法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-08-10
授权
授权
2014-06-25
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N21/65 申请日:20120914
实质审查的生效
2014-03-26
公开
公开
技术领域
本发明涉及化学糖生物学领域，尤其涉及4-巯基苯硼酸修饰的金纳米 粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法。
背景技术
生物正交反应在化学生物学领域有非常广泛的运用，是一种两步化学 标记法。在糖生物学领域，第一步，通过有机合成方法在天然单糖分子上 修饰生物正交基团（例如：叠氮或端炔，最为常用），而后通过生物体自 身代谢被整合到生物糖链中；第二步，通过上一步的整合后，天然糖链中 带有了一个化学报告基团，用一个携带生物正交互补的基团的分子，通过 化学反应的方式对目标分子进行检测、成像和分离。虽然这种两步化学标 记法在生物分子的检测、成像和分离方面，尤其是生物分子动态变化方面， 取得了重要的进展；然而，此方法仍存在一系列的问题需要研究者们解决。 一，合成修饰上的正交基团对分子单体本身的理化性质有一定的改变；二， 后续的化学反应检测体系的生物相容性问题；三，活体动态标记很受限制。
针对这些问题，研究者们的解决思路集中在改善化学反应的生物相容 性方面；以Ac4ManNAz生物代谢标记为例，其方略为：
以铜催化叠氮与炔［3＋2］环加成反应为例。此反应催化用的的Cu(I) 的细胞毒性非常强，研究者们把重心一方面放在开发配体来降低其毒性， 并提高反应速率上（以BTTAA最为常用），另一方面放在活化炔上（以环 辛炔及其衍生物最为成功）。配体的方法虽然能够很大程度地加快反应速 率，但Cu（I）的毒性只能得到一定程度的降低；而活化炔的方法不使用 Cu（I）催化剂，仅通过环张力和共轭的方式来降低环加成反应的活化能， 实现提高反应速率的目的。活化炔的方法最大的缺点就是炔的活化很复 杂，合成成本高、吸附背景高、相对于催化反应速率慢、而且生物相溶性 问题也未得到很好的解决。
拉曼（Raman）是一种非化学标记的成像和检测方法，可以对特定的 具有Raman信号的基团进行检测和成像。在细胞的Raman成像中，存在 一段Raman信号沉默的区域（1800-2800cm-1），即此区域内没有细胞的任 何信号。所以，使用Raman信号在此沉默区域的目标基团作为天然糖衍 生物的修饰基团（例如，炔基的Raman信号在2100cm-1左右）进行细胞 甚至活体切片的Raman检测和成像。然而，Raman信号相对于荧光信号 来说非常弱，其对于细胞膜上富含的磷脂的检测和成像都显得有些困难 （需要使用功率较强的激光器），那么对于细胞膜表面的少量的含Raman 信号基团的非天然糖的检测和成像更是不可实现。
表面增强拉曼（SERS）是Au、Ag等金属表面对于Raman信号的一 种增强现象，一般可以实现106-1012的增强效果。这一增强很可能就使得 细胞膜表面的少量的含Raman信号基团的非天然糖的检测和成像成为可 能。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的上述缺陷，提供4-巯基苯硼酸修饰 的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖标记的方法，在标签不发生化学反应 的基础上实现对标签的直接检测。
具体地，本发明提供一种4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子，其通过下 述方法制备：
1）将HAuCl4（氯金酸）水溶液加热至回流，在搅拌下加入柠檬酸钠 溶液；
2）室温冷却，获得金纳米粒子晶种；
3）将获得的金纳米粒子晶种加入超纯水中，在搅拌下加入柠檬酸钠、 HAuCl4和盐酸羟胺溶液，室温搅拌，获得金纳米粒子；
4）向获得的金纳米粒子中加入4-巯基苯硼酸的乙醇溶液，室温搅拌 8-24小时，即得所述4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子。
优选地，步骤1）所述HAuCl4水溶液的质量浓度为0.01%，柠檬酸钠 溶液的质量浓度为1%。
优选地，步骤3）中柠檬酸钠的质量浓度为1%、HAuCl4的质量浓度 为1%，的盐酸羟胺溶液的浓度为10mM。
所述的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子可以用于检测细胞表面糖标 记。
本发明还提供一种检测细胞表面糖标记的方法，其包含以下步骤：
1）使用含非天然单糖的培养基培养细胞；
2）将培养的细胞与权利要求1制备的4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒 子的溶液共孵育，使4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子结合到细胞表面的唾 液酸上；
3）使用拉曼光谱仪检测细胞膜表面的拉曼标签信号，根据采集的信 号判断细胞表面是否存在所述非天然单糖。
优选地，所述非天然单糖为含叠氮、炔基或氘代甲基的非天然单糖。 更优选地，所述非天然单糖为Ac4ManNAz或d3-Ac4ManNAz。
优选地，所述细胞为HeLa和/或CHO细胞。所述Ac4ManNAz的浓 度范围为0.01μM至100μM。
更优选地50μM的Ac4ManNAl培养CHO细胞时，孵育时间最少为 34小时。
本发明提供4-巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子及用其检测细胞表面糖 标记的方法，检测糖代谢标记，并提供了更为接近天然产物的标签，在标 签不发生化学反应的基础上实现对标签的直接检测。在无需有毒催化剂等 的条件下，运用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的 细胞表面糖检测的方法。这种方法在无需有毒催化剂等的条件下，运用纳 米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的细胞表面糖检测 的方法。这种方法实现了高灵敏度的检测。而且该方法适用于各种细胞表 面非天然糖的检测。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举 较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是使用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号标签标记的 细胞表面糖检测的示意图。
图2是Raman光谱仪的暗场成像，图中的亮点（箭头所示）表示金纳 米粒子。
图3和图4分别是CHO和HeLa细胞中检测细胞膜表面的叠氮和炔基的 Raman信号。
图5和图6分别是CHO和HeLa细胞中检测氘代甲基的Raman信号。
具体实施方式
请参照图1，其是使用纳米金表面增强拉曼技术实现对特殊拉曼信号 标签标记的细胞表面糖检测的示意图，非天然的单糖（以式Ⅰ的 Ac4ManNAz为例）被代谢到细胞表面后变为非天然的唾液酸（式Ⅱ的 NeuNAz），4-巯基苯硼酸（MPBA）修饰的金纳米粒子（AuMPBA）与唾 液酸8,9-位上两个羟基反应生成如图所示的产物。通过金纳米粒子 （AuNPs）的表面增强拉曼就可以实现对非天然Raman标签的检测。
式Ⅰ 式Ⅱ
实施例1AuMPBA的合成
使用柠檬酸钠还原的两步法合成120nm的金纳米粒子。第一步，100 ml0.01%的HAuCl4水溶液加热至回流，在快速搅拌下迅速加入1ml1%的 柠檬酸钠溶液。回流15min之后，室温冷却即得40nm的AuNPs晶种。 第二步，4ml40nm的AuNPs的晶种加入56ml超纯水中，在搅拌下加入 0.9ml1%的柠檬酸钠、0.9ml1%的HAuCl4和1.4ml 10mM的盐酸羟胺 溶液，室温搅拌1h即得120nm的AuNPs。最后在乙醇溶液中使用MPBA 替换柠檬酸根，就形成了120nm的AuMPBA。具体方法为120nm的 AuNPs3000rpm离心10min，弃上清，加入2mM的MPBA的乙醇溶液， 室温搅拌过夜（如8-24小时）。AuMPBA使用前，用3000rpm离心10min， 然后乙醇和水各洗3次，之后用实验中所用的溶剂或缓冲溶液稀释至所需 浓度。
实施例2拉曼标签（叠氮和炔基）在细胞系（HeLa和CHO）中的检测
AuMPBA修饰到细胞表面：将含100μM的Ac4ManNAz或Ac4ManNAl 的DMEM培养基在培养箱中37摄氏度培养HeLa或CHO细胞三天后，用磷 酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）洗三次洗掉未进入细胞的非天然糖，然后用 AuMPBA的PBS溶液37摄氏度孵育细胞半小时使金纳米粒子结合到细胞 膜表面，磷酸缓冲溶液（PBS，pH=7.4）洗三次后封片，最后使用拉曼光 谱仪检测细胞膜表面的Raman标签的信号，使用50%强度的633nm激光器 采集信号10s。其结果请参照图2、图3和图4。其中，图2是Raman光谱仪 的暗场成像，图中的亮点（图2中箭头所示）表示金纳米粒子。图3和图4 是分别是CHO和HeLa细胞中检测细胞膜表面的叠氮和炔基的Raman信号。
从图3和图4可以看出，叠氮和炔基的信号(2100cm-1左右)在HeLa 和CHO细胞的表面都能很好地检测到而空白对照没有。CHO细胞的炔基 和叠氮的信号在2127和2126cm-1；HeLa细胞的炔基和叠氮的信号在2131 和2126cm-1。
含叠氮（Az）和炔基（Al）的非天然单糖已经被广泛证明可以采用现 有技术的两步化学标记法表达到细胞膜上。而它们的Raman信号正好处 于细胞沉默区域，都在2100cm-1左右。HeLa和CHO细胞被用于证明叠 氮和炔基的表达。
相对于现有技术的两步化学标记法，本申请中，使用AuMPBA辅助 的SERS检测方法不需要使用Cu（I）的有毒催化剂，生物相容性明显提 高。而且上述方法是直接检测细胞表面的Raman标签的存在，而不是如 现有技术那样通过检测与标签反应的信号分子来间接地检测标签的存在。 所以本申请的检测方法没有信号分子的吸附背景，检测的可信度更高。
实施例3拉曼标签（氘代甲基）在细胞系（HeLa和CHO）中的检测
实施例2中的Raman标签的检测虽然能够证明它们自身被动态地表 达到细胞膜上，但是由于它们的理化性质已经改变，故它们可能经过与天 然糖不同的代谢途径进入细胞膜上而不能代表天然糖的动态表达。氘代化 合物具有和天然化合物相同的理化性质，而且氘代甲基的Raman信号也 在2100cm-1左右，所以式Ⅲ的d3-Ac4ManNAz，，被用于检测天然糖的动 态表达。
式Ⅲ
具体检测方法与实施例2相似，所不同之处在于，培养细胞培养基中 的非天然单糖为d3-Ac4ManNAz。具体检测结果请参照图5和图6。从图5 和图6中可以看到，氘代甲基的拉曼信号同样能很好地检测出来。CHO 和HeLa细胞的信号分别为2128和2125cm-1。由此可以证明天然的甘露 糖被表达到细胞膜表面上（转化为唾液酸）。
实施例4SERS检测的极限Raman标签浓度以及最少的孵育时间
Raman标签的检测方法同实施例2，其中将Ac4ManNAl的浓度设置 为一系列不同浓度的Ac4ManNAl（0μM,0.01μM,0.05μM,0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM,10μM,25μM,50μM,100μM），培养CHO细胞三天后孵育上 AuMPBA然后检测拉曼信号，结果为：最少0.1μM的Ac4ManNAl就可以 检测到炔基的SERS信号。类似地，50μM的Ac4ManNAl培养CHO细胞 不同时间(0h,22h,34h,39h,48h,72h)然后检测拉曼信号，最少34h的 孵育时间可以检测到SERS信号。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任 何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些 许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
机译： 用荧光标记的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法，以及包括荧光标记的L-葡萄糖衍生物的癌细胞成像剂
机译： 用荧光标记的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法，以及包括荧光标记的L-葡萄糖衍生物的癌细胞成像剂
机译： 用荧光标记的L-葡萄糖衍生物检测癌细胞的方法，以及包括荧光标记的L-葡萄糖衍生物的癌细胞成像剂
