制备间充质干细胞基础培养基和利用间充质干细胞基础培养基制备细胞治疗产品的方法及用该培养基得到的分化产品

技术领域

本发明涉及来自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞基础培养基。具体地， 有可能通过增加间充质干细胞的增殖率而不是通过在体外培养间充质干细 胞（来自骨髓或脂肪组织）的过程中使用已经商业化的培养基来培养间充质 干细胞来减少从收集到大规模培养的时间。通过使用这种早期培养的间充质 干细胞来实施对成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的治疗。同时，本发明包括 制备多分化的间充质干细胞基础培养基的方法，以及制备间充质干细胞基础 培养基和来自于培养/分化的细胞治疗产品的方法。

背景技术

特别地，在利用组织工程学的再生医学领域中，干细胞技术的应用正在 成为顽固性疾病治疗的新领域。因此，干细胞研究正在获得越来越多的关注。 干细胞被认为是一个不仅用于治愈疾病，而且用于修复受损组织的问题解决 者。

通过还未分化时具有的复制能力，干细胞能够在适当的条件下分化成特 定的细胞。根据干细胞的来源，其可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。人类 胚胎干细胞获自能够生长为人类的胚胎。因此，它具有优良的细胞增殖和分 化能力，但与生命伦理相捆绑。与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有有限的 分化能力。然而，从取自如骨髓，血液，大脑，皮肤等人体器官的细胞发育 为干细胞，因此，成体干细胞具有较小的生命伦理问题。

间充质干细胞最初是从成年人的骨髓中分离的（Y.Jiang et al.,Nature, 418:41,2002）。此后，确认发现的间充质干细胞就像骨髓，皮肤，血液，肌 肉，脑组织（J.G.Toma et.al.,nat.Cell Biol.,3:778,2001:M,Sampaloesi et al., Science,301:487,2003:Y.Jiang et al.,Hematol.,30:896,2002）。另外，还发现从 脂肪细胞获得的脂肪来源的干细胞具有与骨髓相同的分化潜能（B.Cousin et  al.,BBRC.,301:1016,2003）。

Pittenger等（Science284:143,1997）和van等（J.Clin,Invest., 58:699,1976）解释说明了从人类骨髓中分离间充质干细胞的方法和从脂肪细 胞中分离间充质干细胞的方法。这些文献中使用α-MEM，DMEM培养基和 10-20％的小胎儿血清来培养细胞。

然而，在成体细胞（如骨髓，脂肪组织等）中很少存在任何间充质干细 胞。此外，这些细胞在未分化时具有低增殖率。如果这些细胞未分化，则难 以长期保存。因此，如果没有筛选培养基，则这些细胞在体外难以繁殖/培养 /保存。

哺乳动物的细胞培养基的组分包括大约50个不同的种类。将它们分类 如下：1）一部分是用于细胞生物合成的，2）一部分是用于生物能量代谢的， 3）一部分是用来作为各种新陈代谢的催化剂或用来调节细胞内生理现象的。 也就是说，用于细胞培养的培养基包括等渗溶液和缓冲溶液的组合物，营养 物（包括能量源，例如氨基酸，维生素，无机碱等），以及各种类型的补充 剂。

根据细胞的类型，通过提供5-20％的血清提供激素，生长因子，脂肪， 维生素，以及抑制蛋白分解酶的活化作用。然后作为pH调节缓冲液促进哺 乳动物细胞的生长和再生。培养哺乳动物细胞的培养基的组分的变化不仅取 决于浓度还取决于培养基的类型。用这种方法，在1950年基于体液组合物， 制成了M119培养基并因此培养了最早的小鸡（Morgan,et al.,1950）。

对于培养基的类型，这有一些用于培养细胞常用的简单的培养基，如最 小必需培养基（MEM）（Eagle,1955）和Dulbecoo改良的Eagle培养基(DMEM) （DUlbecoo,et al.,1959）。就像伊思考夫（Isocove）改良的DMEM（IMDM）， Ham's F-12（Ham，1965）和诺医学研究实验室（CMRL）-1666，有可能用 更多的生物合成体和更多的不同的组分来分类培养基。

哺乳动物细胞的生长曲线有2-3天的延迟期。由于乳酸（葡萄糖的终产 物）和氨（谷氨酰胺代谢作用的最终产物）的积累，活细胞的浓度从减速期 的末期显著减小。哺乳动物细胞的主要代谢途径是作为葡萄糖和谷氨酰胺的 碳和能量的主要来源。葡萄糖一旦被哺乳动物细胞代谢，即通过糖酵解变成 丙酮酸（Pyrubic Acid）。此外，通过磷酸戊糖途径使戊糖（pentose）合成己 烷（hexane）。在那些用于哺乳动物细胞代谢的碳源中，糖酵解生成的丙酮 酸（Pyrubic Acid）通过三羧酸循环被分解成CO₂，H₂O，乳酸或脂肪酸，在 新陈代谢过程中谷氨酰胺的一部分转变成谷氨酸。谷氨酸进入三羧酸循环， 产生了用于其他氨基酸合成的碳骨架。哺乳动物的主要代谢产物是乳酸和 氨。然而，丙氨酸的排出也很显著。乳酸和氨改变细胞和溶酶体内部的pH 值，以使得它们对细胞可能是有毒的。同样地，用于培养的培养基的类型应 该是不同的，因为根据培养的细胞的类型，培养基在生理机制和营养需求上 是不同的。

因此，为了增殖/培养源自未分化的间充质干细胞的成体细胞（骨髓， 脂肪细胞等），培养基的条件应根据未分化的间充质干细胞的生长条件进行 变化。

已经有许多在体外进行的关于增殖/培养未分化的间充质干细胞的培养 基的研究。

专利文献1（a method of mass production of growth factor using  mesenchymal stem cell）是以DMEM为基础的。加入Ham’s F-12将加速来自 间充质干细胞的生长因子的分化。因此，其描述了操纵合成明显数量的人类 生长因子的无血清培养基。然而，这是大规模生产碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor），血管内皮细胞生长因子（venular endothelial  cell growth factor）或人转化生长因子-β（human transforming growth  factor-beta），而不是在混合有DMEM和Ham’s F-12的基础培养基中增殖间 充质干细胞。

专利文献2（medium composition that is required for cord blood-derived  mesenchymal stem cell that includes soybean protein hydrolysate）为一种为了减 少胎牛血清的量在降血糖（hypoglycemosis）的DMEM（含胎牛血清）中添 加大豆蛋白水解产物的技术。

专利文献3（a method of manufacturing papilla tissue using mesenchymal  stem cell）和专利文献4（a method of manufacturing papilla tissue using  mesenchymal stem cell）为在DMEM培养基、DMEM/F-12、F-12、McCoy’s5A、 RPMI1640培养基、威廉斯氏培养基E（Williams’s medium E），或IMDM（伊 思考夫改良的杜尔贝可培养基，Iscove’s Modified Dulbecco’s Modification） 中培养间充质细胞后，诱导分化为乳头组织的技术。这涉及在商业化的基本 细胞培养基中添加氢化可的松（hydrocortisone），胰岛素，转铁蛋白和亚硒 酸钠的培养基。

专利文献5（mesenchymal stem cell culturing medium & a method of  culturing mesenchymal stem cell using it）是一种基于混合培养基（即添加了 营养混合物）在商业化的培养基中添加胰岛素，氢化可的松，表皮生长因子 （EGF），白血病抑制因子（LIF），人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF）等来培养间充质干细胞的技术。这是一种在已经商业化的培养 基中混合营养混合物的技术。

专利文献6（adipose pluripotent stem cell&a cellular therapy product that  contains it）是基于DMEM培养基的。它是关于通过添加角质形成细胞-SFM 培养基（Keratinocyte-SFM medium，其也添加有NAC，rEGF，BPE，胰岛 素等）来增殖间充质干细胞的技术。它的基础细胞培养基为DMEM培养基。

专利文献7（culture of adult stem cell or its fraction,composition of  pharmaceutical treatment and cancer treatment）和专利文献8（separated  pluripotency adult stem cell and its separation/culturing）为通过使用 DMEM/Ham’s F-12混合培养基、DMEM培养基和DMEM/F-12来培养间充 质干细胞的技术。

这些现有技术受限于那些通过添加如生长因子的添加剂的以前商品化 的培养基。

然而，我们的专利申请（专利文献9）（a method of special culturing of  cartilage cells for early culturing of cartilage cells）是不需添加如生长因子等添 加剂的改良培养基。通过使用专利文献9的早期培养基（ABM-C）培养间充 质干细胞（从如骨髓和脂肪的成体细胞中分离的）。然而，如图13所示在细 胞培养过程中发现形态异常。此外，细胞无粘着性，漂浮在细胞培养基上。 因此，在体外附着增殖的间充质干细胞没有增殖。

前述技术文献

专利文献

（专利文献1）：大韩民国专利注册号10-0899329

（专利文献2）：大韩民国专利公开号10-2009-0090850

（专利文献3）：大韩民国专利注册号10-1022032

（专利文献4）：大韩民国专利公开号10-2010-0110905

（专利文献5）：大韩民国专利注册号10-0908481

（专利文献6）：大韩民国专利注册号10-0679642

（专利文献7）：大韩民国专利公开号10-2009-0121541

（专利文献8）：大韩民国专利公开号10-2006-0010847

（专利文献9）：大韩民国专利注册号10-1037002

【发明内容】

【技术问题】

因此，本发明牢记现有技术中出现的问题，并且本发明的一个发明目的 是提供一种大规模地、以非常快的速度增长的能够培养/增殖未分化的间充质 干细胞（来自成体细胞，例如骨髓，脂肪细胞等）的间充质干细胞的基础培 养基。

本发明的另一个发明目的是提供一种细胞治疗产品，该细胞治疗产品含 有未分化的间充质干细胞，利用间充质干细胞基础培养基，通过分化未分化 的间充质干细胞（来自体外成体细胞）为成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞。

本发明的上述目的是分析商品化培养基组分的种类，组合2种或更多种 培养基，以制备各种类型的基础培养基。在所述基础培养基中，在含有10-20 ％的胎牛血清的完全培养基中分析间充质干细胞的增殖率。因此，最终的目 的是应用和准备一种制备基本培养基-间充质干细胞的方法。该方法包括适 合于间充质干细胞的早期培养的制备基础培养基的筛选步骤。

此外，本发明的目的是将1）DMEM高葡萄糖（一种商业化的培养基）、 RPMI-1640和Ham’s F-12培养基以1:1:1的比例混合得到的基础培养基与2） 每种DMEM高葡萄糖、RPMI-1640和Ham’s F-12培养基比较，基础组分包 括DMEM高葡萄糖培养基的组分，对于在每种培养基中重复使用的组分， 选择其较高的浓度，如果某种组分不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，则 应将它包含在DMEM高葡萄糖培养基中；如果是一种组分不包含在任何培 养基中，则应将它包含在DMEM高葡萄糖培养基中；从供给的来源相同的 组分选择其中一种，如果一种组分被重复使用，则选择其较高的浓度，如果 一种组分不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，则应将它包含在DMEM高葡 萄糖培养基中。因此，本发明的目的是发明一种由ABM-M（高等基础培养 基-间充质干细胞，Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell）培养基制 备的间充质干细胞基础培养基。

【技术方案】

对于间充质干细胞基础培养基，是DMEM高葡萄糖培养基的一部分的 那些组分如下示。对于氨基酸，有L-丙氨酸，无水的L-天冬酰胺，L-天冬 氨酸，L-谷氨酸，L-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸。对于无机盐，有五水硫酸 铜（Cupric Sulfate Pentahydrate），七水硫酸亚铁（Ferrous Sulfate  Heptahydrate），无水磷酸氢二钠（Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous）和 七水硫酸锌（Zinc Sulfate Heptahydrate）。对于维生素，有D-生物素，对氨 基苯甲酸（PABA）和维生素B12。对于其它组分，有次黄嘌呤 （Hypoxanithine），减少的L-谷胱甘肽，亚油酸（Linoleic acid），腐胺+2HCL （Putrescine+2HCL），硫辛酸和胸苷。

对于本发明的间充质干细胞基础培养基，ABM-M培养基包括一种或多 种来自小牛/马/人的胎儿血清，L-谷氨酰胺，抗生素和抗真菌剂。

对于本发明的间充质干细胞基础培养基，ABM-M培养基含有10-20％ 的胎牛血清和另外的2-4mM的L-谷氨酰胺。

对于间充质干细胞基础培养基，有应该选自供给的来源相同的组分。对 于氨基酸，有L-精氨酸单盐酸盐（L-Arginine Monohydrochloride）、L-天冬 氨酸、L-胱氨酸二盐酸盐（L-Cystine Dihydrochloride）、一水L-组氨酸单盐 酸盐（L-Histidine Monobydrochloride Monohydrate）。对于无机盐，有二水氯 化钙、七水硫酸亚铁（Ferrous Sulfate,Heptahydrate）、无水硫酸镁和无水磷 酸氢二钠（Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous）。对于维生素，有盐酸吡哆 醛。

对于本发明的基础培养基间充质干细胞，ABM-M培养基显示80％以上 对于CD166、CD105、CD90、CD44、CD29、CD73和HLA-ABC的阳性表 面标记物；显示95％以上对于CD44、CD105、CD90、CD73和CD166的阳 性表面标记物；显示少于5％对于CD14、CD31、CD34、CD45、CD80和 HLA-DR的阴性表面标记物。

另外，本发明的发明目的如下，间充质干细胞在ABM-M（高等基础培 养基-间充质干细胞，Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell）中培养。 此后，在含有胎牛血清，地塞米松，β-磷酸甘油（beta-Glycerophosphate）和 抗坏血酸的α-MEM培养基中培养/分化。用于节段性骨缺损（segmental bone  defects）的细胞治疗产品是分化成的成骨细胞。

本发明的另一发明目的如下，间充质干细胞在ABM-M（高等基础培养 基-间充质干细胞，Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell）中培养， 然后在含有地塞米松，抗坏血酸和丙酮酸钠，TFG-β，BMP-2的DMEM低 葡萄糖培养基中培养/分化，然后分化成软骨细胞。最终的产物是一种用于骨 关节炎（osteoarthritis）的具有上述特性的细胞治疗产品。

本发明的另一个发明目的如下：间充质干细胞在ABM-M（高等基础培 养基-间充质干细胞，Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell）中培养， 然后，在含有胎牛血清，地塞米松，吲哚美辛（Indomethacin）和胰岛素的 α-MEM培养基中培养/分化，然后分化成脂肪细胞。最终的产物是开发一种 用于脂肪组织形成（formulation）的具有上述特性的细胞治疗产品。

【有益效果】

如上所述，根据本发明，利用本发明的高等基础培养基-间充质干细胞 （Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell）能够以非常快的速度增殖分 化的间充质干细胞（成体干细胞）。即使增殖长达一个月后仍能维持细胞的 核型。另外，也可以通过分化成成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞将其作为细 胞治疗产品。

【附图说明】

图1示出的是一种含有MSC-BM（对照组）、添加剂和10％的胎牛血清 的源自骨髓的间充质干细胞的培养基，并且还示出了在含有ABM-M培养基、 添加剂和10％的胎牛血清的T75烧瓶中接种浓度为375,000个细胞的步骤， 其中，图1是表示培养10天后的间充质干细胞生长的图；

图2是在含有ADSCM（对照组）、ABM-M培养基，10％的胎牛血清的 T75烧瓶中以375,000个细胞的浓度接种脂肪间充质干细胞后培养了7天的 干细胞的示意图，然后进行传代培养用于间充质干细胞的生长，在T175烧 瓶中以875000个细胞的浓度接种，并培养7天，其中，图2是表示间充质 干细胞和在MSC-BM（对照组）中使用添加剂和10％的胎牛血清&在ABM-M 中也使用添加剂和10％的胎牛血清的源自骨髓的间充质干细胞的生长的图；

图3是表示间充质干细胞的增殖率的图；

图4是表示各自传代培养的间充质干细胞的生长的图，其中，间充质干 细胞在含有ADSCGM（对照组），ABM-M培养基和10％的胎牛血清的培养 基中的增殖；

图5为通过流式细胞仪测定的在含有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰 胺的ABM-M，MSCGM培养基（对照组）和ADSCGM培养基中培养的脂 肪或骨髓间充质干细胞的细胞大小（SS;细胞内颗粒含量，FS;细胞大小）和 表型变化的图；

图6是源自骨髓的间充质干细胞的免疫细胞分析的直方图，其中，源自 骨髓的间充质干细胞在含有10％的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺的ABM-M 培养基中培养；

图7是脂肪间充质干细胞的细胞特征分析的直方图，其中，脂肪间充质 干细胞在含有10％的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺的ABM-M培养基中培养；

图8是在含有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的ABM-M培养基中 培养骨髓来源/脂肪间充质干细胞后，然后在含有10％的胎牛血清，10mM 的β-甘油磷酸盐，50um的抗坏血酸，10^-7M的地塞米松的α-MEM培养基中 再培养/分化2-3周后成的成骨细胞的碱性磷酸酶和冯·科萨染色图；

图9是在含有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的ABM-M培养基中 培养骨髓来源/脂肪间充质干细胞后，然后在含有10％的胎牛血清，10^-7M的 地塞米松，100uM的吲哚美辛和10ug/ml的胰岛素的α-MEM培养基中再培 养/分化2周后成的脂肪的油红-O（oil Red-O）染色图；

图10示出的是通过在300g下离心约5×10⁵个细胞5分钟制备细胞团块， 为了诱导分化成软骨细胞，在含有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的 ABM-M培养基中培养骨髓来源的间充质干细胞后，在含有10^-7M的地塞米 松，50uM的抗坏血酸，1nM的丙酮酸钠，10ng/mL的TGF-β（转化生长因 子），100ng/mL的BMP-2（人骨成型蛋白）的DMEM高糖培养基中再培养/ 分化3周后成软骨组织，通过石蜡包埋过程，制备连续切片的过程，其中， 图10显示了H/E染色，藏红染色（safranin O dyeing），阿尔辛蓝染色（alcian  blue dyeing），天狼星红染色（Sirius red dyeing），COMP染色，胶原蛋白Ⅱ 型和I型染色的染色图；

图11是在ABM-M培养基中传代培养骨髓来源的间充质干细胞10代（即 在含有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的培养基中培养）后的核型分析 的图片；

图12是在ABM-M培养基中传代培养脂肪间充质干细胞10代（即在含 有10％的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的培养基中培养）后的核型分析的图 片；

图13是在前述ABM-C培养基中培养的间充质干细胞显示异常和缺乏 粘着性的细胞培养过程的图片。

【最佳实施方式】

【本发明的实施方式】

本发明提供了一种获自间充质干细胞培养基的高等基础成体细胞，该细 胞来源于成体细胞，如骨髓，脂肪等。本发明的基础间充质干细胞培养基分 析了商业化的培养基组分的类型后组合2种或更多种培养基；以制备各种类 型的候选的基础培养基，对于基础培养基的候选，将含有10-20％的胎牛血 清的完全培养基用于分析间充质干细胞的细胞增殖率；以及还包括筛选适合 于间充质干细胞的基础培养基的步骤。

通过使用本发明制备的基础培养基间充质干细胞分析了早期培养加速 （accelerated-early-cultured）的间充质干细胞是否显示免疫细胞的特征。此 外，也分析了它们分化成成骨细胞，软骨细胞和脂肪细胞的分化潜能。分析 了细胞的核型以确定细胞是否可以长期培养而不发生染色体异常的突变。因 此，验证了其是否能够用作用于治疗骨缺损，骨关节炎和脂肪细胞形成的细 胞治疗产品。

为了验证通过使用高等基础培养基-间充质干细胞是否能够作为细胞治 疗产品，期望按照下面的步骤验证并分析免疫细胞的特征，分化潜能和细胞 的核型。首先，进行分析在筛选培养基中培养的间充质干细胞的免疫学细胞 特征的步骤；进行分析通过制备的筛选培养基培养的间充质干细胞的分化潜 能的步骤；进行分析细胞的核型来验证是否有可能长期培养间充质干细胞 （用筛选培养基制备的）的步骤。

以下是对本发明更详细的解释。

本发明的ABM-M（高等基础培养基-间充质干细胞，Advanced Basic  Media-Mesenchymal stem cell）是一种由DMEM高葡萄糖、RPMI-1640和 Ham’s F-12以1:1:1的比例混合制备的基础培养基，其为一种商业化的培养 基。用DMEM高葡萄糖作为基础组分，上述基础培养基分别与各自的DMEM 高葡萄糖，RPMI-1640和Ham’s F-12相比较。然后，选择在其他培养基中 被重复使用的那些组分的较高浓度，如果某种组分不包含在DMEM高葡萄 糖培养基中，则将它包含在DMEM高葡萄糖培养基中（参见表1的注释（1））； 那些只包含在一种培养基中的组分，保持该组分相同的浓度，如果它们不包 含在DMEM高葡萄糖培养基中，则将它们包含在DMEM高葡萄糖培养基中 （参见表1的注释（2））；从那些在各自的培养基组分中使用相同供给来源 的组分中选择一种组分，如果一种组分在其他培养基中被重复使用，则选择 其较高的浓度，如果一种组分不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，则将它 包含在DMEM高葡萄糖培养基中（参见表1的注释（3）），结果如下表1所 示。

表1

商业化培养基的制备和ABM-M培养基的制备

如表1中的注释所述，下列是那些加入到DMEM高葡萄糖培养基中的 组分（ABM-M培养基的基本组分）。对于氨基酸，有L-丙氨酸，无水L-天 冬酰胺，L-天冬氨酸，L-谷氨酸，L-羟基-L-脯氨酸和L-脯氨酸。对于无机 盐，有五水硫酸铜，七水硫酸亚铁，无水磷酸氢二钠和七水硫酸锌。对于维 生素，有D-生物素，对氨基苯甲酸（PABA）和维生素B12。对于其它组分， 有次黄嘌呤（Hypoxanithine），减少的L-谷胱甘肽，亚油酸，腐胺+2HCL， 硫辛酸和胸苷。

下面是表1的注释的表述，其说明了作为间充质干细胞的基础培养基的 ABM-M（高等基础培养基-骨髓间充质干细胞，Advanced Basic  Media-Mesenchymal stem cell）培养基的组成。

（1）对于在培养基中重复使用的任何组分，使用其较高的浓度，如果 它不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，那些包含在DMEM高葡萄糖中的组 分列在表1的注释（1）中。

培养间充质干细胞（来自ABM-C培养基和DMEM，RPMI-1640，参照 专利文献9中的成体干细胞）。其结果是，发现粘附性的缺失和在细胞形状 上的一些异常。因此，为了增强粘附性和维持细胞形状，添加一些与细胞增 殖率和细胞合成特别相关的组分。

甘氨酸，L-谷氨酰胺，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸， L-苯丙氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸是用于 蛋白质合成的主要氨基酸。通过选择较高的浓度，有助于促进蛋白质合成和 细胞的增殖。

氯化钾（Patassium Chloride）与氯化钠（无机盐）与细胞内的渗透压相 关，因此，选择较高端的组分以保持适当的渗透压。

下述维生素是抗氧化剂：抗坏血酸磷酸酯（Ascorbic Acid Phosphate）， 氯化胆碱，D-生物素（包含在DMEM高葡萄糖培养基中），D-泛酸钙，叶酸， 肌醇，烟酰胺，核黄素，盐酸硫胺，维生素B12（包含在DMEM高葡萄糖 培养基中）。也就是说，选择较高的浓度以去除由高细胞增殖产生的代谢产 物。

无水D-葡萄糖（其它组分）是能量的主要来源。因此，为了保持较高 的增殖率，选择较高的浓度。丙酮酸钠与细胞间的合成相关，以至于选择较 高方面。酚红钠盐（Phenol Red Sodium Salt）与细胞增殖无关。然而，由于 细胞增殖变得更活跃使得它们生成了代谢产物。酚红的颜色从红色变为黄 色。由于高增殖率，选择较高的浓度以及时测量排出的代谢产物的量。

脯氨酸是胶原蛋白的主要组分，也是细胞化合物合成的一个重要组分。 为了增加高增殖的间充质干细胞内胶原蛋白的合成，将其包含在DMEM高 葡萄糖培养基中。

天冬氨酸包含在大多数的蛋白质中，且也和三羧酸循环相关。它是嘌呤 碱基（pruine base）的氨基基团提供者。因此，具有高增殖率的细胞DNA合 成的主要提供者是嘌呤和嘧啶（pirimidine）碱基，因此将它们包含在DMEM 高葡萄糖培养基中。

L-谷氨酸是一种对细胞代谢有重要作用的氨基酸。因此，它也包含在 DMEM高葡萄糖培养基中以激活细胞增殖。

对于那些只包含在一种培养基中的组分，保持该组分相同的浓度，如果 它们不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，那些包含在DMEM高葡萄糖中的 组分列在表1的注释（2）中。

在ABM-C培养基（由DMEM和RPMI-1640制备）中间充质干细胞增 值率增加的情况下，发生细胞粘附性的缺失。为了加强细胞粘附性和细胞内 胶原蛋白的合成，将那些不包含在DMEM高葡萄糖培养基中的组分包括在 内，作为一种从增加的合成中去除代谢产物的方式。

L-丙氨酸（一种氨基酸）是一种与细胞免疫和合成相关的氨基酸，因此 被包含在DMEM高葡萄糖培养基中以增加间充质干细胞的增殖。L-羟基-L- 脯氨酸（一种氨基酸），硫辛酸和亚油酸（其它组分）和对氨基苯甲酸（PABA） （一种维生素）是细胞内胶原蛋白的组分，这些组分能够增加细胞内胶原蛋 白的合成并增强粘附性。因此，它们被包含在DMEM高葡萄糖培养基中。

五水硫酸铜和七水硫酸锌（无机盐）和减少的谷胱甘肽（其他组分）是 抗氧化剂。它们增加了各种细胞内（显示高增殖率的细胞）代谢产物的排出。 因此，它们被包含在DMEM高葡萄糖培养基中以使得其有较高的细胞增殖 率。

其他组分如胸苷，腐胺+2HCL，和次黄嘌呤DNA是与DNH合成相关 的组分。为了增加细胞增殖率，DNA的合成是前提。因此，它们被包含在 DMEM高葡萄糖培养基中。

（3）从那些在各自的培养基组分中使用相同供给来源的组分中，选择 一种组分，如果选择的组分为在不同的培养基中再次使用的组分，选择其较 高的浓度，如果它不包含在DMEM高葡萄糖培养基中，那些包含在DMEM 高葡萄糖中的组分列在表1的注释（3）中。

对于L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-半胱氨酸/胱氨酸，L-组氨酸（氨基酸）， 氯化钙/硝酸，硝酸铁/硫酸亚铁，磷酸钠（无机盐），和盐酸吡哆醛/盐酸吡 哆硫胺（维生素），添加两种或更多种供给来源相同的组分，可能由于渗透 压的增加会对细胞产生不利影响。因此，对于相同的组分，选择一种高浓度 的组分或者单一供给来源的组分。

另外，为了能够使从间歇法生产的盐最小化，从无机盐中选择那些具有 水合物的组分。

对于磷酸钠，选择高浓度可能会增加培养基的总渗透压。这可能会对细 胞产生不利影响，以至于选择142.04mg/L以维持合适的渗透压。

六水氯化镁和无水硫酸镁是镁供给的来源，其是细胞内代谢的主要组 分。因此，为了减少在间歇法中生产的盐，选择无水化合物（无水硫酸镁）。 然而，它是一种重复使用的组分，以至于选择其较高的浓度。

由于如表1所示的上述提及的原因，在L-精氨酸游离碱（RPMI）和L- 精氨酸单盐酸盐（DMEM，F12）之间选择L-精氨酸单盐酸盐（211mg/L）。 此外，在一水L-天冬酰胺和L-天冬氨酸之间选择L-天冬氨酸（20mg/L）。在 一水L-半胱氨酸单盐酸盐和L-胱氨酸二盐酸盐之间选择L-胱氨酸二盐酸盐 （62.6mg/L）。在L-组氨酸和一水L-组氨酸单盐酸盐之间选择一水L-组氨酸 单盐酸盐（42mg/L）。

对于无机盐，在二水氯化钙和四水硝酸钙之间选择二水氯化钙 （265mg/L）。在九水硝酸铁和七水硫酸亚铁之间选择七水硫酸亚铁 （0.834mg/L）。在六水氯化镁和无水硫酸镁之间选择无水硫酸镁 （97.67mg/L）。在无水磷酸氢二钠和无水磷酸二氢钠之间选择无水磷酸氢二 钠（142.05mg/L）。

对于维生素，在盐酸吡哆醛和盐酸吡哆胺之间选择盐酸吡哆醛（4mg/L）。

如上所述，高等基础培养基-间充质干细胞（ABM-M）的目的在于在体 外培养来源于间充质干细胞的成体细胞（骨髓，脂肪细胞等）。它开始于 DMEM高葡萄糖，RPMI-1640和Ham’s F-12培养基的制备。但是，基本组 分为DMEM高葡萄糖。

也就是说，ABM-M培养基被归类为既不能积极增殖又不能合成的成体 干细胞。因此，它的主要组分为具有高浓度的氨基酸的DMEM高葡萄糖培 养基。另外，调整该培养基中如氨基酸，无机盐，维生素等组分的浓度，这 些组分在DMEM高葡萄糖培养基中不存在或者浓度较低。

间充质干细胞指的是来自哺乳动物（包括人类）成体细胞具有多潜能性 能的非分化细胞。调节细胞包括骨髓，血液，大脑，皮肤，脂肪，脐带血等。

从上述提及的成体细胞如骨髓或脂肪细胞中用不同的方法分离间充质 干细胞是有可能的。例如，可以使用Percoll等的浓缩辐射离心（concentration  radiant centrifugation）(Majumdar MK et al.,J.Cell Physiol,17:57,1998;Majka  SM et al.,J.Clin.Invest.,111:71,2003)的分离方法，或者Luria等(Luria et al., Transfusion,11:345,1972)的用胶原酶进行酶处理分离细胞的方法。这些方法 可以分离所有的容易在培养瓶底部生长的细胞。

高等基础培养基间充质干细胞的目的在于培养从成体细胞如骨髓，血 液，大脑，皮肤，脐带血等分离的间充质干细胞。如果需要的话，可以添加 一种或更多种组分。也可以添加抗生素和抗真菌剂以防止微生物的污染，如 小牛，马/人血清和L-谷氨酰胺。更理想的是添加10％-20％的胎牛血清和 2-4mM的L-谷氨酰胺。

对于本发明，为了研究来自高等基础培养基间充质干细胞（ABM-M） 的增殖率，在基础培养基中培养间充质干细胞。间充质干细胞的免疫细胞特 征如下，对于CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，CD73和HLA-ABC 的阳性表面标记物显示80％以上；对于CD44，CD105，CD90，CD73和CD166 的阳性表面标记物显示95％以上；对于CD31，CD34，CD45，CD80和 HLA-DR的阴性表面标记物显示少于5％，因此，它们表现出免疫细胞特征。

同时，在塑料培养容器的表面上附着/增殖时，也显示了纺锤状的形态 特征。此外，它是增殖不分化。

可以肯定的是培养的间充质干细胞可以分化成成骨细胞，软骨细胞和脂 肪细胞，表明该间充质干细胞是一种多潜能的间充质干细胞。

对于本发明，在ABM-M（高等基础培养基-间充质干细胞）中培养间充 质干细胞，然后在含有胎牛血清，地塞米松，β-磷酸甘油，和抗坏血酸的 α-MEM培养基中再培养。这提供了一种含有间充质干细胞的用于节段性骨 缺损的细胞治疗产品，该产品可以分化成成骨细胞。

对于本发明，在ABM-M（高等基础培养基-间充质干细胞）中培养间充 质干细胞，然后在含有地塞米松，抗坏血酸，丙酮酸钠，TFG-β和BMP-2 的DMEM低葡萄糖培养基中再培养。这提供了一种含有间充质干细胞的用 于骨关节炎的细胞治疗产品，该产品可以分化成软骨细胞。

对于本发明，在ABM-M（高等基础培养基-间充质干细胞）中培养间充 质干细胞，然后在含有胎牛血清，地塞米松，吲哚美辛和胰岛素的α-MEM 培养基中再培养。这提供了一种含有间充质干细胞的用于脂肪组织形成的细 胞治疗产品，该产品可以分化成脂肪细胞。

实施类型

在本发明中，将在高等基础培养基-间充质干细胞（ABM-M）中的间充 质干细胞的增殖与在其它培养基中的增殖进行了比较。更详细的解释参见下 述实施例，包括间充质干细胞（在ABM-M中培养）的免疫细胞的特征，间 充质干细胞（在ABM-M培养基中培养）的分化潜能，和间充质干细胞（在 ABM-M培养基中培养）的细胞核型的维持。

【实施例1】

高等基础培养基间充质干细胞（ABM-M）的增殖能力的比较

为了分析在ABM-M培养基中的骨髓和脂肪组织的成体组织来源的间充 质干细胞的增值率，购买了冷冻骨髓来源和脂肪间充质干细胞。骨髓来源的 间充质干细胞在Poietics MSCGMTM Bullekit中培养，为了用于比较，将脂肪 间充质干细胞在Poietics ADSC-GM^TMBullekit中培养。

1-1.骨髓来源和脂肪间充质干细胞的准备

在27度将间充质干细胞（源自一个叫Lonza公司的骨髓）加热，并立 即解冻后，将它放入含有5ml的MSCM^TM培养基的15ml试管中，在300g 下离心5分钟。离心后，为了测量细胞数量和细胞存活率，除去上部的液体 培养基并用10ml新的MSCGM培养基重悬。在T25烧瓶中接种制备的细胞 约5000个细胞/cm²后，在37℃和5％的CO₂下培养。培养液每3-4天更换 一次进行培养，且5ml MSCGM培养基各自在不同的培养容器中。一旦细胞 生长至占用超过90％的烧瓶底部面积时，进行继代培养。在第二，第三和第 四培养过程后，制备用于试验目的的一定数量的细胞。

在37℃将间充质干细胞（源自购自Lonza的脂肪细胞）加热，并立即解 冻后，将它放入含有5ml的ADSC-GM培养基的15ml试管中，在300g下离 心5分钟。离心后，为了测量细胞数量和细胞存活率，除去上部的液体培养 基并用10mL新的ADSC-GM培养基重悬。在T25烧瓶中接种制备的细胞约 5000个细胞/cm²后，在37℃和5％的CO₂下培养。通过每3-4天针对各自不 同的培养容器更换5ml ADSC-GM培养基（含有10％的胎羊血清）进行培养。 一旦细胞生长至占用超过90％的烧瓶底部面积时，进行继代培养。在第二， 第三和第四继代培养过程后，制备用于试验目的的一定数量的细胞。

1-2.骨髓来源的间充质干细胞在ABM-M培养基中的增殖

在本发明中研究了ABM-M培养基的增殖潜能，将MSCM用作对照组， 与从MSCGM培养基中继代培养至4次的骨髓来源的间充质干细胞进行比 较。MSCGM培养基包含MSC-BM的基础培养基和添加剂（50mL生长添 加物，10mL的L-谷氨酰胺和0.5mL青霉素-链霉菌）。因此，为了实现比较 的目的，通过在ABM-M培养基中也添加添加剂来进行试验（表2）。

表2

就各自的增值率而言制备ABM-M培养基和MSCGM培养基

120

在4次继代培养后，按5000个细胞/cm²接种到含有不同培养基（培养 基组成如表2所示）的T75烧瓶中，并保持在37℃和5％的CO₂下培养。在 培养10天后，每3-4天在培养容器中用不同的培养基更换培养液，并测定 细胞的数目。

基于图1和图3，作为对照组，在超过10天内培养基（添加了10％的 胎牛血清和MSC-BM的MSC-BM+FBS）没有表现出任何增殖。对于MSCGM 培养基（加入了添加剂的MSC-BM)，几乎没有发现增殖。

然而，培养基（ABM-M+FBS，在ABM-M培养基中加入有10％的胎牛 血清（FBS））较MSCGM具有较高的增殖，并且还具有更快的倍增时间。 此外，培养基（混有添加剂的ABM-M）比MSCGM显示出更高的增殖率和 更快的倍增时间。也就是说，发现了制备ABM-M培养基能够增加骨髓来源 间充质干细胞的增殖率。

然而，在MSCGM培养基中，并没有发现骨髓来源间充质干细胞的增殖。 相比之下，在含有10％胎牛血清和2mL的L-谷氨酰胺的ABM-M培养基中， 则发现骨髓来源间充质干细胞的增加。这表明，在MSCGM培养基中培养， 间充质干细胞丧失了增殖能力。但是，ABM-M培养基仍保持增殖能力。

为了验证在ABM-M培养基中的增殖能力，将从第五代继代培养细胞中 恢复培养的那些细胞按约5000个细胞/cm²接种于T150烧瓶中。然后将它 们在37℃和5％的CO₂下培养。培养液每3-4天用含有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的ABM-M培养基更换，培养10天。然后，检验细胞数目的结 果是回收了3357500个细胞，与接种的750000个细胞的数量相比，增殖率 为447％。这证明了连续的增殖能力。因此，可以得出结论：对于骨髓来源 的间充质干细胞，ABM-M培养基具有优良的增殖能力。

表3

对于各培养基，骨髓来源的间充质干细胞的增殖分析结果

1-3.ABM-M培养基中脂肪间充质干细胞的增殖

以ADSC-GM培养基作为对照组，研究了在ABM-M培养基中脂肪间充 质干细胞的增殖。该干细胞为在ADSC-GM培养基中继代培养4代的干细胞。 ADSC-GM培养基由作为基础培养基的ADSCC-BM和添加剂（50mL胎牛血 清，5mL的L-谷氨酰胺和0.5mL庆大霉素-两性霉素 （gentamicin-amphotercin））。因此，在ABM-M培养基中添加10％胎牛血清 和2mM L-谷氨酰胺进行对比试验。

经过4代继代培养后，按5000个细胞/cm²接种到装有不同培养基的T75 烧瓶中，保持在37℃和5％的CO₂下培养，在培养7天后，每3-4天在培养 容器中用不同的培养基更换培养液，并测定细胞的数目。经过4代继代培养 获得的细胞，按5000个细胞/cm²接种到装有不同培养基的T175烧瓶中，保 持在37℃和5％的CO₂下培养，在培养7天后，每3-4天在培养容器中用不 同的培养基更换培养液，并测定细胞的数目。

基于图2，4和表5，与对照组ADSC-GM相比，我们的在ABM-M培 养基中添加10％的胎牛血清的培养基（ABM-M+FBS）在第五代和第六代继 代培养中表现出更快的倍增时间，并回收了更多的细胞。这证实了脂肪间充 质干细胞较高的增殖率归因于本发明的ABM-M培养基。

表4

对于各培养基，脂肪间充质干细胞的增殖分析结果

【实施例2】

在ABM-M培养基中培养的间充质干细胞的免疫学分析

用稳定型胰蛋白酶替代酶（TrypLE express）处理如实施例1中的1-2 和1-3培养基中培养的那些细胞后进行分离，然后在400g下离心5分钟后 获得细胞，然后用FASC溶液清洗2次。将那些清洗的细胞分别分成5×10⁵， 然后将它们与抗-CD166，CD105，CD90，CD44，CD29，CD73，HLA-ABC， CD31，CD34，CD45，CD80和HLA-DR抗体反应20分钟，然后将它们清 洗，并悬浮在FACS溶液中，用于流式细胞仪进行分析。对于细胞表面的分 析证实其是间质表型。

结果，与在MSC-GM和ADSC-GM培养基（对照组）中培养的间充质 干细胞相似，CD166，CD106，CD90，CD44，CD29，CD73和HLA-ABC 在含有2mM的L-谷氨酰胺和10％的胎牛血清的ABM-M中培养的细胞中显 示出良性表达；CD14，CD31，CD34，CD45，CD80和HLA-DR呈阴性表 达，因此，证实了它们表现出间充质干细胞的特征（见表5）。

表5

在ABM-M培养基中培养的间充质干细胞的免疫学特征

【实施例3】

在ABM-M培养基中培养的间充质干细胞的分化潜能分析

在用试剂Triplex处理如实施例1中的1-2和1-3培养基中培养的那些 细胞后进行分离，然后在400g下离心5分钟后获得细胞，证实其在体外具 有分化潜能。

为了验证培养的间充质干细胞的分化潜能，如下所示按照与 Schallmoser K.等（Tissue Eng Par C Method14:185,2008）建议的方法相一致 的方法进行分化诱导。

为了分化成成骨细胞，将ABM-M培养基中早期培养的间充质干细胞 在含有10％胎牛血清，10mM的β-甘油磷酸，50um的抗坏血酸和10^-7M的 地塞米松的α-MEM培养基中进行再培养和分化2-3周，如图8所示。然后 通过碱性磷酸酶染色对碱性磷酸酶是否表达进行测定，通过冯·科萨染色 （von Kossa dyeing）证实了钙的积累。

为了分化成成脂肪细胞，将ABM-M培养基中早期培养的间充质干细 胞在含有10％胎牛血清，10^-7M地塞米松，100uM吲哚美辛和10ug/ml胰岛 素的α-MEM培养基中进行再培养和分化2周，如图9所示，然后出于验证 的目的，在细胞内积累的脂肪泡被油红-O染色。

为了诱导分化成软骨细胞，将ABM-M培养基中早期培养的约5×10⁵个间充质干细胞在300g下离心5分钟以形成细胞团块，如图10所示。此后， 在含有10^-7M的地塞米松，50uM的抗坏血酸，1nM的丙酮酸钠，10n/mL的 TGF-β和100ng/mL的BMP-2的DMEM低葡萄糖培养基中再培养和分化3 周。被诱导分化的软骨细胞通过石蜡包埋过程后被分割为5um的连续切片， 然后，它们通过H/E染色，藏红染色（safranin O dyeing），阿尔辛蓝染色（alcian  blue dyeing），天狼星红染色（Sirius red dyeing），COMP染色，胶原蛋白Ⅱ 型和I型染色证实其分化潜能。

在本发明中，在ABM-M培养基中继代培养骨髓和脂肪间充质干细胞2 代后，诱导其多分化，与没有诱导多分化的对照组进行比较。通过诱导其为 成骨细胞并实施碱性磷酸酶染色和钙积累，结果发现，与未进行诱导分化的 对照组相比，钙积累且碱性磷酸酶表达明显。另外，在诱导为脂肪细胞后进 行油红-O染色，结果发现，与未进行诱导分化的对照组相比，它们分化成 了脂肪细胞。在间充质细胞团块诱导分化成软骨细胞后，通过藏红染色 （safranin O dyeing），阿尔辛蓝染色（alcian blue dyeing），天狼星红染色 （Sirius red dyeing），COMP染色，胶原蛋白Ⅱ型和I型染色发现，与正常的 软骨细胞相似，表达了糖胺聚糖(GAG)，聚糖，胶原蛋白I型。

【实施例4】

在ABM-M培养基中培养的间充质干细胞的核型分析

与实施例1的1-2和1-3相似，ABM-M培养基传代培养10次（从生 长的细胞如骨髓，脂肪组织和其他组织中分离间充质干细胞后在含有2mM L-谷氨酰胺和10％的胎牛血清的培养基中），然后，分析培养的间充质干细 胞的核型。在20个中期分裂相（metakinesis phases）中，通过使用GTG显 带技术分析了5个中期分裂。核型命名与人类细胞遗传学国际命名体制 （International System for Cytogenetic Nomenclature）（2009）相一致。基于5 个监测的中期细胞，图11显示46个正常的XY核型，而图12显示46个正 常的XX核型。

如前所述，与现有的间充质干细胞培养基相比，高等基础培养基-间充 质干细胞（ABM-M培养基）保持间充质干细胞相同的细胞特征和分化潜能。 此外，有可能通过培养大量的间充质干细胞，通过使用具有优良的细胞生长 和增殖率的培养基以获得纯的间充质干细胞。