叠 的序列也具诊断性，并可根据本发明使用。

本发明部分涉及使用此类侧翼、接合和插入物序列的事件鉴定。本发明 包括相关的PCR引物和扩增子。根据本主题发明，使用跨越插入的DNA及其 边界的扩增子的PCR分析方法可用于检测或鉴定商业化的转基因大豆品种 或来源于本主题专利的转基因玉米品系的品系。

侧翼/接合序列诊断出育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1。基于这些序列，生成事件特异性引 物。PCR分析证明了可通过对用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子的 分析来在不同的玉米基因型中鉴定这些大豆品系。如此，这些和其他相关规 程可用于独特地鉴定这些玉米品系。本文中鉴定的序列是独特的。

本主题发明的检测技术特别地可与植物育种一同使用，以确定在为了将 一种或多种其他感兴趣的性状赋予后代，将包含感兴趣的事件的亲本植物与 另一种植物品系杂交之后，哪些后代植物包含给定事件。这些PCR分析方法 有利于大豆育种项目以及质量控制，特别是对于商业化转基因大豆种子。现 在亦可制备并使用用于这些转基因大豆品系的PCR检测试剂盒。这亦可帮助 产品登记和产品管理。

此外，可使用侧翼大豆/基因组序列以特异性鉴定每个插入物的基因组位 置。该信息可用于制作特异于每一个事件的分子标志物系统。这些可用于加 速育种策略和构建连锁数据。

此外，可使用侧翼序列信息以研究和表征转基因整合过程，基因组整合 位点特征，事件分选，转基因及其侧翼序列的稳定性，和基因表达(特别涉 及基因静默，转基因甲基化样式，位置效应，和潜在的表达相关元件，如 MARS(基质连接区)等)。

对于所有主题公开，应显而易见本主题发明包括以段落[0021]中标识的 ATCC保藏号可获得的种子。本主题发明还包括从以段落[0021]中标识的 ATCC保藏号保藏的种子培育的除草剂抗性大豆植物。本主题发明进一步包 括所述植物的部分，如叶、组织样品、由所述植物产生的种子、花粉等(其 中在aad-12，pat和SEQ ID NO:15外，它们包含cry1F,cry1Ac,pat,和SEQ ID  NO:1和2)。

此外，本主题发明包括从保藏的种子培育的植物的后裔和/或后代植物， 优选为除草剂抗性大豆植物，其中所述植物具有包含如本文所述的可检测的 野生型接合序列的基因组。如用于本文，术语“大豆”意指大豆(Glycine max)， 并包括所有其可与大豆植物育种的品种。

本发明进一步包括使用本主题发明的植物作为至少一个亲本来进行杂 交的过程。举例而言，本主题发明包括具有本文中例示的任何植物作为一个 或两个亲本的F1杂交植物，包括但不限于具有包含大豆事件 pDAB9582.814.19.1的一个亲本和包含pDAB4468.04.16.1的另一个亲本。本主 题发明还包括由此类本主题发明的F₁杂合体产生的种子。本发明包括用于产 生F₁杂合体的方法，即将例示的植物与不同(例如，近交的亲本)植物杂交和 收获所得的杂交种子。本主题发明包括作为母本或父本的示例性植物。所得 的植物的特征亦可通过慎重选择亲本植物来改善。

可培育本发明的昆虫抗性/2,4D-耐受性/草丁磷耐受性大豆植物，即首先 将由本文中提及的任何一种品系种子培育的大豆植物组成的第一亲本大豆 植物和第二亲本植物有性杂交，由此产生多株第一后代植物，然后选择对草 丁磷和/或2,4D有抗性的第一后代植物；将第一后代植物自交，由此产生多 株第二后代植物，然后从第二后代植物选择对草丁磷和/或2,4D有抗性的植 物。这些步骤可进一步包括将第一后代植物或第二后代植物与第二亲本大豆 植物或第三亲本大豆植物回交。然后可种植包含本主题发明或其后代的大豆 种子的大豆作物。

亦可理解的是，亦可使两种不同转基因植物交配以产生含有两种独立分 离添加的外源基因的后代。合适后代的自交可产生对于两种添加的外源基因 为纯合的植物。亦考虑了回交于亲本植物和与非转基因植物的异型杂交，以 及营养繁殖。其他常用于不同性状和作物的育种方法在本领域是已知的。使 用了回交育种以将简单遗传的高度可遗传性状的基因转移至期望的纯合栽 培种或近交系，其为回归亲本。待转移的性状的来源称为供体亲本。期待所 得的植物具有回归亲本(例如栽培种)的特征和从供体亲本转移的期望的性 状。在起始杂交之后，选择了拥有供体亲本的表型的个体，并将其反复与回 归亲本杂交(回交)。预期所得的亲本具有回归亲本(例如栽培种)的特征，和 从供体亲本转移的期望的性状。

同样地，可以使用本领域中已知的方法用别的转基因转化本发明的昆虫 抗性/2,4D耐受性/草丁磷耐受性大豆植物。转化技术诸如土壤杆菌转化、生 物射弹转化(即基因枪)，和碳化硅介导的转化(即WHISKERS)可以用于将别 的转基因导入育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的 基因组中。可以对含有新插入的转基因的转基因植物完成选择和表征以鉴定 在本发明的aad-12，cry1F,cry1Ac,pat基因外含有新转基因的稳定整合子 (integrant)的植物。

本发明的DNA分子可作为分子标志物用于标志物协助育种(MAB)方法。 本发明的DNA分子可如本领域已知地用于鉴定遗传连锁的农艺学上可用的 性状的方法(如AFLP标志物，RFLP标志物，RAPD标志物，SNP和SSR)。可 使用MAB方法在与本主题发明的大豆植物的杂交(或其后代和任何其他大豆 栽培种或品种)的后代中追踪昆虫抗性和除草剂耐受性性状。所述DNA分子 为针对该性状的标志物，且本领域中公知的MAB方法可用于追踪大豆植物中 的除草剂抗性性状，其中至少一种本主题发明的大豆品系或其后代为亲本或 祖先。本发明的方法可用于鉴定具有本主题事件的任何大豆品种。

本主题发明的方法包括产生昆虫抗性/除草剂耐受大豆植物的方法，其中 所述方法包括用本主题发明的植物育种。更具体而言，所述方法可包括将两 株本主题发明的植物杂交，或一株本主题发明的植物与任何其他植物杂交。 优选的方法进一步包括通过就根据本主题发明可检测的事件和有利的品种 性能(例如产量)分析所述后代来选择所述杂交的后代。举例而言，本主题发 明可用于通过与包含其他所需的性状如农艺学性状、疾病耐受性或抗性，线 虫耐受性或抗性和成熟日期的植物的育种循环来追踪本主题事件。可检测、 鉴定、选择包含本主题事件和所需的性状的植物，并例如在进一步的育种轮 次中快速使用。本主题事件/性状亦可通过育种来与其它昆虫抗性性状和/或 其他的除草剂耐受性状组合，并根据本主题发明进行追踪。后者的实施方案 为包含与赋予对除草剂草甘膦(glyphosate)的耐受性的草甘膦耐受性基因组 合的主题事件的植物。

因此，本主题发明可与，例如编码草甘膦抗性(例如抗性植物或细菌 EPSPS，GOX，GAT)，草铵膦抗性(例如pat，bar)，乙酰乳酸合酶(ALS)抑制 性除草剂抗性(例如咪唑啉酮[如咪草烟(imazethapyr)]、磺酰脲、三唑并嘧啶 磺酰苯胺、嘧啶基硫代苯甲酸类和其他化学物[Csr1，SurA等])，溴苯腈抗性 (例如Bxn)，对HPPD酶(4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶)抑制剂的抗性，对八氢番 茄红素去饱和酶(phytoene desaturase)(PDS)的抑制剂的抗性，对光系统II抑制 性除草剂(例如psbA)的抗性，对光系统I抑制性除草剂的抗性，对原卟啉原氧 化酶(protoporphyrinogen oxidase IX(PPO))抑制性除草剂(例如PPO-1)的抗 性，对苯基脲除草剂(例如CYP76B1)的抗性，麦草畏降解酶(dicamba-degrading  enzyme)(参见，例如US20030135879)，和其他可单独或以多种组合叠加的性 状相组合，以提供有效控制或预防杂草演替(weed shift)的能力和/或对于任何 前述类型的除草剂的抗性。

此外，育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1可与一 种或多种其他输入(例如，昆虫抗性，病原体抗性，或应激耐受性等)或输出(例 如增加的产量，改善的油分布(profile)，改善的纤维品质等)性状叠加。因此 本主题发明可用于提供改善的作物品质与灵活且合算地控制任何数量的农 艺学病虫害的能力的完整农艺学套组(package)。

本领域内已描述了通过同源重组将多核苷酸序列整合在植物细胞的特 定染色体位点内的方法。举例而言，描述于美国专利申请公开号2009/0111188A1(其通过提及并入本文)的位点特异性整合描述了使用重组酶或整合酶介 导将供体多核苷酸序列导入染色体靶。此外，国际专利申请号WO 2008/021207(其通过提及并入本文)描述了将一种或多种供体多核苷酸序列 整合入基因组特定位置内的锌指介导的同源重组。可利用重组酶如描述于美 国专利号6720475(其通过提及并入本文)的FLP/FRT或描述于美国专利号 5658772(其通过提及并入本文)的CRE/LOX的用途来将多核苷酸序列整合入 特定染色体位点。最后，大范围核酸酶在将供体多核苷酸靶向具体染色体位 置的用途描述于Puchta等,PNAS USA93(1996)pp.5055-5060。

其他用于在植物细胞内位点特异性整合的方法一般是已知并可使用的 (Kumar等,Trands in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，在数种原核和 低等真核生物中鉴定的位点特异性重组系统可适用于在植物中使用。此类系 统的实例包括但不限于：来自酵母Zygosaccharomyces rouxii的pSR1质粒的 R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)，和噬菌体Mu的 Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

在本发明的一些实施方案中，可需要将新的转基因整合或叠加至既存的 转基因时间附近。该转基因事件可视为基于下述独特的特征而选择的优选的 基因组位点：如单个插入位点，正常的孟德尔分离和稳定表达，以及下述效 力的优越组合，包括在多个环境位置及其之间的除草剂耐受性和农艺学表 现。新整合的抓基因应维持现存转化体的转基因表达特征。而且，因为已经 鉴定了新整合事件的基因组侧翼序列和染色体位置，会解决新整合事件的确 认和检测方法的开发。最后，将新转基因整合入与既存转基因连锁的特定染 色体位置会加速该转基因通过使用常规育种方法的有性异型杂交而渐渗入 其他遗传背景。

在本发明的一些实施方案中，会需要从转基因事件切出多核苷酸序列。 举例而言，如描述于美国专利临时申请号61/297,628(其通过提及并入本文) 的转基因切出描述了使用锌指核酸酶以从染色体整合的转基因事件去除由 基因表达盒组成的多核苷酸序列。去除的多核苷酸序列可为选择性标记。在 切出和去除多核苷酸序列之后，可通过插入多核苷酸序列重新靶向修饰的转 基因事件。多核苷酸的切出及之后修饰的转基因事件的重新靶向提供了优点 如重新使用选择性标记或克服特定基因的表达所致的对植物转录组 (transcriptome)的非意图变化的能力。

在本文中，本主题发明公开了大豆基因组中染色体02上的特定位点，其 非常适于插入异源核酸。因此，本主题发明提供了将感兴趣的异源核酸导入 该预制的靶位点或该靶位点附近的方法。本主题发明还涵盖了包含任何插入 在公开的靶位点处或在该位点大致附近的异源核苷酸序列的大豆种子和/或 大豆植物。一个实现此种靶向整合的选项是在本文中例示的pat表达盒的位置 处切出和/或取代为不同的插入。就此一般性考虑，可根据本主题发明使用例 如靶向同源重组，但不限于此。

如用于本文，将基因、事件或性状“叠加”是将所需的性状组合入一个转 基因品系。植物育种者通过在各具有所需性状的亲本之间进行杂交，然后鉴 定具有所有这些所需性状的后代来将转基因性状叠加。另一种叠加基因的方 式是通过在转化过程中同时将两种或更多种基因转移至植物细胞核中。另一 种叠加基因的方式是通过用另一种感兴趣的基因重新转化转基因植物。举例 而言，可使用基因叠加以组合两种或更多种不同性状，包括例如两种或更多 种不同昆虫性状，昆虫抗性性状和疾病抗性性状，两种或更多种除草剂抗性 性状，和/或昆虫抗性性状和除草剂抗性性状。除了感兴趣的基因之外还使用 选择性标记亦可视为基因叠加。

“同源重组”指任何具有包含类似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列 对之间的反应，且通过该反应两种核苷酸序列可相互作用(重组)形成新的、 重组的DNA序列。类似核苷酸序列的位点在本文中各自称作“同源序列”。一 般地，同源重组的频率随着同源序列的长度的增加而增加。因此，尽管同源 重组可在两种并非完全相同的核苷酸序列之间发生，其重组频率(或效率)随 着两种序列之间的差异的增加而衰减。重组可使用每个供体和靶分子上各一 个同源序列来实现，由此生成了“单交叉”重组产物。或者，可在每个靶和供 体核苷酸序列上配置两个同源序列。供体上的两个同源序列与靶上的两个同 源序列之间的重组生成了“双交叉”重组产物。若供体分子上的同源序列位于 待操纵的序列(例如，感兴趣的序列)两侧，与靶分子的双交叉重组会得到下 述重组产物，其中感兴趣的序列替代起初位于靶分子上的同源序列之间的 DNA序列。靶和供体之间通过双交叉重组事件所致的DNA序列交换命名为 “序列替代”。

本主题发明的优选的植物或种子在其基因组中包含本文中鉴定的操作 性aad-12，cry1F v3,cry1Ac synpro和pat v6核苷酸序列，以及本文中鉴定的在 所述插入的两侧至少20-500或更多个连续的侧翼核苷酸。除非另行指明，当 提及侧翼序列时，是指相对于SEQ ID NO:1、2和15鉴定的那些。同样，SEQ  ID NO:29含有在起始转化体中插入的异源DNA，和紧邻着插入的DNA的例 示性侧翼基因组序列。可期待将这些侧翼序列的全部或部分转移至作为含有 该事件的亲本品系的有性杂交的结果而接收该插入的DNA的后代。

本主题发明包括本主题发明的植物的可再生细胞的组织培养。还包括了 从此种组织培养再生的植物，特别是当所述植物能够表达例示的品种的所有 形态和生理特性时。本主题发明的优选植物具有从保藏的种子培育的植物的 所有生理和形态特征。本发明进一步包括拥有感兴趣的品质性状的种子和此 种种子的后代。

如用于本文，“品系”为一组对于至少一种性状在个体间显示很少或没有 遗传差异的植物。此类品系可通过几个世代的自花授粉和选择，或从单个亲 本使用组织或细胞培养技术进行的营养繁殖来构建。

如用于本文，术语“栽培种”和“品种”是同义词，并指用于商业生产的品 系。

“稳定性”或“稳定的”意指对于给定组分，该组分在世代间，且优选至少 三个世代保持。

“商业实用性”定义为具有良好的植物活力(vigor)和高可育性，使得该作 物可由农民使用常规耕作设备来产生，且可使用常规压榨和提取设备从种子 提取具有所述组分的油。

“农艺学良种的”意指品系除了由于本主题事件的昆虫抗性和除草剂耐 受性之外，还具有期望的农艺学特征如产率、成熟性、疾病抗性等。这些农 艺学特征和数据点中的任何和全部可用于鉴定这类植物，或者作为一系列用 于鉴定这类植物的特征中的一个点或者作为任一端或两端。

如本领域技术人员根据本公开可知，检测试剂盒的优选实施方案，例如， 可含有涉及和/或包含“接合序列”或“过渡序列”(在此大豆基因组侧翼序列连 接插入序列)的引物和/或探针。举例而言，这包括涉及用于鉴定一个或两个 接合序列(在此插入连接侧翼序列)的多核苷酸探针、引物和/或扩增子，如上 表中所示。一种常见设计是具有一个在侧翼区中杂交的引物和一个在插入中 杂交的引物。此类引物通常每个的长度为约至少～15个残基。有了这种配置， 所述引物可用于生成/扩增可检测的扩增子，其指示本主题发明的事件的存 在。这些引物可用于生成跨越(并含有)如上所指示的接合序列。

在侧翼序列中“降落(touch down)”的引物通常设计为不超越约1200个碱 基或超越接合处而杂交。因此，通常的侧翼引物应设计为包含从插入起始位 置进入侧翼序列200个碱基以内的任一链的至少15个残基。即，包含SEQ ID  NO:1的碱基对800至1400和/或SEQ ID NO:2的碱基对153至753和/或SEQ ID  NO:15的碱基对2130至2730和/或SEQ ID NO:15的碱基对9122至9722(或其与 杂交)的合适大小的序列的引物落在本主题发明的范围内。同样，插入物引 物可以在SEQ ID NO:3插入物上的任何地方或者SEQ ID NO:15的碱基对 2731和9121之间的任何地方设计，并且例如，可以非排他性用于此类引物设 计。

本领域技术人员亦会知道可将引物和探针设计为在一定范围的标准杂 交和/或PCR条件下杂交，其中所述引物或探针并不完美地互补于所例示的序 列。即，可容忍一定程度的错配。对于大约20个核苷酸的引物，例如，若错 配的碱基在引物的内部或与扩增子相反的末端，通常一个或两个左右的核苷 酸并不需要与相反链结合。下面提供了多种适当的杂交条件。合成的核苷酸 类似物，如次黄嘌呤核苷，亦可用于探针。亦可使用肽核酸(PNA)探针，以 及DNA和RNA探针。重要的是此类探针和引物对于本主题发明的事件的存在 是诊断性的(diagnostic)(能够独一无二地鉴定和区分)。

应指出PCR扩增中可发生错误，其可例如导致次要的测序错误。即，除 非另行指明，本文中列出的序列是通过从大豆基因组DNA生成长扩增子，然 后克隆所述扩增子并对其测序而确定的。考虑到为了从基因组DNA测序而生 成充足扩增子所需的多轮次扩增，在以此方式生成和确定的序列中发现细微 差别和次要差异并非异常。本领域技术人员应理解并留意由于这些类型的常 见测序错误或差异所需的任何调整落在本主题发明的范围内。

亦应指出一些基因组序列的缺失并非罕见，例如，当在构建事件过程中 插入序列时。因此，例如可在本主题的侧翼序列和GENBANK中列出的基因 组序列之间存在一些差异。

DNA序列“插入物”的组分图示于图中，并在下文实施例中更加详细地讨 论。这些组分，或其片段的DNA多核苷酸序列，可在本发明的方法中用作 DNA引物或探针。

在本发明的一些实施方案中，提供了在来自大豆植物的植物和种子等中 用于检测转基因/基因组插入区的存在的组合物和方法。提供了包含本文中提 供的本主题5’转基因/基因组插入区接合序列的DNA序列(SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:1的碱基对800至1400之间)，其区段，及例示序列的互补物及其 任何区段。提供了如下的DNA序列，其包含本文中提供的主题3’转基因/基因 组插入区接合序列(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:2的碱基对153至753之间)，其 区段，及例示序列的互补物及其任何区段。提供了如下的DNA序列，其包含 本文中提供的主题3’转基因/基因组插入区接合序列(SEQ ID NO:15的碱基对 1至2730和SEQ ID NO:15的2731至9121之间)，其区段，及例示序列的互补物 及其任何区段。提供了如下的DNA序列，其包含本文中提供的主题3’转基因 /基因组插入区接合序列(SEQ ID NO:15的碱基对9122至10,198和SEQ ID  NO:15的2731至9121之间)，其区段，及例示序列的互补物及其任何区段。该 插入区接合序列跨越插入基因组的异源DNA和来自所述插入位点侧翼的大 豆细胞的DNA之间的连接。此类序列对于给定事件可具诊断性。

基于这些插入和边界序列，可生成事件特异性引物。PCR分析阐明可通 过分析用这些事件特异性引物组生成的PCR扩增子来在不同大豆基因组中 鉴定本主题发明的大豆品系。这些和其他相关的方法可用于独特地鉴定这些 大豆品系。因此衍生自此类引物对的PCR扩增子是独特的，且可用于鉴定这 些大豆品系。

在一些实施方案中，本发明的一个方面是包含新颖转基因/基因组插入区 的连续片段的DNA序列。包括了下述DNA序列，其包含充足长度的转基因 插入序列的多核苷酸和充足长度来自三种前述大豆植物中的一种或多种的 大豆基因组序列的多核苷酸和/或可用作引物序列的序列以供产生对于一种 或多种这些大豆植物具有诊断性的扩增子产物。

相关的实施方案涉及本文中鉴定的DNA序列的转基因区(如SEQ ID  No:1及其片段)包含至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25或更多个连续核苷酸或其互补物的DNA序列，和来自这些序 列的类似长度的侧翼大豆DNA序列，或其互补物。此类序列可作为DNA引 物用于DNA扩增方法。使用这些引物产生的扩增子对于本文中提及的任意大 豆事件具有诊断性。因此，本发明还包括通过此类DNA引物和同源引物产生 的扩增子。

本发明还包括在样品中检测对应于本文中提及的大豆事件的DNA存在 的方法。此类方法可包括：(a)将包含DNA的样品与引物组相接触，所述引 物组当用于用来自这些大豆事件至少之一的DNA进行的核酸扩增反应时，产 生对于所述事件具诊断性的扩增子；(b)进行核酸扩增反应，由此产生所述 扩增子；和(c)检测所述扩增子。

本主题发明的进一步的检测方法包括在样品中检测对应于所述事件的 DNA的存在的方法，其中所述方法包括：(a)将包含DNA的样品与在严格杂 交条件下与来自所述大豆事件至少之一的DNA杂交，而不在严格杂交条件下 与对照大豆植物(非感兴趣的事件的DNA)杂交的探针相接触；(b)对所述样 品和探针施以严格杂交条件；和(c)检测所述探针对所述DNA的杂交。

仍在进一步的实施方案中，本主题发明包括产生大豆植物的方法，所述 大豆植物包括本发明的大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1，其 中所述方法包括下述步骤：(a)将第一亲本大豆品系(包含本发明的表达盒， 其赋予所述品系的植物以草丁磷耐受性)与第二亲本大豆品系(其缺乏该除草 剂耐受性性状)有性杂交，由此产生多株后代植物；和(b)通过使用分子标志 物选择后代植物。此方法可任选地包括将所述后代植物与第二亲本大豆品系 回交以产生包含所述昆虫抗性、2,4-D和草丁磷耐受性性状的真育种 (true-breeding)大豆植物的进一步步骤。

根据本发明的另一个方面，提供了确定与所述事件杂交的后代的接合性 (zygosity)的方法。所述方法可包括将包含大豆DNA的样品与本主题的引物组 相接触。此种引物，当用于使用来自所述大豆事件至少之一的基因组DNA 的核酸扩增时，产生对于所述大豆事件至少之一具诊断性的第一扩增子。此 方法进一步包括进行核酸扩增反应，由此产生第一扩增子；检测所述第一扩 增子，并将包含大豆DNA的样品与所述引物组相接触，当将所述引物组用于 使用来自大豆植物的基因组DNA的核酸扩增反应中时，产生包含与所述大豆 基因组区同源的天然玉米基因组DNA的第二扩增子；并进行核酸扩增反应， 由此产生第二扩增子。所述方法进一步包括检测所述第二扩增子，和在样品 中比较所述第一和第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明该样品对于所述 转基因插入是杂合的。

可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域公知的方法开发DNA检测 试剂盒。所述试剂盒可用于在样品中鉴定本主题大豆事件DNA，并可应用于 供育种含有该DNA的大豆植物的方法。所述制剂盒含有与所述扩增子同源或 互补的DNA序列，所述扩增子例如本文中公开的扩增子，或同与本主题事件 的转基因遗传元件中所含DNA同源或互补的DNA序列同源或互补的DNA序 列。这些DNA序列可用于DNA扩增反应，或作为DNA杂交方法中的探针。 所述试剂盒亦可含有进行检测方法所需的试剂和材料。

“探针”是附于常规的可检测标记或报道分子(如放射性同位素、配体，化 学发光剂或酶)的分离的核酸分子。此种探针与靶核酸的链互补，在本发明 的情况下，与来自所述大豆事件之一的基因组DNA的链互补，无论所述其来 自大豆植物或来自含有由所述事件所得的DNA的样品。本发明的探针不仅包 括脱氧核糖核酸或核糖核酸，且还包括聚酰胺和其他特异性结合于靶DNA 序列并可用于检测所述靶DNA序列存在的探针物质。

“引物”为通过核酸杂交与互补靶DNA链退火以形成引物和靶DNA链之 间的杂合体，然后由聚合酶例如DNA聚合酶沿所述靶DNA链延伸的分离的/ 合成的核酸。本发明的引物对涉及其用于扩增靶核酸序列(例如通过聚合酶 式反应(PCR)或其他常规核酸扩增方法)的用途。

探针和引物的长度一般为5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32， 33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49， 50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66， 67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83， 84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100， 101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114， 115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127， 128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140， 141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166， 167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192， 193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205， 206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218， 219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231， 232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244， 245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257， 258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270， 271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283， 284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296， 297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309， 310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322， 323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335， 336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348， 349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361， 362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374， 375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387， 388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400， 401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413， 414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426， 427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439， 440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452， 453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465， 466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478， 479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491， 492，493，494，495，496，497，498，499，500，或1000，或2000，或5000 个核苷酸或更长。此类探针和引物在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂 交。优选地，本发明的探针和引物与靶序列具有完全的序列类似性，尽管可 通过常规方法设计与靶序列不同并保留与靶序列杂交能力的探针。

用于制备和使用探针和引物的方法描述于例如Molecular Cloning:A  Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook等,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。PCR-引物对可从已知序列， 例如通过使用为此目的的计算机程序来衍生。

基于本文中公开的侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于确证(且视 需要，改正)通过常规方法，例如通过重新克隆和对此类序列测序而披露的 序列。

本发明的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何 常规核酸杂交或扩增方法以鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸 分子或其片段能够在某些情况下特异性杂交于其他核酸分子。如用于本文， 若两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称该两个分子能够彼此特 异性杂交。若两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核 酸分子的“互补物”。如用于本文，当一个分子的每一个核苷酸互补于另一个 分子的核苷酸时，称这些分子呈现“完全互补性”。若两个分子可以以足够的 稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下维持彼此粘合 (anneal)，则称其为“最低限度互补的(minimally complementary)”。类似地， 若两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件 下维持彼此粘合，则称其为“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等, 1989。因此，可允许与完全互补的偏离，只要该偏离并不完全排除分子形成 双链结构的能力。为了使核酸分子充当引物或探针，仅需其序列充分互补以 能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双联结构。

如用于本文，基本上同源的序列是会与其在高严格条件下进行比较的核 酸序列的互补物特异性杂交的核酸序列。术语“严格条件”是对于核酸探针对 靶核酸通过Sambrook等,1989在9.52-9.55处讨论的特异性杂交步骤而杂交进 行的功能限定(还可见于Sambrook等，1989,9.47-9.52和9.56-9.58)。相应地， 本发明的核苷酸序列可就其与DNA片段的互补段选择性低形成双链体分子 的能力而使用。

取决于考虑到的应用，可使用多种杂交条件以获得探针对靶序列的不同 程度的选择性。对于需要高选择性的应用，可通常采用相对严格的条件来形 成杂合体，例如，会选择相对低盐和/或高温度的条件，如由约0.02M至约0.15 M NaCl在约50℃至约70℃的温度提供的条件。严格条件，例如，可涉及用高 严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1%SDS，65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。促 进DNA杂交的适当严格条件，例如在约45℃的6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)， 接着在50℃用2.0X SSC的洗涤，对于本领域技术人员是已知的。举例而言， 洗涤步骤中的盐浓度可选自在50℃的约2.0X SSC的低严格度至在50℃的约 0.2X SSC的高严格度。此外，洗涤步骤中的温度可从室温约22℃的低严格条 件增加至约65℃的高严格条件。温度和盐均可变化，或可将温度或盐浓度之 一维持恒定的同时改变另一个变量。此类选择性条件几乎不容忍探针和模板 或靶链之间的错配(若有的话)。通过杂交检测DNA序列对于本领域技术人员 是公知的，且美国专利号4,965,188和5,176,995的教导是杂交分析方法的实 例。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的核酸会在高严格条件下特异性 杂交于本文中例示或提出的一种或多种引物(或扩增子或其他序列)，包括其 互补物和片段。在本发明的一个方面，本发明的标志物核酸分子具有如本文 在例示性序列之一中列出的核酸序列，或其互补物和/或片段。

在本发明的另一个方面，本发明的标志物核酸分子与此类核酸序列分享 80%至100%或90%至100%的序列同一性。在本发明的进一步的方面，本发 明的标志物核酸分子与此种序列分享95%至100%的序列同一性。此类序列可 用作植物育种方法中的标志物以鉴定遗传杂交的后代。探针对靶DNA分子的 杂交可通过任何本领域技术人员已知的数种方法来检测，其可包括但不限于 荧光标记，放射性标记，基于抗体的标记和化学发光标记。

对于使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列(例如，通过PCR)，“严格条件” 为允许引物对仅杂交于会与具有对应的野生型序列(或其互补物)的引物结合 并优选产生独特扩增产物即扩增子的靶核酸序列的条件。

术语“特异于(靶序列)/对(靶序列)特异性的”表明探针或引物在严格杂交 条件下仅与包含所述靶序列的样品中的靶序列杂交。

如用于本文，“扩增的DNA”或“扩增子”指作为核酸模板一部分的靶核酸 序列的核酸扩增产物。举例而言，为了确定从有性杂交获得的大豆植物是否 含有来自本发明的大豆植物的转基因事件基因组DNA，可对从大豆植物组织 提取的DNA进行使用引物对的核酸扩增方法以产生对于所述事件DNA的存 在为诊断性的扩增子，所述引物对包括来源于所述植物基因组中邻近插入的 异源DNA插入位点的侧翼序列的引物，和来源于插入的异源DNA的第二引 物。所述扩增子的长度和具有的序列使其亦对该事件具诊断性。所述扩增子 的长度的范围可为引物对的合并长度加上一个核苷酸碱基对，和/或引物对的 合并长度加上约2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16， 17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33， 34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50， 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67， 68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84， 85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100， 101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114， 115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127， 128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140， 141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153， 154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166， 167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192， 193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205， 206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218， 219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231， 232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244， 245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257， 258，259，260，261，262，263，264，265，266，267，268，269，270， 271，272，273，274，275，276，277，278，279，280，281，282，283， 284，285，286，287，288，289，290，291，292，293，294，295，296， 297，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307，308，309， 310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322， 323，324，325，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335， 336，337，338，339，340，341，342，343，344，345，346，347，348， 349，350，351，352，353，354，355，356，357，358，359，360，361， 362，363，364，365，366，367，368，369，370，371，372，373，374， 375，376，377，378，379，380，381，382，383，384，385，386，387， 388，389，390，391，392，393，394，395，396，397，398，399，400， 401，402，403，404，405，406，407，408，409，410，411，412，413， 414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426， 427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437，438，439， 440，441，442，443，444，445，446，447，448，449，450，451，452， 453，454，455，456，457，458，459，460，461，462，463，464，465， 466，467，468，469，470，471，472，473，474，475，476，477，478， 479，480，481，482，483，484，485，486，487，488，489，490，491， 492，493，494，495，496，497，498，499，或500，750，1000，1250，1500， 1750，2000或更多个核苷酸碱基对(加上或减去任何上述列出的增量)。或者， 引物对可来源于插入的DNA两侧的侧翼序列从而产生包括整个插入核苷酸 序列的扩增子。来源于植物基因组序列的引物对的成员可位于距插入的DNA 序列一定距离处。该距离的范围可为一个核苷酸碱基对至约两万个核苷酸碱 基对。术语“扩增子”的使用特别排除了可在DNA热扩增反应中形成的引物二 聚体。

核酸扩增可通过任何本领域中已知的多种核酸扩增方法，包括聚合酶链 式反应(PCR)来实现。多种扩增方法在本领域是已知的，并描述于除其他之 外，美国专利号4,683,195和美国专利号4,683,202。开发了PCR扩增方法以扩 增高至22kb的基因组DNA。这些方法，以及本领域已知的其他DNA扩增的 方法可用于本发明的实践。可验证(视需要，可校正)来自主题大豆事件的异 源转基因DNA插入的序列或侧翼基因组序列，即使用来源于本文中提供的序 列的引物来扩增此类序列，接着对PCR扩增子或克隆的DNA进行标准DNA 测序。

可通过多种技术检测由这些方法产生的扩增子。琼脂糖凝胶电泳和用溴 乙锭的染色是检测DNA扩增子的常见公知方法。另一此类方法是Genetic Bit  Analysis，其中设计了与邻接的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列两者 重叠的DNA寡核苷酸。将所述寡核苷酸固定于微孔板的孔中。在对感兴趣的 区域的PCR(使用一个在插入序列中的引物和一个在邻接侧翼基因组序列中 的引物)之后，可将单链PCR产物与固定的寡核苷酸杂交，并充当模板用于单 碱基延伸反应，所述反应使用DNA聚合酶和对预期的接下来的碱基具有特异 性的标记的ddNTP。读数可为荧光性的或基于ELISA的。信号表明由于成功 的扩增、杂交和单碱基延伸所致的插入/侧翼序列的存在。

另一种方法是如Winge(Innov.Pharma.Tech.00:18-24,2000)所述的 Pyrosequencing技术。在该方法中，设计了与邻近基因组DNA和插入DNA连 接处重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交于来自感兴趣的区的单链PCR产 物(一个引物在插入序列中，而一个在侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、 ATP、硫酰酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5’ 磷硫酸(adenosine5'phosphosulfate)和萤光素的存在下温育。单独添加DNTP， 且其组入导致光信号，对该光信号进行测量。光信号表明由于成功的扩增、 杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在。

荧光偏振是另一种可用于检测本发明的扩增子的方法。遵循该方法，设 计了与基因组侧翼和插入的DNA连接处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸杂交于 来自感兴趣的区的单链PCR产物(一个引物在插入的DNA中，一个在侧翼基 因组DNA序列中)，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下温育。单 碱基延伸导致ddNTP的组入。组入可使用荧光计作为偏振改变来测量。偏振 中的改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸所致的转基因插入/侧翼序 列的存在。

(PE Applied Biosystems,Foster City,Calif.)，是检测和量化 DNA序列的存在的方法。简言之，设计了与基因组侧翼和插入DNA连接处 重叠的FRET寡核苷酸探针。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针 和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在特 异性扩增过程中，Taq DNA聚合酶将FRET探针上的荧光模块从淬灭模块清 除并释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因插入序列 的存在。

已描述了分子灯塔(Molecular Beacon)用于序列检测。简言之，设计了与 侧翼基因组和插入DNA连接处重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特 结构导致其含有保持荧光和淬灭模块彼此接近的二级结构。在热稳定性聚合 酶和dNTP的存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中， 一个在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列的 杂交导致探针二级结构的去除和荧光和淬灭模块的空间上的分离。其结果为 荧光信号。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因插 入序列的存在。

已经公开了对于插入为优秀的大豆基因组中的位置，本主题发明还包括 在该基因组位置大致附近包含至少一个非大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1插入的大豆种子和/或大豆植物。一种 选项是用不同插入物替换本文中例示的大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的插入物。在此一般性考虑下，可根 据本主题发明使用例如靶向同源重组。该类型的技术是例如WO03/080809 A2及其相应的公开的美国申请(US20030232410)的主题。因此，本主题发明 包括植物和植物细胞，其包含侧翼为本文中鉴定的侧翼序列(SEQ ID NO:1的 bp1-1400和SEQ ID NO:2的bp153-1550及SEQ ID NO:15的bp1-2730和SEQ  ID NO:15的bp9122-10,198)的全部或可识别部分的异源插入(取代aad-12， cry1F,cry1Ac,或pat基因的多拷贝或与cry1F,cry1Ac,或pat基因多拷贝一 同)。aad-12，cry1F,cry1Ac,或pat的一个额外拷贝(或多个额外拷贝)也可以 以此/这些方式靶向插入。

本文中提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开以其不与本 说明书的明确教导不一致的程度通过全文提述并入本文。

包括了下述实施例以说明供实践本发明的步骤，和阐明本发明的某些优 选实施方案。这些实施例不应视为限制性的。本领域技术人员应理解下述实 施例中公开的技术代表用于说明供其实践的优选模式的具体方法。然而，本 领域技术人员根据本公开，应理解可在这些具体实施方案中进行许多变化， 而仍旧获得相似或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。除非另行指 明，所有百分比为重量百分比，而所有溶剂混合物部分为体积，除非另行指 明。

除非另行指明，使用下述缩写：

bp    碱基对

℃    摄氏度

DNA    脱氧核糖核酸

EDTA   乙二胺四乙酸

kb    千碱基

μg    微克

μL    微升

mL    毫升

M        分子量

PCR   聚合酶链式反应

PTU       植物转录单元

SDS   十二烷基硫酸钠

SSC   含有氯化钠和柠檬酸钠的混合物的缓冲溶液，pH7.0

TBE   含有Tris碱，硼酸和EDTA的混合物的缓冲溶液，pH8.3

实施例

本发明的实施方案在以下实施例中进一步限定。应当理解，这些实施例 仅作为例示给出。从上述讨论和这些实施例看，本领域技术人员可以确定本 发明的必要特征，且在不偏离其精神和范围的前提下，可以对本发明的实施 方案做出各种改变和修改以使其适合于各种用法和条件。如此，在本文中显 示和描述的实施方案外，本发明的实施方案的各种修改从上述描述看对于本 领域技术人员而言会是显而易见的。此类修改意图落入所附权利要求书的范 围内。

本文中列出的每篇参考文献的公开内容通过提及完整并入本文。

实施例

实施例1：Cry1F和Cry1Ac大豆事件pDAB9582.814.19.1的转化和选择

经由土壤杆菌介导的大豆子叶节外植体转化生成含有大豆事件 pDAB9582.814.19.1的转基因大豆(大豆)。使用携带二元载体pDAB9582(图1) 的解除的(disarmed)土壤杆菌菌株EHA101(Hood等,1993)来启动转化，所述 pDAB9582在T链DNA区内含有选择标志物pat v6和感兴趣的基因cry1F v3和 cry1Ac synpro。pDAB9582的DNA序列参见SEQ ID NO:3，其在下文表1中注 释。

表1：位于pDAB9582上的基因元件。

使用Zeng等(2004)的修改规程实施土壤杆菌介导的转化。简言之，将 大豆种子(Maverick栽培种)在基础培养基上萌发，并且将子叶节分离，并用 土壤杆菌感染。枝条启动，枝条伸长，和生根培养基补充有头孢噻肟 (cefotaxime)，特美汀(timentin)和万古霉素以除去土壤杆菌。采用草丁磷选择 以抑制非转化枝条的生长。将选择的枝条转移至生根培养基以形成根，然后 转移至土壤混合物以驯化小植物。

用草丁磷对选择的小植物的顶生小叶进行涂叶(leaf-paint)以筛选推定的 转化体。将筛选的小植物转移至温室，容许驯化，然后用草丁磷进行涂叶以 再次确认耐受性，并且视为推定的转化体。将筛选的植物取样，并实施分子 分析以确认选择标志物基因和/或感兴趣的基因。容许T₀植物在温室中自花 传粉以产生T₁种子。

从独立的经转化隔离群生成此事件大豆事件pDAB9582.814.19.1。将T₁植物回交，并在后续世代里渐渗入良种品种中。事件基于其独特的特征诸如 单一插入位点，正常的孟德尔分离，稳定的表达，和卓越的效力组合，包括 除草剂耐受性和农艺学性能选择。以下实施例含有用于表征大豆事件 pDAB9582.814.19.1的数据。

实施例2：大豆事件pDAB9582.814.19.1中蛋白质表达的表征

表征大豆事件pDAB9582.814.19.1中表达的重组Cry1F，Cry1Ac，和 PAT蛋白的生物化学特性。定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)是本领域内已 知的一种生物化学测定法，其可以用于表征蛋白质的生物化学特性并且确认 这些蛋白质在大豆事件pDAB9582.814.19.1中的表达。

实施例2.1：PAT，Cry1F，和Cry1Ac蛋白在植物组织中的表达

将大豆组织的样品从测试植物分离，并且准备好进行表达分析。用含有 0.5%牛血清清蛋白(BSA)的含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液 (PBST)从大豆植物组织提取PAT蛋白。将植物组织离心；将水性上清液收 集，在必要时用合适的缓冲液稀释，并使用PAT ELISA试剂盒以三明治形 式分析。遵循制造商提示的方案(Envirologix,Portland,ME)使用试剂盒。此 测定法测量表达的PAT蛋白。

用含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBST)从大豆植物组织 提取Cry1F蛋白。将植物组织离心；将水性上清液收集，在必要时用合适的 缓冲液稀释，并使用Cry1F ELISA试剂盒以三明治形式分析。遵循制造商提 示的方案(Strategic Diagnostics Inc.,Newark,DE)使用试剂盒。此测定法测量 表达的Cry1F蛋白。

用含有0.5%牛血清清蛋白(BSA)的含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲 盐水溶液(PBST)从大豆植物组织提取Cry1Ac蛋白。将植物组织离心；将水 性上清液收集，在必要时用合适的缓冲液稀释，并使用Cry1Ac ELISA试剂 盒以三明治形式分析。遵循制造商提示的方案(Strategic Diagnostics Inc., Newark,DE)使用试剂盒。此测定法测量表达的Cry1Ac蛋白。

实施检测分析以在大豆事件pDAB9582.814.19.1中在纵向(世代间)和横 向(世代内的谱系间)两者上调查表达稳定性和可继承性。

实施例2.2：PAT，Cry1F，和Cry1Ac蛋白在植物组织中的表达

在大豆事件9582.814.19.1中测定Cry1F，Cry1Ac和PAT蛋白水平。 使用定量酶联免疫吸附测定法(ELISA)方法从大豆叶组织测量可溶性、可提 取性蛋白质。从T₂至T₆世代大豆事件pDAB9582.814.19.1，表达在所有谱系 间是稳定(不分离)且一致的。表2列出大豆事件pDAB9582.814.19.1中转基 因蛋白质的均值表达水平。

表2：大豆事件pDAB9582.814.19.1中不同转基因蛋白质的均值表达水平。

实施例3：大豆事件pDAB9582.814.19.1的插入物和侧翼边界区中的DNA序列的克隆和表征

为了表征并描述基因组插入位点，测定大豆事件pDAB9582.814.19.1的 侧翼基因组T-DNA边界区的序列。确认大豆事件pDAB9582.814.19.1的基 因组序列，其包含1400bp5’侧翼边界序列(SEQ ID NO:1)和1398bp3’侧翼边 界序列(SEQ ID NO:2)。基于大豆事件pDAB9582.814.19.1边界序列的PCR 扩增确认边界区是大豆起源的，且接合区是大豆事件pDAB9582.814.19.1的 独特序列。接合区可以用于大豆事件pDAB9582.814.19.1的事件特异性鉴定。 另外，通过从未转化大豆的基因组扩增与鉴定的侧翼边界序列的区域对应的 基因组片段表征T链插入位点。大豆事件pDAB9582.814.19.1与未转化基因 组序列的比较揭示了在T链整合过程中导致从初始基因座缺失约57bp。总 体上，大豆事件pDAB9582.814.19.1的插入物和边界序列的表征指示来自 pDAB9582的T链的完整拷贝存在于大豆基因组中。

表3：用于确认大豆事件pDAB9582.814.19.1中的大豆基因组DNA的一批引 物及其序列

表5：用于大豆事件pDAB9582.814.19.1中的边界区和事件特异性序列的标准 PCR扩增的PCR混合物。

实施例3.1：确认大豆基因组序列

将5’和3’侧翼边界与来自染色体02的大豆全基因组鸟枪序列比对，指 示大豆事件pDAB9582.814.19.1的转基因在大豆基因组染色体02中插入。 为了确认来自大豆基因组的大豆事件pDAB9582.814.19.1的插入位点，用不 同引物对实施PCR(图2，表3，表4，及表5)。来自大豆事件 pDAB9582.814.19.1和其它转基因或非转基因大豆系的基因组DNA用作模 板。为了确认5’边界序列是正确的，使用设计为结合At Ubi10启动子基因 元件的引物，例如AtUbi10RV1和设计为结合大豆基因组染色体02上的克 隆5’端边界的引物，即称作81419_FW3的引物来扩增DNA区段，该DNA 区段跨越At Ubi10启动子基因元件至5’端边界序列。类似地，为了确认克 隆的3’边界序列，使用pat特异性引物，例如3’PATEnd05和依照克隆的3’ 端边界序列设计的三种引物(称作81419_RV1、81419_RV2和81419_RV3) 来扩增DNA区段，该DNA区段跨越pat基因至3’边界序列。用每种引物对 仅从大豆事件pDAB9582.814.19.1的基因组DNA，而没有从来自其它转基因 大豆系或非转基因对照的DNA样品扩增出具有预期大小的DNA片段。结 果指示克隆的5’和3’边界序列是大豆事件pDAB9582.814.19.1的T链插入物 的侧翼边界序列。

为了进一步确认大豆基因组中的DNA插入，对不含大豆事件 pDAB9582.814.19.1的T链插入物的基因组DNA完成跨越大豆边界序列的 PCR扩增。使用依照5’端边界序列设计的引物81419_FW3和一条引物 81419-RV3(其设计用于3’端边界序列)来扩增DNA区段，该DNA区段含有 pDAB9582T链整合的基因座。如预期的，用引物对81419_FW3和 81419_RV3完成的PCR扩增从所有其它大豆对照系，而非 pDAB9582.814.19.1生成约1.5kb DNA片段。比对大豆事件 pDAB9582.814.19.1的鉴定的5’和3’边界序列与来自染色体02的大豆全基因 组鸟枪序列揭示了从初始基因座缺失约57bp(图3)。这些结果证明了大豆事 件pDAB8294的转基因插入大豆基因组染色体02的位点中。

实施例4：经由Southern印迹的大豆事件pDAB9582.814.19.1表征

使用Southern印迹分析来建立大豆事件pDAB9582.814.19.1的整合样 式。这些实验产生数据，该数据证明了大豆基因组内的cry1Ac和cry1F转基 因的整合和完整性。大豆事件pDAB9582.814.19.1表征为全长，简单整合事 件，其含有单一拷贝的来自质粒pDAB9582的cry1Ac和cry1F植物转录单 元(PTU)。

Southern印迹数据提示了插入大豆事件pDAB9582.814.19.1基因组中的 T链片段。进行详细的Southern印迹分析，其使用对pDAB9582.814.19.1的 T链整合区中含有的cry1Ac和cry1F基因特异性的探针，和具有位于质粒内 的切割位点并且生成质粒内部的杂交片段或跨越质粒与大豆基因组DNA的 接合的片段(边界片段)的描述性限制酶进行。从限制酶和探针的组合的 Southern杂交指示的分子量是事件独特的，并且建立了其鉴定样式。这些分 析亦显示质粒片段插入大豆基因组DNA中而并无cry1Ac和cry1F PTU的重 排。

实施例4.1：大豆叶样品收集和基因组DNA(gDNA)分离

从自含有大豆事件pDAB9582.814.19.1的个体大豆植物收获的叶组织提 取基因组DNA。另外，从常规大豆植物Maverick(其含有代表主旨品系的遗 传背景，缺乏cry1Ac和cry1F基因)分离gDNA。遵循标准的CTAB法 (Sambrook等(1989))从冻干的叶组织提取单独的基因组DNA。在提取后， 使用PICO GREEN试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)用分光荧光光度法对DNA 进行量化。然后在琼脂糖凝胶上将DNA显影以确认来自PICO GREEN分析 的值并确定DNA品质。

实施例4.2：DNA消化和分离

对于大豆事件pDAB9582.814.19.1的Southern印迹分子表征，将十微克 (10μg)基因组DNA消化。通过将每μg DNA约5个单位的选择的限制酶和 相应的反应缓冲液添加至每个DNA样品消化来自大豆事件 pDAB9582.814.19.1和非转基因大豆系Maverick的基因组DNA。将每份样 品于约37℃温育过夜。单独使用限制酶AseI，HindIII，NsiI，和NdeI以得 到单一消化物(New England Biolabs,Ipswich,MA)。一起使用限制酶NotI和 ApaLI以进行双重消化(New England Biolabs,Ipswich,MA)。另外，通过组合 质粒DNA，即pDAB9582与来自非转基因大豆品种Maverick的基因组DNA 来制备阳性杂交对照样品。与测试样品使用相同的规程和限制酶消化质粒 DNA/基因组DNA混合物。

在将消化温育过夜后，添加25μL QUICK-PRECIP PLUS SOLUTION (Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)，并将消化的DNA样品用异丙醇沉淀。 将沉淀的DNA团粒在15μL1倍加载缓冲液(0.01%溴酚蓝，10.0mM EDTA， 10.0%甘油，1.0mM Tris pH7.5)中重悬。然后，将DNA样品和分子大小标 志物以35伏特电泳通过具有0.4倍TAE缓冲液(Fisher Scientific,Pittsburgh, PA)的0.85%琼脂糖凝胶达约18-22小时以实现片段分离。将凝胶用溴化乙啶 (Invitrogen,Carlsbad,CA)染色，并在紫外(UV)光下显现DNA。

实施例4.3：Southern转移和膜处理

基本上如由Memelink等(1994)描述的那样实施Southern印迹分析。简 言之，在DNA片段的电泳分离和显影之后，用0.25M HCl对凝胶进行脱嘌 呤大约20分钟，然后将其暴露于变性溶液(0.4M NaOH,1.5M NaC1)大约30 分钟，然后暴露于中和溶液(1.5M NaCl,0.5M Tris pH7.5)至少30分钟。使 用用10X SSC的芯吸(wicking)系统过夜进行至尼龙膜上的Southern转移。在 转移之后，用2X SSC溶液洗涤膜后，通过UV交联将DNA结合于膜。该 过程使得Southern印迹膜已可用于杂交。

实施例4.4：DNA探针标记和杂交

使用标记的探针(表6)检测结合于尼龙膜的DNA片段。通过地高辛(DIG) 标记核苷酸[DIG-11]-dUTP对用特异于基因元件的引物从质粒pDAB9582扩 增的DNA片段中的基于PCR的掺入生成探针。通过PCR合成生成DNA探 针使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循生 产商推荐的步骤进行。

通过琼脂糖凝胶电泳分析标记的探针来确定其品质和数量。然后将所需 量的标记探针用于在尼龙膜上对靶DNA的杂交以供使用基本上对于DIG  EASY HYB SOLUTION(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)描述的步骤来检 测特异性片段。简言之，将含有固定DNA的尼龙膜印迹在2X SSC中短暂 洗涤，并在杂交烤箱中用杂交瓶中的20-25mL的预温热的DIG EASY HYB 溶液以大约45-55℃预杂交约2小时。然后倾去预杂交溶液，并用约15mL 含有所需量的通过在水浴中煮沸约5分钟而变性的特异性探针的预温热的 DIG EASY HYB溶液更换。然后在大约45-55℃在杂交烤箱中进行杂交步骤 过夜。

在探针杂交结束时，将含有探针的DIG EASY HYB溶液倾入干净试管， 并于约-20℃贮存。可根据生产商推荐的步骤将这些探针重新使用多至2次。 将膜印迹短暂漂洗并在干净塑料容器中用低严格性洗涤缓冲液(2倍SSC, 0.1%SDS)在室温洗涤约5分钟两次，然后用高严格性洗涤缓冲液(0.1倍SSC, 0.1%SDS)在大约65℃洗涤两次，各15分钟。将膜印迹用来自DIG清洗和 封闭缓冲液组(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)的1倍马来酸缓冲液短暂 清洗约5分钟。这继之以在1倍封闭缓冲液中封闭2小时，并还与1倍封闭 缓冲液中的抗DIG-AP(碱性磷酸酶)抗体(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN) 一起温育最少30分钟。在用1倍清洗缓冲液清洗2-3次后，特异性DNA探 针与膜印迹保持结合，并且使用CDP-STAR化学发光核酸检测系统(Roche  Diagnostics,Indianapolis,IN)遵循制造商的推荐显现经DIG标记的DNA标准 品。将印迹暴露于化学发光膜达一个或多个时间点以检测杂交片段并且显现 分子大小标准品。用ALL-PRO100PLUS膜显影剂(Konica Minolta,Osaka, Japan)显现膜，并扫描图像。对每个探针记录检测条带的数目和大小。使用 DIG标记DNA分子量标志物II(DIG MWM II)和DIG标记DNA分子量标志 物VII(DIG MWM VII)(DIG检测后可见，如描述的)来测定Southern印迹上 的杂交片段大小。

表6：用于Southern分析的探针的位置和长度

实施例4.5：Southern印迹结果

表7中给出了用特定的消化物和探针得到的预期的和观察到的片段大 小，其基于cry1Ac和cry1F PTU的已知限制酶位点。从这些消化和杂交鉴 定了两种类型的片段：内部片段，其中已知酶位点在探针区侧翼，并完全包 含于cry1Ac和cry1F PTU的插入区内，以及边界片段，其中已知酶位点位 于探针区一端，而预期第二位点在玉米基因组中。边界片段的大小随事件变 化，因为在多数情况下，DNA片段整合位点对于每个事件是独特的。边界 片段提供了相对于整合的DNA对限制性酶位点进行定位和衡量DNA插入 数的手段。对含有大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆的多个世代完成的 Southern印迹分析产生如下的数据，其提示了来自质粒pDAB9582的低拷贝， 完整的cry1Ac和cry1F PTU插入大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组 中。

表7：Southern印迹分析中预测的和观察到的杂交片段。1.预期片段大小基 于pDAB9582的质粒图。2.从这些分析大致地考虑观察到的片段大小，且 其基于DIG标记的DNA分子量标志物II和MARK VII片段指示的大小。

限制酶AseI和NsiI结合并切割质粒pDAB9582中的独特限制性位点。 随后，这些酶选择为表征大豆事件pDAB9582.814.19中的cry1Ac基因插入 物。大于7286bp或大于9479bp的边界片段预测为分别在AseI和NsiI消化 后与探针杂交(表7)。约7400和大于10000bp的单一cry1Ac杂交条带分别 在使用AseI和NsiI消化时观察到。探针与此大小的条带的杂交提示了大豆 事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中cry1Ac基因的单一插入位点的存 在。限制酶NotI和ApaLI选择为实施双重消化，并且释放含有cry1Ac植物 转录单元(PTU；启动子/基因/终止子)的片段(表7)。在NotI和ApaLI双重消 化后用探针观察到预测的4550bp片段。用酶消化pDAB9582.814.19.1样品， 接着进行探针杂交获得的结果指示了来自质粒pDAB9582的完整cry1Ac PTU插入大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中。

限制酶NdeI和NsiI结合并切割质粒pDAB9582中的限制性位点。随后， 这些酶选择为表征大豆事件pDAB9582.814.19中的cry1F基因插入物。大于 5569bp或大于9479bp的边界片段预测为分别在NdeI和NsiI消化后与探针 杂交(表7)。约7500bp和大于10000bp的单一cry1F杂交条带分别在使用 NdeI和NsiI时观察到。探针与此大小的条带的杂交提示了大豆事件 pDAB9582.814.19.1的大豆基因组中cry1F基因的单一插入位点的存在。限 制酶HindIII选择为释放含有cry1F植物转录单元(PTU；启动子/基因/终止子) 的片段(表7)。在HindIII消化后用探针观察到预测的7732bp片段。用酶消 化pDAB9582.814.19.1样品，接着进行探针杂交获得的结果指示了来自质粒 pDAB9582的完整cry1F PTU插入大豆事件pDAB9582.814.19.1的大豆基因 组中。

实施例4.6：主链序列的缺乏

还进行Southern印迹分析以确认大豆事件pDAB9582.814.19.1中壮观霉 素抗性基因(specR)、Ori Rep元件和复制起始蛋白trfA(trf A元件)的存在。 在Southern分析包括合适的阳性(对Maverick基因组DNA添加pDAB9582) 和阴性(Maverick基因组DNA)对照时预期没有与壮观霉素抗性、Ori Rep元 件或trf A元件的特异性杂交。在NsiI消化和与specR特异性探针杂交后， 在阳性对照样品(对Maverick基因组DNA添加pDAB9582)中观察到一条 15320bp的预期大小条带。specR探针没有与阴性对照和大豆事件 pDAB9582.814.19.1的样品杂交。类似地，在NsiI消化和与trfA探针杂交后， 一条15320bp的预期大小条带在阳性对照样品(加有pDAB9582的maverick) 中检出，但是阴性对照和大豆事件pDAB9582.814.19.1的样品缺乏。在NdeI 消化和与OriRep特异性探针杂交后，另一条5329bp的预期大小条带在阳性 对照样品(对Maverick基因组DNA添加pDAB9582)中检出，但是阴性对照 和大豆事件pDAB9582.814.19.1的样品缺乏。这些数据指示了大豆事件 pDAB9582.814.19.1中壮观霉素抗性基因、Ori Rep元件和复制起始蛋白trfA 的缺乏。

实施例5：农艺学和产率田间试验及除草剂耐受性

为了测试大豆事件pDAB9582.814.19.1的农艺学特征和效力，将该事件 在2010年10月和2011年2月在波多黎各的Santa Isabel在效力试验中种植。 将栽培种Maverick(其最初转化为生成事件pDAB9582.814.19.1)在每个苗圃 中种植，并且作为实验中的对照包括在内。用于T3苗圃的种子源自T2阶段 的单一植物选择，而用于T4苗圃的种子源自T3阶段的单一植物选择。每个 世代测试事件的4个谱系。将每个谱系在样地中种植，所述样地为4行宽和 7.5英尺长。行间间隔是30英寸。在光照下培育样地约2.5周以补偿波多黎 各的短日长度。对每个苗圃喷雾411g ae/ha率的草丁磷。对对照植物 Maverick的一个样地喷雾相同比率的草丁磷，并且第二个样地是非喷雾的， 并且用作事件的对照比较。

收集关于出土、一般外观、活力、高度、倒伏、和成熟的数据。通过视 觉查看缺绿症、叶坏死和植物死亡评估除草剂耐受性(表8)。

为了比较大豆事件pDAB9582.814.19.1与Maverick，仅使用来自未喷雾 Maverick区组的数据。为了比较喷雾的和非喷雾的处理，将来自用给定处理 喷雾的大豆事件pDAB9582.814.19.1区组的数据与来自Maverick对照非喷雾 区组的数据。大豆事件pDAB9582.814.19.1显示对草丁磷除草剂应用的耐受 性。比较而言，Maverick植物无一对除草剂处理有耐受性。

表8：大豆事件pDAB9582.814.19.1与Maverick的比较。数值是来自T3和T4苗 圃的平均值。以411g ae/ha比率在V3阶段给大豆事件pDAB9582.814.19.1的每 个苗圃喷雾草丁磷。

实施例6：大豆事件9582.814.19.1的杀虫活性的表征

进行田间和温室评估以表征大豆事件pDAB9582.814.19.1中的Cry1Ac 和Cry1F针对实验室饲养的大豆有害生物，包括黎豆夜蛾(黎豆毛虫)，大豆 夜蛾(大豆尺蠖)和草地夜蛾(秋季粘虫)的活性。针对非转化的大豆品种 Maverick比较大豆事件pDAB9582.814.19.1，以测定由Cry1F和Cry1Ac蛋 白提供的植物保护水平。

对约4周龄植物进行温室试验。使用15个植物来评估大豆事件 pDAB9582.814.19.1和Maverick对照。对于测试的每种昆虫物种(黎豆夜蛾， 大豆夜蛾(Pseudoplusia includes)，和草地夜蛾)，从每个植物生成3个叶冲孔， 总共45个叶盘/植物/昆虫物种。将1.4cm直径(或1.54cm²)叶冲孔置于2%水 琼脂上的测试场(test arena)中，用一种新生幼虫感染，并用穿孔塑料盖密封。 在感染后4天对死亡率和叶消耗评级。不响应温和探查的幼虫认为是死亡的。 通过对由昆虫消化的叶冲孔的百分比视觉评分评估叶损伤。

通过从波多黎各Santa Isabel的种子增加苗圃样地收集叶样品，并将这 些叶发送到IN的印第安纳波利斯进行测试进行田间评估。将大豆事件 pDAB9582.814.19.1的苗圃样地在2011年2月种植，并且由4行中排列的约 180个植物组成。每行长2.3m，并且相隔间距76.2cm；单个植物在每行内 相隔间隔5.1cm。在2011年3月，从10个大豆事件pDAB9582.814.19.1植 物和10个“Maverick”植物切出一个完全展开的，有三叶的主茎(mainstem)叶， 其大致位于分生组织下4个节。将叶置于标记的塑料袋中，(每袋一个)并密 封。将有袋的叶包装，并转移至实验室。在实验室中，从每个有三叶的叶冲 孔出一个或两个3.33cm(1.31英寸)直径叶盘以提供总共16个叶盘。将每个 叶盘置于2%琼脂上的测试场中，用一个新生草地夜蛾幼虫感染，并用穿孔 的塑料盖密封。将叶盘在受控的环境室中保持7天，此时将死亡率和叶消耗 分级。认为不响应温和探查的幼虫是死亡的。通过对由昆虫消耗的叶冲孔的 百分比视觉评分评估叶损伤。

从这些重复的实验获得的结果指示大豆事件pDAB9582.814.19.1比 Maverick对照植物在测试的所有昆虫方面维持显著更低的损伤。如此，大豆 事件pDAB9582.814.19.1在此宽宿主范围里具有杀虫活性。

实施例7：大豆事件pDAB9582.814.19.1的选择

SEQ ID NO:14提供了大豆事件pDAB9582.814.19.1的序列。此序列含有 5'基因组侧翼序列，pDAB9582的T链插入物和3'基因组侧翼序列。就SEQ ID  NO:14而言，残基1-1400是5'基因组侧翼序列，残基1401–1536是自 pDAB9582质粒的重排的残基，而1537–13896是pDAB9582T链插入物的 残基，且残基13897–15294是3'侧翼序列。如此，相对于插入物5’端的接 合序列或过渡存在于SEQ ID NO:14的残基1400-1401处。如此，相对于插 入物3’端的接合序列或过渡存在于SEQ ID NO:14的残基13896-13897处。

应当注意到，来自大豆事件pDAB9582.814.19.1的后代可以具有与SEQ  ID NO:14略微偏离的序列。在将大豆事件pDAB9582.814.19.1引入植物细胞 基因组中的渐渗和育种过程期间，发生插入物的一些缺失或其它变化不是不 常见的。此外，可以发生PCR扩增中的误差，其可以导致微小的测序误差。 例如，如下测定本文中列出的侧翼序列，即从大豆基因组DNA生成扩增子， 然后对扩增子克隆并测序。鉴于从基因组DNA生成足以测序的扩增子必需 的多轮扩增，以此方式生成并测定的序列中的微小差异和次要偏差不是罕见 的。本领域技术人员应当认可并且注意到由于这类常见测序误差或偏差而需 要的任何调节在本发明的范围内。如此，本文中提供的质粒序列的相关区段 可以包含一些次要变化。如此，包含与主题插入物序列具有一定范围的同一 性的多核苷酸的植物在本发明的范围内。与SEQ ID NO:14序列的同一性可 以是与本文中例示或描述的序列具有至少90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%,97%,98%,99%,或100%序列同一性的多核苷酸序列。如此，可以鉴定 SEQ ID NO:14和大豆事件pDAB9582.814.19.1后代植物之间的一些差异，并 且其在本发明的范围内。

实施例8：育种叠加大豆事件pDAB4468.04.16.1和大豆事件pDAB9582.814.19.1

实施例8.1：大豆事件pDAB4468.04.16.1和大豆事件pDAB9582.814.19.1的有性杂交

将如国际专利申请No.WO/2012/075426中描述的大豆事件 pDAB4468.04.16.1与大豆事件pDAB9582.814.19.1有性杂交。将大豆事件 pDAB4468.04.16.1的花药在大豆事件pDAB9582.814.19.1的柱头间手动摩擦， 由此对大豆事件pDAB9582.814.19.1传粉。对含有来自大豆事件 pDAB9582.814.19.1和大豆事件pDAB4468.04.16.1两者的整合事件的所得F1 后代筛选对2,4-D和草丁磷除草剂的耐受性以鉴定含有这两种整合事件的后 代植物。

实施例8.2：育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中蛋白质表达的表征。

表征育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB8264.44.06.1中表达的 重组Cry1F,Cry lAc,AAD12和PAT蛋白的生物化学特性。分别使用基于美国 临时专利申请No.61/511658和国际专利申请No.WO/2011/066360公开的测 定法的测定法通过事件特异性测定法将总共51个F1植物确认为 含有大豆事件pDAB9582.814.19.1和pDAB4468.04.16.1两者。接着，使用酶联 免疫吸附测定法(ELISA)来量化PAT和AAD12蛋白的表达，而通过利用来自 Meso-Scale Discovery(MSD)的电化学发光技术的多重化免疫测定法 (multiplexed immunoassay)量化Cry1Ac和Cry1F蛋白。总之，使用这些测定法 来表征蛋白质的生物化学特性，并且确认育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中这些蛋白质的表达。

植物组织中PAT蛋白的表达

在育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中测定PAT 蛋白的水平。使用用于测试大豆叶组织的定量酶联免疫吸附测定法 (Envirologix,Portland,ME)测量可溶性、可提取性PAT蛋白。

通过事件特异性测定法将总共51个F1植物确认为含有大豆 事件pDAB9582.814.19.1和pDAB4468.04.16.1两者。将大豆叶组织的样品从在 V3-V4生长阶段的这些温室种植的测试植物分离，并准备好进行表达分析。 将PAT蛋白用含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBST)和1%聚乙 烯吡咯烷酮40(PVP-40)从大豆植物组织提取。然后，使用GENOGRINDER^TM将样品以1500rpm提取5分钟。将植物提取物离心；将水性上清液收集，在必 要时用合适的缓冲液稀释，并以三明治式形式使用PAT ELISA试剂盒分析。 遵循制造商提示的方案使用试剂盒。此测定法测量叶组织中表达的PAT蛋白。

实施检测分析以调查育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中的表达遗传力。在F1世代，育种叠 加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的植物表达PAT(表9)。

植物组织中Cry1F和Cry1Ac蛋白的表达

在育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中测定 Cry1F和Cry1Ac蛋白的水平。使用用于大豆叶组织的多重化MSD测定法 (Meso-Scale Discovery,Gaithersburg,MD)测量可溶性、可提取性Cry1F和 Cry1Ac蛋白。

通过事件特异性测定法将总共51个F1植物确认为含有大豆 事件pDAB9582.814.19.1和pDAB4468.04.16.1两者。将大豆叶组织的样品从在 V3-V4生长阶段的这些温室种植的测试植物分离，并准备好进行表达分析。 将Cry1F和Cry1Ac蛋白用PBST和1%PVP40从大豆植物组织提取。然后，使 用GENOGRINDER^TM将样品以1500rpm提取5分钟。将植物提取物离心；将 水性上清液收集，在必要时用合适的缓冲液稀释，并使用来自Meso-Scale  Discovery的Cry1F/Cry1Ac多重MSD测定法分析。

实施检测分析以调查育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中的表达遗传力。在F1世代，育种叠 加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的植物表达Cry1F和 Cry1Ac(表10)。

植物组织中AAD12蛋白的表达

在育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中测定 AAD12蛋白的水平。使用用于测试大豆叶组织的定量酶联免疫吸附测定法 (Acadia Bioscience,Portland,ME)测量可溶性、可提取性AAD12蛋白。

通过事件特异性测定法将总共51个F1植物确认为含有大豆 事件pDAB9582.814.19.1和pDAB4468.04.16.1两者。将大豆叶组织的样品从在 V3-V4生长阶段的这些温室种植的测试植物分离，并准备好进行表达分析。 将AAD12蛋白用含有去污剂Tween-20的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBST)和0.5% 牛血清清蛋白(BSA)从大豆植物组织提取。然后，使用GENOGRINDER^TM将 样品以1500rpm提取5分钟。将植物提取物离心；将水性上清液收集，在必要 时用合适的缓冲液稀释，并以三明治式形式使用AAD12ELISA试剂盒分析。 遵循制造商提示的方案(Acadia,Portland,ME)使用试剂盒。此测定法测量叶 组织中表达的AAD12蛋白。

实施检测分析以调查育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中的表达遗传力。在F1世代，育种叠 加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的植物表达Cry1F和 AAD12(表11)。

实施例8.3：育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的除草剂耐受性

在温室研究中测定育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的除草剂耐受性。将大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1种子在盆中种植，并且培养至成熟。 在V3-V4生长阶段(其特征在于单叶和前3至4个具有三叶的叶完全形成)用单 一除草剂应用喷雾五十三(53)个成熟的F1植物，所述单一除草剂应用由840g ae/ha2,4-D组成。通过计算存活植物数目测量所得的对这些除草剂的耐受性。 发现所有53个植物对除草剂应用有抗性。比较而言，研究中包括对照植物， 其不含aad-12基因，并且预期对2,4-D除草剂应用易感。

总之，存在于大豆事件pDAB4468.04.16.1亲本系中的aad-12基因赋予对 2,4-D除草剂的耐受性。此性状在大豆pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1 中传递并遗传，由此对大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1提供 除草剂耐受性。比较而言，对照植物不含aad-12基因并且对2,4-D除草剂应用 易感。

实施例8.4：大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1的杀虫活性的表征

进行田间和温室评估以表征育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1中的Cry1Ac和Cry1F针对实验室饲 养的大豆有害生物，包括黎豆夜蛾(黎豆毛虫)和大豆夜蛾(大豆尺蠖)的活性。 针对大豆事件pDAB9582.814.19.1，大豆事件pDAB4468.04.16.1和非转化大 豆品种Maverick比较育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1，以测定叠加时由Cry1F和Cry1Ac 蛋白提供的植物保护水平是否变化。另外，在生物测定法之前用含有840g ae/ha2,4-D的单一除草剂应用喷雾育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1和大豆事件pDAB4468.04.16.1以确 认缺乏针对昆虫的来自除草剂的负面生物学影响。

对约3周龄植物进行温室试验。使用各5至10个植物来评估育种叠加大豆 事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1，大豆事件pDAB9582.814.19.1， 和阴性对照：喷雾的大豆事件pDAB4468.04.16.1和Maverick。对于测试的每 种昆虫物种(黎豆夜蛾和大豆夜蛾(Pseudoplusia includes))，每种昆虫物种从 每个植物生成3个叶冲孔。将1.4cm直径(或1.54cm2)叶冲孔置于1.5%水琼脂上 的测试场(test arena)中，用一种新生幼虫侵袭，并用穿孔塑料盖密封。在侵 袭后4天对死亡率和叶消耗评级。不响应温和探查的幼虫认为是死亡的。通 过对由昆虫消化的叶冲孔的百分比视觉评分评估叶损伤。

从这些重复实验获得的结果(表12)指示育种叠加大豆事件 pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1与大豆事件pDAB9582.814.19.1是一 致的，并且针对大豆尺蠖和黎豆毛虫比大豆事件pDAB4468.04.16.1(94-99%) 和Maverick(96-97%)对照维持显著更低的对叶组织的损伤(0.6-0.8%)。对育种 叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1和大豆事件 pDAB9582.814.19.1两者记录高死亡率(100%)，而pDAB4468.04.16.1和 Maverick植物导致较低的死亡率(0%)，并且置于这些对照植物上的所有昆虫 存活。如此，育种叠加大豆事件pDAB9582.814.19.1::pDAB4468.04.16.1与大 豆事件pDAB9582.814.19.1具有相当的杀虫活性。

*DAI=侵袭后的天数

阐明并描述了本发明的原则，本领域技术人员应当显而易见的是，本发 明可以在不偏离此类原则的情况下在重排和细节上修改。我们要求在所附权 利要求书的精神和范围内的所有修改。

本说明书中引用的所有出版物和公布的专利文件通过提及收入本文，其 程度就像每篇单独的出版物或专利申请明确且单独指定通过提及并入一样。