来自山冈单胞菌的低温蛋白酶及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的一种来自山冈单胞菌的蛋白酶及其相关生物材料与应用。

背景技术

蛋白酶是一类催化肽链中肽键水解的酶，已广泛应用于食品、医药、洗涤、纺织、制革、 发酵和废物处理等领域，其销售份额约占全球用酶的60％，是世界三大工业用酶之一。

近年来，随着基因工程、发酵技术的发展，蛋白酶工业得到了飞速的发展，在世界生产 蛋白酶工业中约有2/3是依赖微生物发酵生产的，其中利用最多的是芽孢杆菌属(Bacillus) 的细菌。但是，工业化生产的蛋白酶大多为中温酶，其菌株的生长温度为30℃以上，蛋白 酶的最适温度为45～50℃(倪永清,顾燕玲,史学伟,郑晓吉,韩亮,周红,程国栋.天 山一号冰川底部沉积层产蛋白酶耐低温菌株的筛选及其系统发育[J].微生物学报,2013, 53(2):164–172)，极大地限制了蛋白酶在低温领域的应用。低温蛋白酶在低温高效催化、 节省能源、热不稳定等方面有着中温蛋白酶无法比拟的优越性，因此，目前国内外学者已将 研究的热点转向寻找和开发新型微生物低温蛋白酶资源，以满足日新月异的工业发展和应用 的需求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种低温蛋白酶，该低温蛋白酶最适温度为30℃，在30℃～ 40℃范围内酶活力较高，40℃以上酶活力急骤下降，而在10℃时仍保持在70％以上。

本发明所提供的低温蛋白酶，其名称为Capro，来源于草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004，是如下a)或b)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2的蛋白质；

b)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有蛋白酶活性的蛋白质。

为了使上述(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(b)中的蛋白酶可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白 酶的编码基因可通过将序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基 的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所 示的标签的编码序列得到。

编码蛋白酶的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列表中SEQ ID No.1的第228-1319位核苷酸的cDNA分子或DNA分 子；

2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；

3)与1)限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的cDNA分 子或DNA分子。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1475个核苷酸组成，编码序列表中SEQ ID No.2所示 的蛋白质。

下述B1)-B12)中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

B1)编码Capro的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物或植物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物或植物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物或植物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物或植物细胞系。

上述生物材料中，所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达蛋白酶的DNA，该DNA不但可 包括启动蛋白酶基因转录的启动子，还可包括终止蛋白酶基因转录的终止子。进一步，所述 表达盒还可包括增强子序列。所述的含有蛋白酶基因的核酸分子的重组表达载体具体可为在 载体pUC118的多克隆位点插入蛋白酶编码基因得到的重组表达载体。所述的重组微生物具体 可为酵母，细菌，藻和真菌。细菌可具体为大肠杆菌E.coliDH5α。所述的转基因细胞系不包 括动物植物的繁殖材料。

本发明的又一个目的是提供一种制备蛋白酶的方法。

本发明所提供的制备蛋白酶的方法，包括将蛋白酶编码基因在生物细胞中进行表达得到 蛋白酶的步骤；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

本发明的再一个目的是提供一种制备表达蛋白酶的重组微生物的方法。

本发明所提供的制备表达蛋白酶的重组微生物的方法，包括将蛋白酶的编码基因导入受 体微生物细胞，得到表达蛋白酶的重组微生物的步骤。

上述制备表达蛋白酶的重组微生物的方法中，所述受体微生物具体可为酵母，细菌，藻 和真菌。所述细菌可具体为大肠杆菌E.coli DH5α。

上述生物材料在制备蛋白酶的应用也属于本发明保护的范围。

本发明所提供的来自草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的胞外蛋白 酶的最适温度为30℃，在30℃～40℃范围内酶活力较高，40℃以上酶活力急骤下降，而 在10℃时仍保持在70％以上，最适作用pH为7，在pH6.5～7.5范围内活性较高，是一种 中性低温金属蛋白酶。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)

生物材料的菌株编号：JZB120004

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2014年5月23日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.9193

附图说明

图1为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的菌落形态(KB平板上) 及革兰氏染色后的菌体形态；A-B为培养96h后的菌落形态；C为400×光学显微镜下观察 到的菌体形态。

图2为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病菌的抑菌活性 检测；A:对峙培养7天结果；B:对峙培养14天结果；C：无菌发酵上清液的抑菌活性检测结 果，C中左侧孔为对照，右侧孔为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性 物质。

图3为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病室内离体防效 测定结果；A：处理A；B：处理B；C：处理C；D：处理D。

图4为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004生防相关性状测定结果；A： 磷酸酯酶检测；B：几丁质酶检测；C：蛋白酶检测；D：嗜铁素检测。

图5为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在蛋白酶活性检测平板上 的透明圈。

图6为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA BamHⅠ酶切图 谱；1：15000bp DNA Ladder Marker；2：基因组DNA酶切0min；3：基因组DNA酶切60min。

图7为蛋白酶基因阳性克隆子的筛选；A：蛋白酶基因阳性转化子初筛结果；B：蛋白酶 基因阳性转化子复筛结果；B中1：重组大肠杆菌DH5α/pUC118；B中2：重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro。

图8为pUC118-capro质粒酶切检测结果；1：5000bp DNA Ladder Marker；2：pUC118 的BamHⅠ酶切片段；3：pUC118-capro的BamHⅠ酶切片段。

图9为重组大肠杆菌代谢物活性检测；1：重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培 养48h总蛋白溶液；2：重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液；3、重组 大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液；4、重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液。

图10为目的蛋白SDS-PAGE检测图谱；M：蛋白Marker；1、重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液；2、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的 诱导培养48h总蛋白溶液；3、重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液。

图11为温度和pH对蛋白酶capro活性的影响；A为温度蛋白酶活性的影响，B为pH对 蛋白酶活性的影响；E.coli表示DH5α/pUC118-capro，JZB120004表示草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本 发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常 规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

几丁质粉为美国Sigma化学试剂公司产品；BamH I酶、pUC118、Hind III内切酶、pMD18-T 载体为TAKARA公司产品；大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购于原平皓生物技术有限公司。实 施例中所用的培养基如下：

(1)PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1000mL。

(2)LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂15g，用蒸馏水 定容至1000mL，pH7.0-7.2。

(3)KB固体培养基：蛋白胨20g，MgSO₄·7H₂O1.5g，K₂HPO₄1.5g，甘油10ml，琼脂 20g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.8，121℃灭菌30min。

KB液体培养基(KB培养基中不加琼脂，即：蛋白胨20g，MgSO₄·7H₂O15g，K₂HPO₄15g， 甘油10ml，用蒸馏水定容至1000ml，pH6.8，121℃灭菌30min。

(4)磷酸酯酶检测培养基：酵母浸粉0.5g，葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Ca₃(PO₄)₂5 g，MgCl₂0.1g，KCl0.2g，FeSO₄0.1mg，MnSO₄·H₂O0.1mg，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0。

(5)嗜铁素(CAS)检测培养基：由4种溶液组成(溶液1-3及casamino acid)。

溶液1(CAS/HDTMA溶液)：铬天青(CAS)溶液：60.5mg CAS溶解在50ml水中；铁溶液：1 mmol/L FeCl₃·6H₂O溶解于10mmol/L HCI中,pH2.0；十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶液： 72.9mg HDTMA溶解于40ml水中。取10ml铁溶液与CAS溶液混合后加入到HDTMA溶液中，混均 后溶液呈蓝黑色，121℃灭菌15min，该液体即CAS/HDTMA溶液。

溶液2(Salts/Buffer溶液)：盐(Salts)溶液：将30.24g Pipes溶解于750mLSalts 溶液(KH₂PO₄0.3g，NaCl0.5g，NH₄Cl1.0g)中，以50％(W/V)KOH调节pH至6.8，加入15g 琼脂定容至800ml，121℃灭菌15min。

溶液3：甘露醇2g，葡萄糖2g，MgSO₄·7H₂O493mg，H₃BO₃1.4mg，CaCl₂11mg，MnSO₄·2H₂O 1.17mg，ZnSO₄·7H₂O1.2mg，Na₂MoO₄·2H₂O1mg，CuSO₄40μg，蒸馏水定容至750ml，121℃ 灭菌15min。

将溶液2与冷却至45-50℃左右溶液3混合后再与30ml已用微孔滤膜过滤除菌过的10％ (W/V)casamimo acid混合，最后加入溶液1，缓慢混均(避免产生泡沫)，倒平板。

(6)纤维素水解培养基：蛋白胨10g，KH₂PO₄1g，酵母浸粉10g，NaCl5g，羧甲基 纤维素钠10g，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，pH7.2。

(7)蛋白酶检测培养基：进口脱脂奶粉10g，琼脂15g，用去离子水定容至1000ml， 121℃灭菌15min。

(8)几丁质酶检测培养基：酵母提取物0.05g，胶体几丁质2g，KH₂PO₄1g，NaCl5g， 琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌25min。

(9)1.5％水琼脂培养基：琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃ 灭菌25min。

(10)TSA培养基：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水 1000mL，pH7.3。

(11)BUG+B培养基：BUG琼脂培养基57g，蒸馏水950mL，煮沸溶解，pH7.3±0.1，121℃ 灭菌15min，将50mL新鲜的脱纤羊血加入到已溶解冷却至45-50℃BUG琼脂培养基中，混均， 倒平板。

(12)胶体几丁质的制备：取10g几丁质粉溶于170mL4℃过夜预冷的浓盐酸中，磁力 搅拌器搅拌混匀后，置于4℃冰箱过夜，用蒸馏水反复洗至中性，定容到1000mL，4℃保存备 用。

(13)蛋白酶检测(重组子筛选)培养基：进口脱脂奶粉10g，琼脂15g，去离子水1000 ml，121℃灭菌15min。

实施例1、本发明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的分离及鉴定

1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的分离

以漠河永冻层、西藏雪域高原、海洋红树林等特殊生境采集的样品为对象，以传统的活 性筛选方法结合分子生物学和生理生化等技术，筛选果蔬作物重要真菌病害新的或稀有生防 因子。结果从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到一编号为JZB120004的 菌株，即草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004。

2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的鉴定

草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB固体培养基上产生紫色可溶性 色素，菌落扁平、光滑，直径为3-7mm；革兰氏阴性，菌体呈短杆状，直或近直(图1)。草 甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示，与 山岗单胞菌属全部3个种的模式菌株CCUG54728^T、CCUG54727^T和CCUG48868^T(Gene Bank： AY281137，AY281146和AJ310394)的16S rDNA序列相似性最高，均为99％。草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004为革兰氏阴性杆菌，好氧菌；产氧化酶、淀粉酶、蛋白 酶、几丁质酶、磷酸酯酶和嗜铁素，未检测到纤维素酶；适宜生长温度为20-28℃，25℃生长 最好，4℃下能缓慢生长，37℃以上不能生长。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004与该属模式菌株C.fungivorans CCUG48868^T、C.arenae CCUG54727^T、C.pratensis  CCUG54728^T的碳源代谢比较结果显示：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 和三株模式菌株对环糊精、糊精、淀粉、N-乙酰基-D-半乳糖胺、侧金盏花醇、α-D-乳糖、 D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、麦芽糖、赤藻糖醇、D-蜜二糖、D-棉子糖、β-甲基-D-葡萄 糖苷、D-半乳糖醛酸、丁二胺、L-棉子糖、γ-羟基丁酸、p-羟基苯乙酸、衣康酸、葡糖醛酰 胺、丙二酸、α-酮戊酸、癸二酸、松二糖、甘氨酰-L-天门冬氨酸、D-丙氨酸、羟基-L-脯氨 酸、L-组氨酸、胸腺嘧啶核苷、D-丝氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、 D,L-肉碱、苯乙胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇和1-磷酸葡萄糖的利用均为阴性；均为阳性的 是吐温40、吐温80、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-半乳糖、α-D- 葡萄糖、m-肌醇、D-甘露醇、D-甘露糖、D-乳糖酸内酯、D-葡萄糖酸、β-羟基丁酸、α-酮 戊二酸、丙酸、D-葡糖二酸、琥珀酸、琥珀酰胺酸、L-丙氨酸胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、 L-脯氨酸、肌苷、尿苷和丙三醇；对甲酸、D,L-乳酸、溴丁二酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨 酸、L-天冬酰胺酸和L-焦谷氨酸的利用均为弱阳性。而草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004对L-阿拉伯糖等21种碳源的利用情况与上述三株模式菌株不同(表1)。 草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与Collimonas pratensis CCUG54728^T有最高基因组相似性，为83.99±1.83％，高于DNA-DNA种的杂交水平的临界值70％，而与C. fungivorans CCUG48868^T和C.arenae CCUG54727^T基因组相似性分别仅为45.32±1.89％和 32.52±2.30％(表2)，均低于DNA-DNA种的杂交水平的临界值，草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004与C.pratensis CCUG54728^T对乳果糖、D-海藻糖、甲基丙酮酸、乙 酸、L-苏氨酸、顺-乌头酸、柠檬酸、奎尼酸、γ-氨基丁酸、尿刊酸、D,L-α-磷酸甘油和6- 磷酸葡萄糖的利用是不同的，结合菌落形态(KB固体培养基)和16S rDNA序列的差异，说明 草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004是草甸山岗单胞菌的一个新菌株。

表1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与C.fungivorans CCUG48868^T、 C.arenae CCUG54727^T和C.pratensis CCUG54728^T对21种碳源代谢的差异

注：+为阳性；-为阴性；w为弱阳性。

表2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004与C.fungivorans CCUG48868^T、 C.arenae CCUG54727^T和C.pratensis CCUG54728^T DNA-DNA杂交分析

具体实验方法如下：

分离鉴定参比菌株：食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans CCUG48868^T)、沙 土山冈单胞菌(Collimonas arenae CCUG54727^T)、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis  CCUG54728^T)均购自瑞典哥德堡大学菌种保藏中心(CCUG)。

2.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的培养性状与形态特征观察

将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004划线接种于KB固体培养基，25℃ 恒温培养3天后，观察菌落形态，有无色素的产生；通过革兰氏染色测定菌体大小，观察菌体 形态。

2.2草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的生理生化测定

草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的生理生化性状参照《常见细菌 系统鉴定手册》和《Bergey’s manual of systematic bacteriology》进行，碳源利用采 用Biolog鉴定系统进行。

培养温度试验：测定菌株适宜生长的温度。将菌种接入KB固体培养基，分别于4℃、 10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃、45℃恒温下培养7d和15d， 观察其生长情况。

氧化酶试验：蘸取少许菌苔于洁净的一小块滤纸，将10g/L盐酸二甲基对苯二胺溶液滴 1滴于菌落上，若为阴性则不变色，若为阳性则立刻变为红色，继而逐渐加深。

革兰氏染色：挑取平板培养24h的细菌菌苔些许，用结晶紫染色1min，水洗；滴加 碘液冲去残水并染色1min，水洗；脱色20-30s用95％乙醇，水洗，轻轻用滤纸吸干后蕃 红复染1min，水洗，风干后镜检。

Biolog鉴定试验：依据革兰氏染色、氧化酶试验结果，确定菌株类型，依照Biolog微 生物鉴定流程，选择与菌株鉴定类型相对应的鉴定板以及培养条件。将菌株在KB(TSA)固 体培养基连续培养3-4代，选择培养生长良好的单菌落，转接到BUG+B固体培养基上，于 25℃培养24-48h,用无菌竹签挑取少量新鲜菌落,将其用专用接种液制备为均一菌悬液， 与标准菌悬液进行浊度对比，误差控制在±2％；用八通道移液器将菌悬液接种到Biolog GN₂板，每孔接种菌悬液150μl。将接种好的鉴定板编号并置于25℃培养，在培养24h后每隔 4h用读数仪读取菌株特征性碳源代谢指纹特征，直至培养时间为120h，比对分析试验结 果。

2.3草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的16S rDNA序列测定

利用16S rDNA扩增通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'及1492R： 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'PCR扩增菌株JZB120004的16S rDNA，并进行测序，测序结果 表明菌株JZB120004的16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。

2.4草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的DNA-DNA杂交测定

采用液相复性速率方法测定两株菌种的DNA-DNA杂交率。所用仪器为Perkin Elmer  Lambda35UV/VIS Spectrophotometer。温度控制用PTP-1Peltier System数字控温系统。

具体实验步骤如下：

1)DNA样品处理：提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中用超声波40W处理24min(设 定为：工作3s/停3s；DNA样品浓度为2.0)，将DNA样品剪切为2-5×10⁵道尔顿的片段。

2)将待测DNA样品分别用0.1×SSC精确配制成为OD_260nm1.8-2.0，且两者OD_260nm值一致(精 确到0.001)；

3)进入UV Winlab程序，出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过 Timed.lnst.Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260_nm，总测定时间设定为30 min。按照已经测定的G+C mol％计算最适复性温度(optimal renaturation temperature， TOR)，将比色杯的温度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式： TOR＝0.51×(G+C)mol％+47计算。

4)取两株菌种DNA样品各400ul分别装在两个离心管中，再取两株菌种DNA样品各200 ul装在同一个离心管中为混合样品；

5)单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统设置100℃变性15min， 然后降温至最适复性温度。记录OD260_nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程 样品的温度都不得低于TOR，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线；

6)根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope，得出复性速率(V)，即 斜率(通常V表示为每分钟吸光值的减少值)；

7)根据公式计算同源杂交率(H)％＝4Vm-(Va+Vb)/2(VaVb)1/2×100％。

实施例2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004抑菌谱测定

草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对病原菌的抑制活性具有很强的 专化性，在所供试的病原真菌、细菌和酵母菌中，仅对桃褐腐病菌有较强的抑制作用，而对 其它病原菌均无抑制作用。食真菌山冈单胞菌(Collimonas fungivorans CCUG48868^T)、 沙土山冈单胞菌(Collimonas arenae CCUG54727^T)和草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis  CCUG54728^T)对桃褐腐病菌均无抑制作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004对桃褐腐病室内离体防治效果为86.4％。

具体实验方法和实验结果如下：

靶标病原菌：甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，小麦纹枯病菌，小麦赤霉病菌(Fusarium  graminearum)，番茄灰霉病菌，桃褐腐病菌，大白菜黑腐病菌，茄子青枯病原菌，平菇褐斑 病菌，黄瓜角斑病原菌，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CICC10366)，蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均由北京市农林科学院植物 保护环境保护研究所和中国农业大学植病系提供。其中，甘蓝枯萎病菌为尖孢镰刀菌粘团专 化型[Fusarium oxysporum Schl.f.sp.conglutinans(Wollenw.)Snyder&Hansen](李 明远等.十字花科蔬菜枯萎病及其病原鉴定.植物保护.2003年6第29卷第3期)；西瓜枯萎 病菌为西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)(耿丽华等.西瓜枯萎病菌生 理小种鉴定技术体系的建立和验证.中国蔬菜.2010(20)：52-56)；小麦纹枯病菌为小麦纹 枯病菌(Rhizoctonia cereali)(纪兆林等.小麦纹枯病菌毒素对小麦植株的作用.扬州大 学学报(农业与生命科学版)第32卷第3期2011年9月p55-59)；番茄灰霉病菌为灰葡萄 孢(Botrytis cinerea Per.ex Fr.)(李兴红等.北京地区番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检 测.植物保护.2012.38(4)：141-143)；桃褐腐病菌为美澳型核果链核盘菌(Monilinia  fructicola(Wint.)Honey)(陈育，桃褐腐病菌Cytb基因1166bp内含子对G143A突变影 响的分子机理初步研究[D]，武汉：华中农业大学，2012)；平菇褐斑病菌为托拉斯假单胞杆 菌(Pseudomonas tolaasii Paine)(金丹等.一种平菇褐斑病病原菌的鉴定.食用菌学报. 200916(1)：89～91)；黄瓜角斑病原菌为黄瓜角斑病菌(Pseudomonas syringae pv. lachrymans)(A.T.Alleyne.et.al.Identification of Pseudomonas syringae pv. lachrymans in Barbados by rep-PCR.Journal of Agricultural Science and Technology  B1(2001)593-597)；茄子青枯病菌(Ralstonia solanacearum)(封林林等.茄子青枯病抗 性材料的鉴定及性状观察.长江蔬菜.2000年第10期P35)；大白菜黑腐病菌为大白菜黑腐 病菌(Xanthomonas campestris pv.campsetris)(翟文慧等.大白菜黑腐病鉴定的湿度试验 及其苗期与成株期抗病性的相关分析.中国蔬菜.2010(10)：59-63)。

1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原真菌抑菌活性检测

以上述甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，小麦纹枯病菌，小麦赤霉病菌(Fusarium  graminearum)，番茄灰霉病菌和桃褐腐病菌这六种真菌为病原真菌，采用平板对峙培养法测 定草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原真菌抑菌活性，具体方 法如下：

将已在PDA平板上活化好的每种病原真菌，用7mm无菌打孔器在菌落边缘打制病原真菌 菌饼，接种于9cm PDA平板中央，培养2天，将已活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004点接于距病原真菌菌饼约2cm处，设不接种草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004的处理为对照，25℃培养，至对照长满整个平板，观 察记录抑菌情况。抑菌率＝(对照病原菌直径-处理病原菌直径)/(对照病原菌直径-7mm) ×100％。实验重复三次，每次重复每种病原真菌3个平板。结果表明对所供试的病原真菌中， 草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004只对桃褐腐病菌——美澳型核果链核 盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)有抑菌作用，对甘蓝枯萎病菌，西瓜枯萎病 菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)，小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cereali)， 小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)，番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)这些病原真 菌均无抑菌作用。草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病菌—— 美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)的抑制能力在1-7天时较好 并逐渐增强，在第7天时最大抑菌带宽为8mm，抑菌率达64.29％(图2中A)，7天以后抑 制效果逐渐下降(图2中B)。表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004只 能暂时抑制桃褐腐病菌的生长，而不能杀死其病原菌。

2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植物病原细菌及酵母菌抑菌 活性检测。

以大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campsetris)，茄子青枯病原菌 (Ralstonia solanacearum)，平菇褐斑病菌(Pseudomonas tolaasii)，黄瓜角斑病原菌 (Pseudomonas syringae pv.Lachrymans)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis  CICC10366)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 为病原菌，采用双层培养法测定草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对植 物病原细菌及酵母菌抑菌活性，具体方法如下：将活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004点接于KB固体培养基平板，25℃培养72-96h，加入5mL氯仿，静 置10-12h，以其蒸汽杀死菌体且使氯仿蒸气完全挥发。供试病原在LB培养基平板上活化， 28℃恒温静置培养24h，制备成10⁸CFU/mL的菌悬液。取100μl菌悬液加入到3mL1％水 琼脂中(已融化且冷却至50℃左右)，迅速混匀，倒入已杀死菌体的培养基平板上，铺成 均匀的薄层，每个处理三皿重复，28℃静置培养24-48h，观察是否有抑菌活性，如有抑菌 圈则有抑菌活性，测量抑菌圈直径，如无抑菌圈，则无抑菌作用。结果表明草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004的代谢物对大白菜黑腐病菌(Xanthomonas campestris  pv.campsetris)，茄子青枯病原菌(Ralstonia solanacearum)，平菇褐斑病菌(Pseudomonas  tolaasii Paine)，黄瓜角斑病原菌(Pseudomonas syringae pv.Lachrymans)，枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis CICC10366)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)均无抑制作用。

3、抑菌圈法检测草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质抑菌活 性

3.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备

将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种到KB液体培养基(100mL /500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB 液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡发酵培养96h，10000r/min 离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，收集滤液得到草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004活性物质。

3.2桃褐腐病菌孢子悬浮液制备

桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)在PDA平 板上25℃培养5-7天，待平板上产生大量的分生孢子后，用无菌水洗下孢子，制成10⁶CFU/ml 的病原菌孢子悬液。

3.3抑菌圈法检测草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质对桃褐 腐病菌的抑菌活性

取200μL3.2的病原菌孢子悬液均匀涂布在9cm PDA平板上，用7mm无菌打孔器等距 离打制两个孔，向孔内分别注入3.1的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 活性物质和无菌KB液体培养基(对照)100μL，每个处理三次重复，25℃恒温培养48h， 十字交叉法测量抑菌圈的直径。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 活性物质的抑菌圈直径为23mm(图2中C)，表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis) JZB120004在发酵过程中产生了抑制桃褐腐病菌的活性物质。

4、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004对桃褐腐病室内离体防效检测

以本申请的发明人从西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分离得到的编号为 ZLZ261的另一株不产几丁质酶的山岗单胞菌，即山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261(W.LIU, et al.Collimonas sp.ZLZ261—A novel antagonistic strain against Monilinia  fructicola.Phytopathology103(Suppl.2):S2.84.VOLUME103,NUMBER6(SUPPLEMENT)JUNE 2013)为对照菌株，按照与草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004相同的实验 方法测定山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261对桃褐腐病室内离体防效。具体方法如下：

4.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备

将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种到KB液体培养基(100mL /500mL锥形瓶)，25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB 液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)，接种后的KB液体培养基的OD_600nm值为0.1，25℃160 r/min振荡发酵培养96h，10000r/min离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过 滤除菌，收集滤液得到草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质。

4.2山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质的制备

将步骤4.1草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的制备中的 草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004替换为山岗单胞菌Collimonas sp. ZLZ261，其它步骤均不变，得到山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261的活性物质，具体方法 如下：

山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261接种到KB液体培养基(100mL/500mL锥形瓶)， 25℃160r/min振荡培养36h得到种子液，按5％的接种量转接到KB液体培养基(100mL/500 mL锥形瓶)，接种后的KB液体培养基的OD_600nm值为0.1，25℃160r/min振荡发酵培养96h， 10000r/min离心15min取上清液并用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，收集滤液得到山岗 单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质。

4.3、对桃褐腐病防效测定

实验重复三次，每次重复的实验方法如下：挑选品种、成熟度(90％)、物理状态一致， 大小均匀，无机械损伤、无病虫害侵染的新鲜市售毛桃为供试果实。先用0.5％NaClO将果实 处理1min，用无菌水多次冲洗干净。在桃子果实腰部用无菌接种针刺5mm(深)×3mm(宽) 的伤口，伤口晾干后，将60个桃子果实随机均分为5组，每组12个桃子果实，分别为处理 A(阴性对照)、处理B、处理C、处理D和处理E。处理A的每个桃子果实接种50μl无菌 水，待完全吸收后，接种50μl10⁶CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia  fructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液；处理B的每个桃子果实接种50μl步骤4.1的草 甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质，待完全吸收后，接种50μl10⁶CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)孢 子悬浮液；处理C的每个桃子果实接种50μl50％多菌灵可湿性粉剂500倍液(简称500×多 菌灵)，待完全吸收后，接种50μl10⁶CFU/ml的桃褐腐病菌—美澳型核果链核盘菌(Monilinia  fructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液；处理D的每个桃子果实只接种50μl无菌水，不 接种桃褐腐病菌孢子悬浮液；处理E的每个桃子果实接种50μl步骤4.2的山岗单胞菌 Collimonas sp.ZLZ261活性物质，待完全吸收后，接种50μl10⁶CFU/ml的桃褐腐病菌— 美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Wint.)Honey)孢子悬浮液。25℃，保湿 培养5天后，统计各处理发病情况和病斑直径。根据病斑直径按照如下公式计算桃褐腐病的 防治效果：防治效果(％)＝(处理A病斑直径－相应处理的病斑直径)/处理A病斑直径×100％。

表3、接种桃褐腐病菌5天时各个处理对桃褐腐病的防治效果

结果如图3和表3所示，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物 质能够明显抑制桃褐腐病病斑的扩展，病斑面积显著低于阴性对照处理。其中，只接桃褐腐 病菌孢子悬浮液的阴性对照在接种桃褐腐病菌2天后已全部发病，而用草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004活性物质和500×多菌灵处理后的桃子均未出现病斑； 在接种桃褐腐病菌后的第5天调查时，阴性对照病斑直径均在32mm以上，而接种了草甸山 岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004活性物质的果实发病率在50％以下，且发病果 实的病斑直径都远远小于阴性对照(图3)，仅为7mm左右，对桃褐腐病的防治效果为86.4％； 接种了山岗单胞菌Collimonas sp.ZLZ261活性物质的果实发病率为100％，发病果实的病斑 直径为20mm左右，对桃褐腐病的防治效果为40.9％。可见，草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004产生的代谢物对桃褐腐病的防治效果是山岗单胞菌Collimonas sp. ZLZ261产生的代谢物的2.1倍。

实施例3、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004生防相关性状检测

磷酸酯酶检测试验：采用点接法将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 接种于磷酸酯酶检测培养基，于25℃恒温培养，分别在3天、6天、9天、14天观察菌落周 围有无透明圈形成，如有则为阳性，反之为阴性。

嗜铁素(CAS)检测试验：将活化好的草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 菌株点接于嗜铁素检测培养基，25℃培养5-7d，观察菌落外围是否产生黄色晕圈。

纤维素酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004点接于纤 维素水解培养基，25℃培养5d，用4g/L的刚果红染色5min，再用0.9％NaCl冲洗，观察 菌落周围有无透明圈形成，如有则为阳性，反之为阴性。

蛋白酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004菌株点接于 蛋白酶检测培养基，25℃培养3-4d，观察菌落周围是否有透明圈产生，如有则为阳性，反 之为阴性。

几丁质酶检测试验：将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接种于几 丁质酶检测培养基，25℃培养10-14d，观察菌落周围是否有透明圈产生，如有则为阳性， 反之为阴性。

检测生防相关性状的结果显示：草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004 能够产生蛋白酶、几丁质酶、磷酸酯酶、嗜铁素，未检测到纤维素酶(图4)。

实施例4、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004中蛋白酶Capro基因的 获得

1、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的蛋白酶活性测定

采用透明圈法，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB平板上划线接 种，25℃静置培养48-72h，挑单菌落点接于蛋白酶检测培养基，25℃培养3-5d，以接种 于1.5％水琼脂培养基的处理为对照，观察菌落周围是否有透明圈产生。结果表明草甸山岗单 胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004菌株在蛋白酶检测平板上25℃培养4d后，菌落直 径为0.5cm，菌落周围产生了明显的透明圈，其直径为3.6cm，透明圈直径/菌落直经的比值 达到7.2(图5)，表明其扩散至培养基中的代谢产物具有很强的蛋白酶活性。

2、草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组文库的构建及阳性克隆 子的筛选

2.1基因组DNA的部分消化及目的片段回收

用BamHⅠ对草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA进行部分 酶切，反应体系为50μL：10×buffer K5μL，BamHⅠ1μL，基因组DNA20μL，ddH₂O 24μL。同时设置6个平行反应，其中一份用ddH₂O替代酶作为对照，37℃恒温反应；每20 min取出一份反应产物，加5μL10×loading buffer置于-20℃终止反应；0.7％琼脂糖凝 胶电泳检验酶切反应程度。BamH I酶切不同时间的结果表明，草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004基因组DNA在酶切反应时间低于60min时酶切不充分；当酶切60min 时，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA消化程度符合试验要 求(图6)；时间超过90min，酶切过度，片段多为小片段，不利于建库。因此，试验选酶 切60min作为草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004基因组DNA部分消化时 间。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化1-7.5kb DNA酶切片段，-20℃保存备用。

2.2质粒酶切及去磷酸化

BamHⅠ酶切质粒pUC118，反应体系为50μL：10×buffer K5μL，BamHⅠ2.5μL， pUC11825μL，ddH₂O17.5μL，37℃反应3h，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收质 粒酶切片段进行去磷酸化，反应体系为50μL：10×buffer5μL，质粒酶切回收片段20μL， CIAP1μL，ddH₂O24μL，37℃保温30min后，65℃反应30min灭活CIAP，普通DNA 产物回收试剂盒回收目的片段，-20℃保存备用。

2.3表达载体的构建及转化

T4DNA Ligase连接基因组酶切片段与pUC118载体酶切去磷酸化片段，热击法转入大肠 杆菌DH5α，涂布于LB平板(含100μg/mL氨苄青霉素、24μg/mL IPTG、40μg/mL X-Gal)， 37℃静置培养过夜，随机挑选20个白色转化子利用通用引物BcaBEST Primer M13-47 (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和BcaBEST Primer RV-M(5’- GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)进行菌落PCR检测文库平均插入片段的大小。扩增条件： 95℃预变性5min，94℃变性40s；53℃退火40s，72℃延伸1min30s，运行35个 循环；最后72℃延伸10min。随机挑选10000个阳性转化子作为文库保存。

2.4含有草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004蛋白酶基因阳性克隆的筛 选

将构建好的基因组文库涂布于重组子筛选平板(含100μg/mL氨苄青霉素、24μg/mL IPTG)，37℃恒温培养2d，观察到有一重组子菌落周围出现明显的透明圈(图7中A)， 将该重组子中含有的重组质粒命名为pUC118-capro，将该重组子命名为重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro。

将pUC118导入大肠杆菌DH5α得到的重组子命名为重组大肠杆菌DH5α/pUC118，作为 空载载体转化子。

按照步骤1的方法测定重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro和重组大肠杆菌DH5α/pUC118 的蛋白酶活性(图7中B)，表明重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro菌落周围产生了明显的 透明圈，重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro能产生蛋白酶，已携带了蛋白酶基因，将该基因 命名为capro。重组大肠杆菌DH5α/pUC118菌落周围没有产生透明圈，不产生蛋白酶。

2.5草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004蛋白酶基因序列测定及结构分 析

酶切验证重组质粒pUC118-capro插入片段大小约为1.5kb左右(图8)，测序结果表 明pUC118-capro为用SEQ ID No.1的DNA分子替换pUC118的BamHⅠ位点得到的重组表达 载体。SEQ ID No.1由1475个核苷酸组成，其编码序列是SEQ ID No.1的第228-1319位， 编码SEQ ID No.2的蛋白质Capro。SEQ ID No.2由363个氨基酸组成，其中酸性氨基酸29 个，碱性氨基酸个28个，所有氨基酸组成中，丙氨酸(Ala)含量最高，为13.8％，甲硫氨 酸(Met)含量最低，为0.6％。ExPASy服务系统中ProtParam软件计算结果表明该基因编码 蛋白的分子量为37.97kDa，理论等电点6.65，不稳定系数28.01，总平均疏水性-0.264， 是一个稳定的亲水蛋白。

3、蛋白酶基因的诱导表达及检测

将蛋白酶基因阳性转化子—重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro接种于LB液体培养基(含 100μg/mL氨苄青霉素)，37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以 同样的培养条件培养至菌液的OD₆₀₀值达0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃180r/min 分别诱导培养24h和48h，4000r/min离心10min，收集上清液，诱导培养24h的上清液 即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液，诱导培养48h的上清液 即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液。

同时，将重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro接种于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄 青霉素)，37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以同样的培养条件 培养至菌液的OD₆₀₀值达0.5，30℃180r/min培养48h，4000r/min离心10min，收集上 清液，该上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液。

同时，将重组大肠杆菌DH5α/pUC118接种于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)， 37℃180r/min振荡培养过夜，再按1％的接种量转接一次，以同样的培养条件培养至菌液 的OD₆₀₀值达0.5，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，30℃180r/min诱导培养48h，4000r/min 离心10min，收集上清液，该上清液即为重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋 白溶液。

按照步骤1的方法测定重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液、 重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液、重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液和重组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养 48h总蛋白溶液的蛋白酶活性，各孔加液量均为100μL，结果表明重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro的诱导培养24h总蛋白溶液、重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱 导培养48h总蛋白溶液可见明显的透明圈，说明其具有蛋白酶活性，且诱导培养48h的酶活 性强于培养24h的，而重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro非诱导培养48h总蛋白溶液和重 组大肠杆菌DH5α/pUC118的诱导培养48h总蛋白溶液的对照均未见透明圈(图9)，由此证 明了蛋白酶capro基因已在大肠杆菌DH5α中诱导表达；经SDS-PAGE(12％的分离胶和5％的浓 缩胶)电泳法检测蛋白酶capro基因的表达见图10。经验证,此蛋白酶capro分子量大约为 38kDa。

实施例5、利用草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和含有蛋白酶Capro 基因的工程菌生产蛋白酶生物学特性检测

1.1蛋白酶酶活测定

草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在KB液体培养基中25℃160r/min 振荡培养3-5d，4000r/min离心10min，收集上清液，该上清液即为草甸山岗单胞菌 (Collimonas pratensis)JZB120004的总蛋白溶液。

将草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的总蛋白溶液和实施例4步骤3 中的重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的诱导培养48h总蛋白溶液分别在pH7.5、150mmol/L 的PBS缓冲液中用孔径为3.5kDa透析袋透析处理，真空冷冻干燥至粉状即为粗酶粉样品，取1 mg粗酶样品溶解于10mL蒸馏水得粗酶液。采用Folin法测定粗酶液酶活，反应温度为30℃， pH值7.5，反应时间：10min，反应体积为4mL。具体方法如下：

(1)Folin试剂的配制

于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠(Na₂Wo₄·2H₂O)100g、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)25g、 去离子水700mL、85％磷酸50mL、浓盐酸100mL，温火沸腾回流10h；在通风橱中加入硫酸锂 (Li₂SO₄)100g、去离子水50mL和数滴浓溴水(99％)，再微沸15min，以除去多余的溴，冷却， 用去离子水定溶至1000ml。混匀过滤。贮存于棕色瓶内备用。

使用溶液：一份福林试剂与二份去离子水混合，摇匀。

(2)10g/L酪蛋白底物溶液配制

精确称取酪蛋白1g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的磷酸缓冲液 (pH＝7.5)约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中， 用磷酸缓冲液(pH＝7.5)稀释至刻度。当天配用或置于冰箱中保存3d。

(3)100μg/mL酪氨酸溶液配制

精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入 冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。

(4)酪氨酸标准曲线的绘制

分别吸取100μg/mL酪氨酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于试管中，并用去离 子水稀释至1mL，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00mL、Folin试剂使用溶液1.00mL，置于 30℃水浴中显色20min，取出，用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的 处理为空白对照，分别测定其吸光度。以吸光值OD₆₈₀为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标， 绘制标准曲线，线性回归求直线方程，计算当吸光值为1时酪氨酸的量(μg/mL)，即为吸光 常数K值。

(5)样品酶活测定

粗酶液用去离子水稀释至吸光值在0.25～0.40范围内，取1mL加入试管中，30℃水浴 3min，加入同样预热过的10g/L酪蛋白底物溶液1mL，精确反应10min，加0.4mol/L三氯乙 酸2mL中止反应，混匀，30℃水浴沉淀15min，过滤，取1.00mL滤液，加0.4mol/L碳酸钠 溶液5mL，再加Folin试剂使用液1mL,混匀，30℃水浴显色20min，冷却后于680nm波长， 用10mm比色皿测其吸光度；对照在加2％酪蛋白前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL使酶失活再加 酪蛋白。

以30℃、pH7.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力 单位(U)，按下式计算1mL粗酶液中所含的酶活力单位：

酶活力(U/mL)＝K×OD₆₈₀×N×4/10

式中N为酶的稀释倍数，4为反应体积，10为反应时间(min)。

实验重复三次。结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004在上述 发酵条件下制备的粗酶液的蛋白酶酶活为(48.594±1.36)U/mL，换算成粗酶粉的酶活为 (485.94±13.6)U/mg；重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro的粗酶液和粗酶粉蛋白酶酶活分 别为(47.839±1.05)U/mL和(478.39±10.5)U/mg。

1.2温度对蛋白酶活性的影响

取200μL粗酶液与800μL1％酪蛋白溶液(pH7.5)混匀，分别在0-60℃条件下测定酶 活力，以最高酶活力为100％，计算其他条件下的相对酶活力，绘制酶活力温度曲线。除酶反 应温度不同外，蛋白酶活测定方法的其它条件与1.1蛋白酶酶活测定相同。

结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro所产的Capro最适温度均为30℃，在30℃～40℃范围内酶活力较高， 40℃以上酶活力急骤下降，而在10℃时仍保持在70％以上(图11)，表现出低温蛋白酶特 性。

1.3pH对蛋白酶活性的影响

设置pH4-10的梯度缓冲液(pH4-5采用醋酸-醋酸钠缓冲液，pH6-8采用磷酸盐缓冲液， pH9-10采用Gly-NaOH缓冲液)，粗酶液分别在各pH梯度缓冲液中室温处理60min，测定酶 活，以最高酶活力为100％，绘制酶活力pH曲线。除酶反应pH不同外，蛋白酶活测定方法的 其它条件与1.1蛋白酶酶活测定相同。

结果表明草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro所产的Capro，不同的pH条件也影响其酶活性，最适作用pH为7，在 pH6.5～7.5范围内活性较高，过酸或过碱的环境均对酶活有较大的抑制作用(图11)，属 中性蛋白酶。

1.4金属离子对蛋白酶活力的影响

取浓度为10mmol/L的Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺等10种金属离子及金属蛋白 酶抑制剂EDTA(pH7.0)分别与粗酶液混合，使离子终浓度为10mmol/L，除离子浓度不同外， 蛋白酶活测定方法的其它条件与步骤1.1蛋白酶酶活测定相同。以粗酶液在步骤1.1的条件 下测定的酶活力为100％(CK)，检测各处理对酶活力的影响，实验重复三次，并利用SPSS软 件通过Fischer’s最小显著差数法进行差异显著性分析。

金属蛋白酶抑制剂EDTA及金属离子对Capro酶活影响试验结果显示(表4)，该蛋白酶 对EDTA非常敏感，10mmol/L的浓度就可使酶基本失活。各种金属离子对蛋白酶活性的影响 存在差异。Zn²⁺、Mn²⁺对酶活有激活作用，当Zn²⁺浓度为10mmol/L时，重组大肠杆菌 DH5α/pUC118-capro所产蛋白酶的酶活力是在步骤1.1的条件下测定的酶活力的 171.43±6.3％，草甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004所产蛋白酶的酶活力 是在步骤1.1的条件下测定的酶活力的172.45±2.3％；Na⁺、K⁺对酶活无显著影响；而Co²⁺、 Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺和Mg²⁺则对酶活表现出了抑制作用，其中以Co²⁺的抑制作用最强，其浓度 为10mmol/L时，重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro和草甸山岗单胞菌(Collimonas  pratensis)JZB120004的蛋白酶酶活分别仅为在步骤1.1的条件下测定的酶活力的 10.71±5.1％和15.82±2.8％；Ca²⁺和Mg²⁺抑制作用较弱。由此可见，Capro具有金属蛋白酶的 典型特征。

表4、不同金属离子处理对酶活力的影响

注：表中相对酶活为平均值±标准差；其后的小写字母仅表示差异显著性分析结果，同一列 内带有不同字母的均值在a＝0.05水平上具有显著性差异。

SPSS独立样本t检验的结果表明，不同温度、pH及金属离子对Capro酶活性的影响在草 甸山岗单胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重组大肠杆菌DH5α/pUC118-capro之 间均无显著性差异。