桃SSAP分子标记引物组合、分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析上的应用

技术领域

本发明涉及一种桃SSAP 分子标记引物组合、桃SSAP 分子标记组合及其在桃品种遗传多样性分析中的应用，属于分子生物学领域。

背景技术

桃[Prunus> (L.) Batsch]属于蔷薇科（Rosaceae），李属（Prunus>

大量的研究表明我国桃种质资源在DNA分子水平上存在极其丰富的遗传多样性。充分了解桃种质资源的遗传多样性与谱系关系是种质创新与遗传育种的基本要求和前提。丰富的遗传变异也为品种鉴别和指纹图谱的构建带来了可行性。

分子标记广泛应用于种质资源遗传多样性分析以及辅助育种工作中。逆转座子分子标记之一的SSAP(sequence-specific amplification polymorphism)是根据AFLP改进而来，它被认为是多态性最丰富、灵敏度最高、反映的多态信息含量最多的一种类型，且该标记多为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。

目前，SSAP分子标记技术已经成功用于葡萄、大麦、苹果等物种的遗传多样性分析（Labra，2004；Queen，2004；Venturi，2006），但是逆转座子引物的开发具有种族特异性，不同物种之间的逆转座子引物异质性很大，至今尚无SSAP分子标记技术在桃品种遗传多样性分析应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于桃品种遗传多样性分析的SSAP分子标记技术以及筛选具有较高多态性的桃SSAP分子标记引物组合。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种桃SSAP分子标记引物组合，包括LTR引物、选择性扩增引物和尾巴引物；

其中LTR引物组序列包括：

LTR-1：5’-TGGGGACTCCATTTTTACAACAG-3’（SEQIDNo.1），

LTR-2：5’-CATAGTTTTCATATTTTAGCAG-3’ （SEQIDNo.2），

LTR-3：5’-TAGGGGCTGTTCTACATCAG-3’ （SEQIDNo.3），

LTR-4：5’-ATAATATGCATTCTGCATCAG-3’ （SEQIDNo.4），

LTR-5：5’-CTACGAGTTGTTCTGCATCAG-3’ （SEQIDNo.5），

LTR-7：5’-TCATCATTGATACTCTTACAG-3’ （SEQIDNo.6），

LTR-8：5’-ACATTCCTAATTTCCAACAG-3’ （SEQIDNo.7），

LTR-12：5’-TTGAGTTAGGGAAGGGGAAGC-3’ （SEQIDNo.8），

LTR-13：5’-ATCTTGGAGTGTTTTCGCACA -3’ （SEQIDNo.9）；

特异选择性扩增引物的序列包括：

M-cgt：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAACGT-3’ （SEQIDNo.10），

M-ggt：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGGT-3’ （SEQIDNo.11），

M-gag：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGATGAGTCCTGAGTAAGAG-3’ （SEQIDNo.12）；

尾巴引物序列为：

Tail：5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’（ SEQIDNo.13）。

本发明还公开了一种桃SSAP分子标记组合，包括10个分子标记JY01、JY02、JY03、JY04、JY05、JY06、JY07、JY08、JY09和JY10，为桃基因组DNA基于SSAP方法经酶切、连接、预扩增，再加上上述的桃SSAP分子标记引物扩增而成，其中JY01的引物组合为M-cgt& LTR-1，JY02的引物组合为M-cgt& LTR-2，JY03的引物组合为M-cgt& LTR-3，JY04的引物组合为M-cgt& LTR-4，JY05的引物组合为M-cgt& LTR-7，JY06的引物组合为M-cgt& LTR-12，JY07的引物组合为M-cgt& LTR-13，JY08的引物组合为M-ggt& LTR-1，JY09的引物组合为M-ggt& LTR-5，JY10的引物组合为M-gag& LTR-8，以上所有引物组合均需要配合尾巴引物用于选择性扩增反应。

本发明还公开了上述的桃SSAP分子标记组合在桃品种遗传多样性分析上的应用，其步骤包括：

（1）引物设计合成：除设计合成权利要求1所述的全部引物外，另外需要合成Mse>EcoR>

Mse>Mse>

Mse>I-adapter-plus：5’- TACTCAGGACTCAT -3’，

EcoR>EcoR>

EcoR>

预扩增反应引物 EcoR>

Mse>I：5’- GATGAGTCCTGAGTAA-3’；

（2）DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；

（3）酶切：用EcoR>Mse>

（4）连接：将Mse I接头序列混合制备Mse I接头，将EcoR I接头序列混合制备EcoR I接头，将Mse I接头和EcoR I接头与酶切片段进行连接；

（5）预扩增：用预扩增PCR引物对连接后的产物进行预扩增；

（6）选择性扩增：在预扩增产物中加入上游引物和下游引物进行扩增，上游引物为特异选择性扩增引物组中的一个和Tail，下游引物为LTR引物中的一个，特异选择性扩增引物和LTR引物的组合遵循10个分子标记的组合规则；

（7） 扩增产物检测与分析：对扩增产物于ABI遗传分析仪上进行分析，使用Gene Mapper version 4.0 读取扩增片段数据，然后利用Microsoft Excel 2007 和FreeTree分别进行数据统计及聚类分析。

进一步的，步骤（6）中上游引物和下游引物的组合规则按照权利要求2中所述的10个桃逆转座子分子标记的组合规则。

进一步的，其详细步骤为：

（1）引物设计合成：使用逆转座子预测软件LTR_STRUC version 1.1对桃全基因组序列进行分析。在预测结果数据中优先选择两端LTR序列相似度大于99%的逆转座子，使用Primer Premier 5.0并参考3’端LTR区域序列设计SSAP分子标记中选择性扩增所需的下游引物，在该引物设计时仅选择从本区域5’端第一个碱基开始，同时替换第一个碱基为错配碱基，设计引物长度为19-23bp，在特异选择性扩增引物末端添加三个选择性碱基，分别为GAG、CGT和GGT，从而形成不同引物组合，同时在其5’端添加18bp的通用引物序列（M13）TGTAAAACGACGGCCAGT，Tail中的5’端分别添加四种不同的荧光基团，即FAM、HEX、PET和NED中选择，便于后期使用遗传分析仪进行扩增产物的检测与分析；

（2）DNA的提取：①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状，取约0.4g样品置于2 mL离心管中；

②加入1 mL 提取液后混匀，提取液的配方为：0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10 mmol/L β-巯基乙醇；

③4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入1 mL提取液后混匀；

④4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液，65℃水浴40 min，期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液，混匀并于室温下静置10 min，SDS裂解液的配方为：100 mmol/L Tris·Cl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L Nacl，1.5% SDS，抽提混合液的配方为:氯仿：乙醇：异戊醇=20：4：1(V：V：V);

⑤4℃，10000 rpm，10 min，小心将上清液移入新的2 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置30 min；小心吸出絮团状沉淀，用70%乙醇洗涤,

⑥超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为：10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0；

⑦采用紫外分光光度计检测DNA，确定其浓度和质量，同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；

（3）酶切，该反应体系为：基因组DNA模板200 ng，10×NEB Buffer 5 μL，BSA(10 mg/mL)0.2 μL，Mse I (10 U/μL) 0.25 μL，EcoR>20补足至25>

（4）连接：①接头的制备：分别取EcoR I-adapter和EcoR I-adapter-plus等体积的量混合配成10 μmol/L的浓度，再加等量的H20稀释成5 μmol/L的终浓度；分别取MseI-adapter和MseI-adapter-plus等体积的量混合配成50 μmol/L的浓度，在PCR仪上执行以下程序：94℃，3 min；65℃，10 min；37℃，10 mim；25℃，10 mim，退火后-20℃保存备用；

②连接反应体系：在酶切产物中加入5 μL如下混合液：EcoR I 接头(5 μmol/L) 1 μL，Mse>

（5）预扩增：预扩增20 μL反应体系为：DNA酶切连接产物 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL，Mg²⁺（25>EcoR>Mse>I预扩增引物(10>2O>

（6）选择性扩增：将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板，选择性扩增反应体系体积为25 μL，包括：选择性扩增模板 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each ) 1.0 μL，Mg²⁺（25>2O>

（7）扩增产物检测与分析：经上述扩增过程得到的PCR产物，取4 μl 加ddH₂O稀释至25>

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）本发明中10个桃SSAP分子标记的引物组合带型稳定、清晰且重复性好，在多个桃品种中均具有较高的多态性，利用这10个桃SSAP分子标记成功的对多个桃品种进行聚类分析，为桃品种鉴定以及遗传多样性分析建立了新的方法。

（2）本发明将通用引物M13序列添加在特异选择性扩增引物的5’端，同时加入已经添加荧光基团的Tail序列共同用于选择性扩增，经验证后发现该方法稳定可靠，今后大量应用该方法时，即使选用再多的分子标记组合，也只需要合成四条荧光引物即可，降低了实验成本。

（3）本发明的试验步骤均为常规分子生物学技术，成本低，在短时间内可完成大批实验材料鉴定。同时应用荧光标记，在ABI3130遗传分析仪（荧光毛细管电泳）上鉴定，效果可靠，可广泛用于今后的桃种质评价、创新、杂交育种亲本选择等研究。

附图说明

图1为SSAP分子标记技术原理路线示意图。

图2为桃SSAP分子标记选择性扩增产物的荧光毛细管电泳检测图，其中：A，M-cgt/LTR-7；B，M-cgt/LTR-12；C，M-ggt/LTR-1。

图3为基于10个桃SSAP分子标记组合分型数据构建的45份桃品种 NJ法（Neighbour-joining）聚类图，其中“△”代表半离核溶质，“□”代表离核溶质，“○”代表粘核溶质，“?”代表Story-hard类型，“●”代表粘核不溶质。

图4为基于10个桃SSAP分子标记组合分型数据构建的8份观赏桃品种 NJ法（Neighbour-joining）聚类图。

下面结合附图对本发明的实施方式做进一步说明。

具体实施方式

实施例1

SSAP分子标记在桃品种遗传多样性分析中的应用，其步骤包括：

（1）引物设计合成：使用逆转座子预测软件LTR_STRUC version 1.1对桃全基因组序列进行分析。在预测结果数据中优先选择两端LTR序列相似度大于99%的逆转座子，使用Primer Premier 5.0并参考3’端LTR区域序列设计SSAP分子标记中选择性扩增所需的下游引物，在该引物设计时仅选择从本区域5’端第一个碱基开始，同时替换第一个碱基为错配碱基，设计引物长度为19-23bp，在特异选择性扩增引物末端添加三个选择性碱基，分别为GAG、CGT和GGT，从而形成不同引物组合，同时在其5’端添加18bp的通用引物序列（M13）TGTAAAACGACGGCCAGT，Tail中的5’端分别添加四种不同的荧光基团，即FAM、HEX、PET和NED，便于后期使用ABI3130遗传分析仪进行分型分析，引物序列见表1

表1：相关引物序列

（2）不同桃品种（45份桃品种特征信息见表1）嫩叶采集与DNA的提取：①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状，取约0.4g样品置于2 mL离心管中；

②加入1 mL 提取液后混匀，提取液的配方为：0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10 mmol/L β-巯基乙醇；

③4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入1 mL提取液后混匀；

④4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液，65℃水浴40 min，期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液，混匀并于室温下静置10 min，SDS裂解液的配方为：100 mmol/L Tris·Cl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L Nacl，1.5% SDS，抽提混合液的配方为:氯仿：乙醇：异戊醇=20：4：1(V：V：V);

⑤4℃，10000 rpm，10 min，小心将上清液移入新的2 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置30 min；小心吸出絮团状沉淀，用70%乙醇洗涤,

⑥超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为：10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0；

⑦采用紫外分光光度计检测DNA，确定其浓度和质量，同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；

（3）酶切，该反应体系为：基因组DNA模板200 ng，10×NEB Buffer 5 μL，BSA(10 mg/mL)0.2 μL，Mse>EcoR>20补足至25>

（4）连接：①接头的制备：分别取EcoR>EcoR>Mse>Mse>

②连接反应体系：在酶切产物中加入5 μL如下混合液：EcoR>Mse>

（5）预扩增：预扩增20 μL反应体系为：DNA酶切连接产物 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL，Mg²⁺（25>EcoR>Mse>I预扩增引物(10>2O>

（6）选择性扩增：将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板，选择性扩增反应体系体积为25 μL，包括：选择性扩增模板 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each ) 1.0 μL，Mg²⁺（25>2O>

（7）扩增产物检测与分析：经上述扩增过程得到的PCR产物，取4 μl 加ddH₂O稀释至25>N_e)和Shannon's遗传多样性指数(I)；使用Microsoft>

（8）如图2所示，本发明中的SSAP分子标记组合选择性扩增产物经荧光毛细管电泳（ABI3130遗传分析仪）检测，条带清晰且丰富；表2所示，本发明中10个SSAP引物组合共产生928个条带，平均值为93，由此可见这些引物组合具有较高的多态性。图3所示，10个SSAP分子标记组合将45份桃品种全部区分，同时分类结果基本符合桃品种实际特征及亲缘关系，表明该SSAP分子标记技术可应用于桃品种遗传多样性分析中。

表 1本发明实例中所用到的45份桃品种相关特征信息

表2：桃SSAP分子标记多态性指数信息表

注：N_e代表有效等位基因数；I代表Shannon's遗传多样性指数；>

实施例2

10个SSAP分子标记组合在8份观赏桃品种遗传多样性分析中的应用，其步骤包括：

（1）引物合成：合成表1中所示的所有引物。

表 3实施例2中所用到的8份观赏桃品种相关特征信息

（2）8份观赏桃品种（8份观赏桃品种特征信息见表3）嫩叶采集与DNA的提取：①用液氮研磨1 g左右的幼叶成粉末状，取约0.4g样品置于2 mL离心管中；

②加入1 mL 提取液后混匀，提取液的配方为：0.4 mol/L葡萄糖、3% PVP、10 mmol/L β-巯基乙醇；

③4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入1 mL提取液后混匀；

④4℃，10000 rpm，10 min，弃上清液，加入0.7 mL 65℃预热的SDS裂解液，65℃水浴40 min，期间不时轻轻摇动,水浴结束待冷却后加入0.8 mL抽提混合液，混匀并于室温下静置10 min，SDS裂解液的配方为：100 mmol/L Tris·Cl，pH 8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L Nacl，1.5% SDS，抽提混合液的配方为:氯仿：乙醇：异戊醇=20：4：1(V：V：V);

⑤4℃，10000 rpm，10 min，小心将上清液移入新的2 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置30 min；小心吸出絮团状沉淀，用70%乙醇洗涤,

⑥超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.4 mL TE溶液溶解DNA, TE溶液的配方为：10 mmol/L Tris·Cl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0；

⑦采用紫外分光光度计检测DNA，确定其浓度和质量，同时取1~2 μl在1.0%的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为100 ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；

（3）酶切，该反应体系为：基因组DNA模板200 ng，10×NEB Buffer 5 μL，BSA(10 mg/mL)0.2 μL，Mse>EcoR>20补足至25>

（4）连接：①接头的制备：分别取EcoR>EcoR>Mse>Mse>

②连接反应体系：在酶切产物中加入5 μL如下混合液：EcoR>Mse>

（5）预扩增：预扩增20 μL反应体系为：DNA酶切连接产物 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each) 0.5 μL，Mg²⁺（25>EcoR>Mse>I预扩增引物(10>2O>

（6）选择性扩增：将预扩增产物稀释10倍作为选择性扩增的模板，选择性扩增反应体系体积为25 μL，包括：选择性扩增模板 2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mix (10 nM each ) 1.0 μL，Mg²⁺（25>2O>

（7）扩增产物检测与分析：经上述扩增过程得到的PCR产物，取4 μl 加ddH₂O稀释至25>

（8）如图4所示，10个SSAP分子标记组合将8份观赏桃品种全部区分，同时分类结果基本符合桃品种实际亲缘关系，表明该SSAP分子标记技术可用于观赏桃品种遗传多样性分析。