在DNA分子的环化中仅选择由单分子形成的环化DNA的方法

技术领域

本发明涉及具有能够辨别由单个DNA分子形成的环状DNA、由多个DNA分子形成的环状DNA以及来自于多分子环状DNA的环状DNA的结构的环状DNA分子的制作方法，仅选择由单个DNA分子形成的环状DNA的方法，所述方法中使用的新型衔接头以及包含该新型衔接头的环状DNA制作用试剂盒。并且，本发明涉及使用通过上述方法所得的环状DNA鉴定和/或检测基因的方法。特别涉及鉴定和/或检测引起各种病症的融合基因的方法。

背景技术

作为现有的基因分析方法，可举出载体法。载体法中，将分析对象基因引入到载体中，利用测序仪确定扩增而得的基因的全长序列。但是，载体法存在需要培养操作这样的问题，并且需要用测序仪分析基因的全长。

近年来，已开发出基因分析中的高速测序仪，随之而来作为基因分析手段的配对法备受注目。

图1示意性地显示利用配对法的基因分析的概况。配对法中，使分析对象基因的两个末端与结合用碱基序列(限制性内切酶识别位点)结合，将对象基因环化。然后，以限制性内切酶识别位点为中心，通常使用II型限制性内切酶，从该识别部位开始以前后的15个碱基以上、优选25个碱基以上到数十个碱基以下切下被环化的基因，将其用PCR进行扩增，然后确定被切下的部分基因的碱基序列。由此，当确定对象基因的两个末端的序列时，则可利用已知的序列数据来鉴定基因。配对是指解读一条DNA片段的两端而得的碱基序列的1组序列数据。

作为切下一定碱基数的基因的方法，实际使用下述两种方法：使用II型限制性内切酶剪切离开识别部位的部位而切下规定的碱基数的方法；用超声(Sonication)等对环状DNA进行物理切割并用附在接头的生物素回收，用PCR将该片段扩增后确定序列的方法。

即，配对法中，通过读取使DNA的两个末端结合而环化的基因中结合部分的前后的一定碱基序列，能够鉴定已知的基因。基本上如果读取基因的头部分和尾部分的部分碱基序列，则该序列在各个基因中能够被可靠地区分，配对法作为可靠且简单的基因分析方法被采用(非专利文献1和2)。另外，配对法被应用于下一代的序列分析，随着高速测序仪的出现，变得越来越重要。

但是，为了提供给利用配对法进行的基因分析而使DNA环化的情况下，除单个基因、DNA(单分子)自身环化以外，还会发生多个DNA(多分子)的环化及多分子(2分子以上)的线性结合。多分子所致的线性分子可以通过其后的操作与环状分子分离而被除去，但由多分子形成的环状分子无法与由单分子形成的环状分子分离，成为杂质。基于下述记载的理由，多分子环状物阻碍各个基因分析，使分析特异性大幅度降低。具体而言，如图2所示，使3种cDNA自环化时，如(B)所示，在仅单分子DNA环化的情况下，利用配对法根据正确的序列能够鉴定基因。但是，除如(B)所示发生单分子的环化之外，如(C)所示还会产生未环化的线性cDNA、如(D)所示2个或2个以上的cDNA的环化。(C)情况下可以利用DNA核酸外切酶进行排除，但像(D)这样多个cDNA环化而成的产物被识别为环化分子，无法排除，成为配对法基因分析中的杂质。

配对法中的基因分析是利用对象基因的两个末端碱基序列来鉴定基因。具体而言，在各个基因的两个末端结合用于环化的结合用衔接头，将基因在两个衔接头部位结合环化后，按照以衔接头部位为中心成为一定数目的碱基序列的方式进行切割，其结果通过分析来自于原始基因的各末端的一部分的碱基序列来鉴定基因。因此，对于由多分子形成的环化物而言，衔接头部位有多个，与衔接头结合的两端分别成为不同基因的一个末端。在基因分析时，如上所述，利用上述2个方法中的任一个方法，按照以衔接头为中心结合的两端成为一定数目的碱基序列的方式切割环化物进行基因分析。因此，从由多分子形成的环化物所得的分析用的基因片段包含不同基因的各自一个末端，不能进行单个基因的分析。这样，在利用配对法的基因分析中，由多分子形成的环化物的存在阻碍各基因分析。

多个DNA分子环化的概率通常为百分之几到百分之十几，根据方法而存在差异，但在已知的基因的分析中，基本可以作为异常的碱基序列被识别，从分析序列中排除。因此，虽然繁琐，但只是精度稍有下降。然而，将配对法用于从正常基因组中检测融合基因这种异常基因的存在时，多个正常基因环化的情况下，就会被判断为存在异常基因。其结果，无法正确地确定融合基因等异常基因的存在。

融合基因是指多个(2个)基因结合而构筑成的新功能基因的物质。例如癌细胞中，发现缺失、重叠、重组、易位之类的染色体结构的异常。在DNA水平上发生基因的断裂和连接，如果在各切割点存在结构基因，则会形成融合基因。

通常，融合基因对于细胞而言是致死的、无意义的，多数情况下临床上不是问题。但是由融合基因产生的融合蛋白质阻碍细胞增殖的调节，由此当细胞增殖异常加速时，临床上形成肿瘤等的趋势明显。

一直认为融合基因主要在造血系统肿瘤中表达，但近年来，推测融合基因还与上皮性实体肿瘤相关联(非专利文献3)。其中，从前列腺癌和肺癌中发现负有责任的融合基因(非专利文献4和5)。

因此，融合基因的分析、即存在的确认作为肿瘤(癌症)等的新型诊断方法备受注目。具体而言，通过检测知道与病症对应的已知的融合基因，能够快速诊断病症。并且，新型融合基因的发现有助于新型药物靶标的发现。

另一方面，以往，实体肿瘤中染色体分析受限，极难分析·确认融合基因，但最近Mano等人开发了cDNA功能性表达分析法等新型方法。但是，由于这些操作的繁琐性、精度的问题等，目前仍是不完善的技术(专利文献1)。另外，最近，开发了各种的下一代基因高速测序仪，基因的高速序列分析显著进步，能够实现短时间的分析。因此，开始了肿瘤基因组·基因的利用高速·大量碱基序列分析来探索融合基因(非专利文献6)。

为了利用使用了配对法的序列分析来鉴定融合基因，需要可靠地得到由单个cDNA分子形成的环状DNA。将利用配对法分析融合基因的示意图示于图3。但是，如图4所示，有可能多个cDNA形成一个环状DNA，如果进行使用配对法的序列分析，则结果出现正常基因也被看做融合基因这样的结果。如果以在现有的基因序列中不存在的理由排除该正常基因的话，同样地融合基因也会被排除，因此实质上不可能确认融合基因的存在。

想用配对法通过序列分析检测融合基因时，必须排除由多个基因形成的环化cDNA。

目前为止，本发明的发明人等发现通过使用具有特定结构的衔接头进行2步连接，能够仅发生单个DNA分子的环化而不发生多个DNA分子的多分子间环化的方法(未公布)。但是，即便利用该方法，完全阻止多个DNA分子的环化，100％排除由多个DNA分子形成的环状DNA也是不可能的。在使用配对法的分析中，特别是在以新型融合基因的探索为目标的分析中，即便是极微量存在由多个基因形成的环化DNA也会成为假阳性克隆，所以仍就是问题。

因此，需求一种完全排除由多个DNA分子形成的环状DNA、仅可靠地得到由单个DNA分子形成的环状DNA的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第4303303号公报

非专利文献

非专利文献1：蛋白质核酸酶，2009年8月号(1233-1247,1271-1275)

非专利文献2：“疾病基因的探索和超高速序列”实验医学增刊，Vol27，No12(2009年，113(1929)-143(1959))

非专利文献3：Mitelman et al.,2004,Nature Genetics,Vol.36,No.4,p.331-334

非专利文献4：Chinnaiyan et al.,2005,Science,Vol310,p.644-648

非专利文献5：Soda et al.,2007,Nature,Vol.448,p.561-566

非专利文献6：Bashir et al.,April2008，PLoS ComputationalBiology,Vol4,Issue4,e1000051

发明内容

本发明的目的在于提供具有能够辨别由单个DNA分子形成的环状DNA(以下也称为“单分子环状DNA”)、由多个DNA分子形成的环状DNA(以下也称为“多分子环状DNA”)以及来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的特定结构的环状DNA分子的制作方法，和在环状DNA的制作中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。

本发明的发明人等发现通过向DNA单分子分别导入具有包含特有序列的特定结构的衔接头，并进行2步的切割和连接，从而能够制作具有可辨别不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的特定结构的环状DNA分子。本发明的发明人等发现在制作具有该结构的环状DNA分子后通过对衔接头部位进行序列确定从而能够仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。

定义

本说明书中，“单分子环状DNA”是指由单个DNA分子形成的环状DNA，“多分子环状DNA”是指由多个DNA分子形成的环状DNA。

本说明书中，“环状DNA分子”的术语是指单个环状DNA分子或者多个环状DNA分子。另外，多个环状DNA分子有时也表述为由具有相同或不同的序列的多个环状DNA分子构成的“环状DNA分子的集团”。

本说明书中，关于DNA分子，“来自于XX的”是指通过对DNA分子XX进行某种处理而由该DNA分子XX产生的意思。该术语不是指生成新的分子，典型而言，是指DNA分子的一部分分离而成为独立的DNA分子、或DNA分子的一部分被切割而产生比切割前短的分子。

例如，“来自于”多分子环状DNA的单分子环状DNA是指由单个DNA分子形成的环状DNA，是指通过限制性内切酶处理等将多分子环状DNA切割而产生的单个直链状DNA分子通过自身环化而形成的环状DNA。

另一方面，“不来自于”多分子环状DNA的单分子环状DNA是指由单个DNA分子形成的环状DNA，是指单个直链状DNA分子不经过多分子环状DNA的形成而自身环化产生的环状DNA。

另外，“来自于”衔接头(A)或(b)的切割末端是指通过切割衔接头(A)或(b)的切割位点而产生的末端，例如，通过限制性内切酶处理产生的5’或3’突出末端与其相当。

本说明书中，“固有序列”是对各个衔接头(b)而言固有的序列，是对各个衔接头(b)而言不同的序列。如果固有序列的种类(衔接头(b)的种类)足够多，则对每个不同目标DNA结合具有不同的固有序列的衔接头(b)。由此，在本发明的方法中，能够以固有序列为标记，来辨别被制作的环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA还是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

本说明书中，仅“选择”不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA可以是从环状DNA分子的集团中物理分离不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，也可以是在数据分析的步骤中，从由环状DNA分子的集团所得的信息(例如碱基序列数据)中，仅选择从不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA得到的信息。

本说明书中，“回文型限制性内切酶位点”是指识别回文序列的限制性内切酶的识别位点，“非回文型限制性内切酶位点”是指识别非回文序列的限制性内切酶的识别位点。

本发明在第一方式中，提供一种环状DNA分子的集团的制作方法，是能够从由该方法制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法，包括以下工序：

1)使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合并使包含衔接头(b)和所述衔接头(A)的第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序，其中，衔接头(B)介由衔接头(b)侧与DNA分子结合，衔接头(B)中的衔接头(A)位于DNA分子与衔接头(b)的键的外侧，

其中，衔接头(A)包含切割位点，上述切割位点产生与任意衔接头(A)的切割末端均非特异性结合的切割末端，

衔接头(b)包含2个对每个该衔接头(b)而言不同的固有序列，这2个固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列，并且，

衔接头(b)在这2个固有序列之间包含切割位点，上述切割位点产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端，该切割位点在切割衔接头(A)的切割位点时不被切割，且产生不与衔接头(A)的切割末端结合的切割末端；

2)第一切割工序，在衔接头(A)的切割位点切割工序1)中得到的DNA分子；

3)第一步环化工序，使工序2)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；

4)除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序；

5)第二切割工序，在衔接头(b)的切割位点切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子；以及

6)第二步环化工序，使工序5)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化，

其中，对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则判定工序6)中得到的环状DNA分子为不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则判定工序6)中得到的环状DNA分子为多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

应予说明，在工序6)后，以下类型的DNA能够作为线性DNA残留：工序5)中被切割的(b)部分没有再结合的单分子DNA(极微量)；和工序3)中多个DNA分子环化且在工序5)中切割各衔接头(b)后，无法再结合的单分子或者多分子的DNA(它们占线性DNA的大多数)。可以除去这些线性DNA，但不一定非要除去。由于该DNA不具有2个相同的固有序列并列的结构，所以通过衔接头(b)部分的序列确定能够辨别，从分析对象中排除。

另外，本发明在第二方式中，提供一种不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的制作方法，包括以下工序：

1)利用本发明的第一方式的方法制作环状DNA分子的工序；和

2)针对该制作的环状DNA分子，对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序，在此，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则该环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则该环状DNA分子是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

另外，本发明在第三方式中，提供一种在环状DNA分子的制作中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法，包括以下工序：

1)使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合并使包含衔接头(b)和上述衔接头(A)的第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序，其中，衔接头(B)介由衔接头(b)侧与DNA分子结合，衔接头(B)中的衔接头(A)位于DNA分子与衔接头(b)的键的外侧，

其中，衔接头(A)包含切割位点，上述切割位点产生与任意衔接头(A)的切割末端均非特异性结合的切割末端，

衔接头(b)包含2个对每个该衔接头(b)而言不同的固有序列，这2个固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列，并且，

衔接头(b)在这2个固有序列之间包含切割位点，上述切割位点产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端，该切割位点在切割衔接头(A)的切割位点时不被切割，且产生不与衔接头(A)的切割末端结合的切割末端；

2)第一切割工序，在衔接头(A)的切割位点切割工序1)中得到的DNA分子；

3)第一步环化工序，使工序2)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；

4)除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序；

5)第二切割工序，在衔接头(b)的切割位点切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子；

6)第二步环化工序，使工序5)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；以及

7)对工序6)中得到的环状DNA分子具有的衔接头(b)部分的序列进行序列确定，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序，其中，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则该环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则该环状DNA分子是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

在本发明的第一到第三方式中，优选衔接头(A)是包含限制性内切酶位点的双链DNA，上述限制性内切酶位点产生与任意衔接头(A)的切割末端均彼此互补的切割末端，例如，是包含识别回文序列的限制性内切酶的识别位点(“回文型限制性内切酶位点”)的双链DNA。

在本发明的第一到第三方式中，优选衔接头(b)包含2个切割位点，上述切割位点产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端。此时，由于没有顺利进行第二切割工序的环状DNA分子的衔接头(b)内的2个切割位点间的序列没有被除去，所以能够通过衔接头(b)的序列确定，将该分子作为“不完全克隆”辨别出来，从分析对象中排除。另外，衔接头(b)所含的切割位点优选是限制性内切酶位点，例如，回文型限制性内切酶位点。

在本发明的第一到第三方式中，衔接头(b)所含的切割位点的数目至少为1个，优选为2个，也可以为3个以上。另外，也可使用一对彼此取向相反的互为相同的切口制作酶识别位点作为衔接头(A)和/或衔接头(b)所含的切割位点。

在本发明的第一到第三方式中，优选衔接头(A)是包含回文型限制性内切酶位点X的彼此互补的双链DNA，

优选衔接头(B)是具有下述结构Z₁－Y－Z₂－A或者Z₁－Y－Z’₂－A的彼此互补的双链DNA：

[结构中，

A是包含回文型限制性内切酶位点X的双链DNA，相当于衔接头(A)；

Z₁－Y－Z₂相当于本发明的第一到第三方式中的衔接头(b)；

Y是包含回文型限制性内切酶位点y₁和y₂的双链DNA；

y₁和y₂相同，具有与X不同的序列，且产生与通过切割X产生的切割末端不互补的切割末端；

Z₁和Z₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C₂的双链DNA序列，其中，C₁和C₂是彼此取向相反的相同的序列；

n是1～40的整数；

N₁～N_n各自相同或不同，是选自dAMP、dCMP、dGMP和dTMP中的脱氧核苷酸；

N’₁～N’_n与上述N₁～N_n相对应，分别是下述脱氧核苷酸，其中，k是1～n的整数，

表1

或者

[结构中，

Z₁－Y－Z’₂相当于本发明的第一到第三方式中的衔接头(b)；

Z₁和Z’₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C’₂的双链DNA序列，其中，C₁和C’₂是在相同方向取向的相同的序列；

A、X、Y、y₁、y₂、n、N₁～N_n、N’₁～N’_n和k的定义与上述结构Z₁－Y－Z₂－A中的定义相同]。

在上述Z₁－Y－Z₂－A和Z₁－Y－Z’₂－A的任一结构中，n均为1～40，优选n为4～15，进一步优选n为5～10。但是，即便n大于40也能够实施本发明的方法。

在该方式中，优选回文型限制性内切酶位点X是BamHI位点、NotI位点或者BclI位点，优选回文型限制性内切酶位点y₁和y₂均为EcoRI位点或者PacI位点。

本发明在第四方式中，提供一种衔接头，是由具有下述结构Z₁－Y－Z₂－A或者Z₁－Y－Z’₂－A的彼此互补的双链DNA构成的环状DNA制作用衔接头，用于能够从使用该衔接头制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，

[结构中，

A是包含回文型限制性内切酶位点X的双链DNA；

Y是包含回文型限制性内切酶位点y₁和y₂的双链DNA；

y₁和y₂相同，具有与X不同的序列，且产生与通过切割X产生的切割末端不互补的切割末端；

Z₁和Z₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C₂的双链DNA序列，其中，C₁和C₂是彼此取向相反的相同的序列；

n是1～40的整数；

N₁～N_n各自相同或不同，是选自dAMP、dCMP、dGMP和dTMP中的脱氧核苷酸；

N’₁～N’_n与上述N₁～N_n相对应，分别是下述脱氧核苷酸，其中，k是1～n的整数，

表2

或者

[结构中，

Z₁和Z’₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C’₂的双链DNA序列，其中，C₁和C’₂是在相同方向取向的相同的序列；

A、X、Y、y₁、y₂、n、N₁～N_n、N’₁～N’_n和k的定义与上述结构Z₁－Y－Z₂－A中的定义相同]。

在上述Z₁－Y－Z₂－A和Z₁－Y－Z’₂－A的任一结构中，n均为1～40，优选n为4～15，进一步优选n为5～10。但是，即便n大于40也能够实施本发明的方法。

本发明的第四方式的上述衔接头相当于本发明的第一到第三方式中的衔接头(B)，适用于本发明的环状DNA分子的集团的制作方法、不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的制作方法以及仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。

在本发明的第四方式中，优选回文型限制性内切酶位点X是BamHI位点、NotI位点或者BclI位点，优选回文型限制性内切酶位点y₁和y₂均为EcoRI位点或者PacI位点。

此外，本发明在第五方式中，提供一种试剂盒，是包含上述第四方式中记载的衔接头(也简称为衔接头(B))和由含有与该衔接头(B)所含的限制性内切酶位点X相同的限制性内切酶位点的双链DNA构成的衔接头(也简称为衔接头(A))的环状DNA制作用试剂盒，能够从使用该试剂盒制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

另外，本发明在第六方式中，提供使用上述第一方式的方法制作cDNA文库的方法，该文库是能够从其文库中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的文库；以及提供使用上述第二或第三方式的方法制作仅由不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA构成的cDNA文库的方法。

此外，本发明在第七方式中，提供一种将环状DNA分子供于配对法来鉴定基因的方法，包括以下工序：

1)解读碱基序列的工序，所述碱基序列是由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团、由本发明的第二方式的方法制作的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者由本发明的第三方式的方法选择的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基，其中，使用由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团时，在该工序之前、与该工序同时或者在该工序之后，进一步包括通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定而仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序；和

2)通过将工序1中解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较，来鉴定该不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA所含的基因的工序。

优选解读的碱基序列为15～100个碱基，进一步优选为25～35个碱基。但是，即便解读600个碱基以上也能够实施本发明的方法。

此外，本发明在第八方式中，提供一种将环状DNA分子供于配对法来检测融合基因的方法，包括以下工序：

1)解读碱基序列的工序，所述碱基序列是在由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团、由本发明的第二方式的方法制作的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者由本发明的第三方式的方法选择的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基，其中，使用由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团时，在该工序之前、与该工序同时或者在该工序之后，进一步包括通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定而仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序；和

2)将工序1中解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较的工序，其中，两个末端的基因与已知的相异的基因对应时，该不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA所含的基因被鉴定为融合基因。

优选解读的碱基序列为15～100个碱基，进一步优选为25～35个碱基。但是，即便解读600个碱基以上也能够实施本发明的方法。

在本发明的第八方式中，与衔接头(B)的两侧邻接的两侧的序列与已知融合基因的两侧的末端对应时，检测到已知的融合基因。在知道该已知的融合基因与疾病的关系的情况下，提供一种使用由第八方式的方法检测的融合基因作为标志物，检测以该融合基因的表达为特征的疾病的方法。

另一方面，与衔接头(B)的两侧邻接的序列与相异的基因的末端序列对应且不与已知融合基因的两侧的末端对应时，该环状DNA分子或该单分子环状DNA所含的基因被鉴定为新型融合基因。这种情况下，被检测的新型融合基因适用于药物开发筛选的使用。

通过使用本发明的衔接头和方法，基因分析的精度得到显著改善。具体而言，通过使用本发明的衔接头和方法，能够完全辨别出不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，能够以几乎100％的概率仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。其结果，能够进行空前的高精度的配对分析，提供一种对基因组分析极其有用的工具。特别是通过将本发明的方法应用于cDNA文库的制作，极有可能发现新型的融合基因。即，通过在序列分析的阶段排除配对分析中成为问题的多分子环状DNA，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，能够开发新型诊断工具·方法。

根据本发明，提供一种在DNA的环化中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。由此，能够解决配对分析等基因分析中的污染问题，使高精度的分析成为可能。另外，通过将本发明的方法用于融合基因的检测·分析，使高精度的融合基因的分析成为可能，能够提供有效的诊断工具。

附图说明

图1示意性显示利用配对法的基因分析的概况。

图2示意性显示利用配对法的基因分析中的问题点。

图3显示了利用配对法分析融合基因时的示意图。

图4示意性显示利用配对法分析融合基因时的问题点。

图5示意性显示衔接头结合后的DNA分子。

图6示意性显示本发明的环状DNA分子制作方法的第一切割、第一步环化、第二切割以及第二步环化工序。为了方便，对相互不同的固有序列标记a、b、c、d、e和f的附图标记以区别。

图7示意性显示第二步环化工序后可产生的衔接头(b)部分的结构。图中的NNNNN表示固有序列。通过对该区域进行序列确定，能够辨别目标克隆、目标外克隆和不完全克隆。

图8示意性显示衔接头(b)的制作方法的例子。图中的NNNNN表示固有序列。

图9示出了将本发明的方法用于由mRNA合成的cDNA时的示意图。

图10示出了将本发明的方法用于基因组文库时的示意图。基因组片段与cDNA不同无法区别DNA片段的左右。因此可以如图所示通过PCR法、使用修饰接头、或者使用非回文序列作为两端的限制性内切酶位点X等来仅选择将左端的接头、右端的接头这双方结合而使两个接头适当结合的产物(a)。

具体实施方式

关于本发明的第一方式

作为本发明中第一方式，提供一种方法，是制作环状DNA分子的集团的方法，能够从由该方法制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，包括以下工序：

1)使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合，并使包含衔接头(b)和上述衔接头(A)的第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序；其中，衔接头(B)介由衔接头(b)侧与DNA分子结合，衔接头(B)中的衔接头(A)位于DNA分子与衔接头(b)的键的外侧，其中，

衔接头(A)包含产生与任意衔接头(A)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点；

衔接头(b)包含2个对每个该衔接头(b)而言不同的固有序列，这2个固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列；并且，

衔接头(b)在这2个固有序列之间包含切割位点，所述切割位点产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端，该切割位点在切割衔接头(A)的切割位点时不被切割，且产生不与衔接头(A)的切割末端结合的切割末端；

2)第一切割工序，在衔接头(A)的切割位点切割工序1)中得到的DNA分子；

3)第一步环化工序，使工序2)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；

4)除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序；

5)第二切割工序，在衔接头(b)的切割位点切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子；以及

6)第二步环化工序，使工序5)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化，

其中，对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则判定工序6)中得到的环状DNA分子为不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则判定工序6)中得到的环状DNA分子为多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

本发明的上述第一方式是能够制作环状DNA分子的技术，该环状DNA分子具有可辨别不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的特定的结构。具体而言，本发明的第一方式的方法的特征是进行2步环化。

以下，按工序的顺序对本发明的第一方式的方法进行说明。

工序1)是使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合，并使包含衔接头(b)和上述衔接头(A)的第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序。其中，衔接头(B)通过介由衔接头(b)侧与DNA分子结合，从而衔接头(B)中的衔接头(A)位于DNA分子与衔接头(b)的键的外侧。即，各目标DNA分子的一端与衔接头(A)结合，另一端与衔接头(B)结合，衔接头(B)中的衔接头(A)与衔接头(b)相比位于末端侧，从而使衔接头(A)位于各目标DNA分子的两个末端。

应予说明，衔接头(A)包含产生与任意衔接头(A)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点。即，衔接头(A)不显示结合特异性，来自于衔接头(A)的全部切割末端彼此可非选择性结合。另一方面，衔接头(b)包含2个对每个该衔接头(b)而言不同的固有序列，这2个固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列。另外，衔接头(b)在这2个固有序列之间包含产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点，该切割位点在切割衔接头(A)的切割位点时不被切割，且产生不与衔接头(A)的切割末端互补的切割末端。即，衔接头(b)不显示结合特异性，来自于衔接头(b)的全部切割末端彼此可以非选择性结合。这点在衔接头(b)所含的切割位点的数目为1个、2个或者3个以上的情况下也是相同的。

工序2)是在衔接头(A)的切割位点切割工序1)中得到的DNA分子的第一切割工序。由于工序1)中得到的DNA分子其两端结合了衔接头(A)，所以通过该第一切割工序在各DNA分子的两端产生来自于衔接头(A)的切割末端。

工序3)是使工序2)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化的第一步环化工序。第一步目标环化是利用衔接头(A)的环化，在各DNA分子的两端产生的来自于衔接头(A)的切割末端相互结合而引起环化。其中，在第一步目标环化时衔接头(B)与衔接头(A)一起被并入环状分子内。如上所述，衔接头(A)的功能不是特异性的，没有涉及目标DNA分子两个末端的再结合的选择性。因此，不仅单个DNA分子的两个末端在衔接头(A)部分结合，多个DNA分子的各自两个末端的结合也引起结合环化。即，由于衔接头(A)的功能，不仅发生单分子环化，还发生多分子环化。多分子的环化物中当然存在多个衔接头(B)。

工序4)是除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序。线性DNA分子例如可以通过使核酸外切酶发挥作用等来除去。

工序5)是在衔接头(b)的切割位点切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子的第二切割工序。即，在被并入工序3)中环化而得的各DNA分子的衔接头(b)进行开裂，产生线性分子。通过第二切割工序在各DNA分子的两端产生来自于衔接头(b)的切割末端。在该工序中，通过切割产生的切割末端与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合。

工序6)是使工序5)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化的第二步环化工序。即，在工序5)中得到的各DNA分子的两端存在来自于衔接头(b)的切割末端，通过来自于衔接头(b)的切割末端彼此结合，进行第二步目标环化。未环化的线性分子可以通过使核酸外切酶发挥作用等而分离排除。

在该第二步环化工序中，除单个DNA分子所致的环化以外，还能够发生多个DNA分子所致的环化。但是，在第二切割工序前已结合的原来的多分子彼此再结合而环化的概率如下所述极低，实质上为0。

因此，经过第二步环化工序，能够产生以下5种分子：

(1)“不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA”(例如图6的A4)，在此，该单分子环状DNA是第一步环化工序中形成的单分子环状DNA(例如图6的A2)经过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的A3)自身环化而形成的；

(2)“来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA”(例如图6的B4-1)，在此，该单分子环状DNA是第一步环化工序中形成的多分子环状DNA(例如图6的B2)经过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的B3)自身环化而形成的；

(3)“多分子环状DNA-1”(例如图6的B4-2)，在此，该DNA-1是第一步环化工序中形成的多分子环状DNA(例如图6的B2)经过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的B3)彼此多个结合环化而形成的；

(4)“多分子环状DNA-2”(例如图6的B4-3)，在此，该DNA-2是第一步环化工序中形成的单分子环状DNA(例如图6的A2)经过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的A3)、和第一步环化工序中形成的多分子环状DNA(例如图6的B2)进过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的B3)结合环化而形成的；以及

(5)“多分子环状DNA-3”(例如图6的B4-4)，在此，该DNA-3是第一步环化工序中形成的单分子环状DNA(例如图6的A2)经过第二切割工序被切割而产生的单分子DNA(例如图6的A3)彼此多个结合环化而形成的。

在此，当发生第二切割工序前已结合的非配对的多分子所进行的环化时(上述(3)、(4)或者(5))，由于在衔接头(b)部分并列存在不同的2个固有序列，所以通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，能够将该多分子环状DNA作为非目标克隆而排除(参照图6的B4-2、B4-3和B4-4以及图7)。

另外，对于来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(上述(2))而言，由于在衔接头(b)部分并列存在不同的2个固有序列，所以即便对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，也无法与多分子环状DNA进行区别(图6的B4-1和图7)。因此，在本发明的方法中，该单分子环状DNA也作为非目标克隆成为被排除的对象。

因此，在第二步环化工序后衔接头(b)内的2个固有序列相同的仅是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(上述(1))(图6的A4)。

应予说明，如果在第一步环化工序中，具有相同的衔接头(b)的不同分子彼此结合而形成多分子环状DNA，则经过第二切割工序和第二步环化工序，能够产生并列存在2个相同的固有序列的单分子环状DNA。但是，如下所述通过使固有序列的长度变长(即，增加衔接头(b)的种类)能够使产生该单分子环状DNA的概率无限接近于0，认为只要固有序列具有某种程度的长度，则实质上为0，不是问题。

由以上可知，通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则能够判定工序6)中得到的环状DNA分子为不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则能够判定工序6)中得到的环状DNA分子为多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

衔接头(A)和(b)只要发挥上述功能，其结构就没有特别限定。例如，这些衔接头是双链DNA时，作为衔接头(A)，可例示包含回文型限制性内切酶位点的双链DNA，作为衔接头(b)，例如，可举出包含在相反方向取向的2个相同的固有序列且在这2个固有序列之间包含2个回文型限制性内切酶位点的双链DNA。但是，衔接头(A)和(b)不限定于此。例如，衔接头(b)也可以是包含2个相同的固有序列且在这2个固有序列之间包含仅1个或3个以上产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点的双链DNA。总之，可以通过在固有序列之间的切割位点切割环状DNA后，使产生的切割末端彼此再结合，从而根据环状DNA的由来(即，不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者多分子环状DNA或来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA)，形成2个相同或不同的固有序列并列的结构。

作为切割位点，只要产生彼此互补的切割末端即可，也可以使用非回文型限制性内切酶位点，另外，也可以使用彼此取向相反的彼此相同的切口制作酶识别位点的配对代替限制性内切酶位点。例如，使用作为非回文型限制性内切酶的BbsI的识别位点时，由于切割末端在识别位点的外侧产生，所以通过将成为切割末端的部分的序列作为回文结构等序列设计，能够形成彼此互补的切割末端。

作为限制性内切酶位点，优选识别尽可能不切割目标DNA这样的稀有基因序列的限制性内切酶(所谓的“低频剪切酶”)的识别位点。作为低频剪切酶的8个碱基识别的回文型限制性内切酶位点，例如可举出以下所示的PacI位点。

PacI

并且，可期待限制性内切酶切割后的粘性末端非回文的这种设计提高单分子DNA所致的环化的效率，例如也可以导入下述SfiI位点这种限制性内切酶位点。

sfiI

在此，例如在上游和下游将NNNNN设定成下述结构。

AAATT

TTTAA

同样也可导入以下所示的BbsI位点这种II型限制性内切酶的识别位点。

BbsI

另一方面，使用EcoRI位点时，通过预先用EcoRI甲基化酶处理cDNA，能够仅切割衔接头内的限制性内切酶位点，防止切割cDNA。

出于同样的目的，通过向衔接头导入甲基化碱基，从而能够像例如下述SgeI限制性内切酶位点这样，仅在衔接头内的限制性内切酶位点进行切割。

SgeI

SgeI切断在1个链或两个链上含有5-甲基胞嘧啶(m5C)的目标DNA。

另外，衔接头(A)使用非回文型限制性内切酶位点时，如下设计或选择序列，即，区别单独的衔接头(A)(记为“A1”)和衔接头(B)所含的衔接头(A)(记为“A2”)，使衔接头“A1”与“A2”相互结合，另一方面使“A1”彼此和“A2”彼此无法结合。此时，可以期待虽然略微，但与通常的衔接头(A)相比第一步中形成单分子环状DNA的效率提高。

根据本发明的第一方式，例如，在利用配对法的基因分析、基因鉴定中，能够辨别制作的环状DNA是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA还是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(分析中成为杂质)。

关于本发明的第二方式

作为本发明的第二方式，提供一种不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的制作方法，包括以下工序：

1)利用本发明的第一方式的方法制作环状DNA分子的工序；和

2)针对该制作的环状DNA分子，对衔接头(b)部分的序列进行序列确定，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序，在此，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则该环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则该环状DNA分子是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

利用本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA中的任一个。本发明的第二方式是通过对由这些环状DNA构成的环状DNA分子的集团进行衔接头(b)部分的序列确定，从该集团中仅获得不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。

关于本发明的第三方式

作为本发明的第三方式，提供一种在环状DNA分子的制作中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法，包括以下工序：

1)使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合，并使包含衔接头(b)和上述衔接头(A)的第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序；其中，衔接头(B)介由衔接头(b)侧与DNA分子结合，衔接头(B)中的衔接头(A)位于DNA分子与衔接头(b)的键的外侧，

其中，

衔接头(A)包含产生与任意衔接头(A)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点；

衔接头(b)包含2个对每个该衔接头(b)而言不同的固有序列，这2个固有序列是在相同方向或者相反方向取向的相同的序列；并且，

衔接头(b)在这2个固有序列之间包含产生与任意衔接头(b)的切割末端均非特异性结合的切割末端的切割位点，该切割位点在切割衔接头(A)的切割位点时不被切割，且产生不与衔接头(A)的切割末端结合的切割末端；

2)第一切割工序，在衔接头(A)的切割位点切割工序1)中得到的DNA分子；

3)第一步环化工序，使工序2)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；

4)除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序；

5)第二切割工序，在衔接头(b)的切割位点切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子；

6)第二步环化工序，使工序5)中得到的DNA分子的两个末端结合而环化；以及

7)对工序6)中得到的环状DNA分子具有的衔接头(b)部分的序列进行序列确定，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序，在此，如果衔接头(b)部分所含的2个固有序列相同，则该环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，如果这2个固有序列不同，则该环状DNA分子是多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

本发明的第三方式中的工序1)～工序6)与本发明的第一方式中的工序1)～工序6)相同。

本发明的第三方式中的工序7)是对工序6)中得到的环状DNA分子具有的衔接头(b)部分的序列进行序列确定，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序。关于本发明的第一方式，如上所述，工序6)中得到的环状DNA分子中，衔接头(b)内的2个固有序列相同的仅是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。因此，通过进行衔接头(b)内的序列确定以确定2个固有序列是相同还是不同，从而能够辨别工序6)中得到的环状DNA分子是不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA还是或多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，由此能够仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA作为分析对象。

根据本发明的第三方式，例如，在利用配对法的基因分析、基因鉴定中，能够将成为杂质的多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA从分析对象中排除，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA作为分析对象。

在本发明的第一到第三方式中，优选衔接头(A)是包含回文型限制性内切酶位点X的彼此互补的双链DNA，

优选衔接头(B)是具有下述结构Z₁－Y－Z₂－A或者Z₁－Y－Z’₂－A的彼此互补的双链DNA：

[结构中，

A是包含回文型限制性内切酶位点X的双链DNA，相当于衔接头(A)；

Z₁－Y－Z₂相当于本发明的第一到第三方式中的衔接头(b)；

Y是包含回文型限制性内切酶位点y₁和y₂的双链DNA；

y₁和y₂相同，具有与X不同的序列，且产生与通过切割X产生的切割末端不互补的切割末端；

Z₁和Z₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C₂的双链DNA序列，其中，C₁和C₂是彼此取向相反的相同的序列；

n是1～40的整数；

N₁～N_n各自相同或不同，是选自dAMP、dCMP、dGMP和dTMP中的脱氧核苷酸；

N’₁～N’_n与上述N₁～N_n相对应，分别是下述脱氧核苷酸，其中，k是1～n的整数，

表3

或者

[结构中，

Z₁－Y－Z’₂相当于本发明的第一到第三方式中的衔接头(b)；

Z₁和Z’₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C’₂的双链DNA序列，其中，C₁和C’₂是在相同方向取向的相同的序列；

A、X、Y、y₁、y₂、n、N₁～N_n、N’₁～N’_n和k的定义与上述结构Z₁－Y－Z₂－A中的定义相同]。

在上述Z₁－Y－Z₂－A和Z₁－Y－Z’₂－A的任一结构中，n均为1～40，优选n为4～15，进一步优选n为5～10。但是，即便n大于40也能够实施本发明的方法。

上述优选的衔接头(A)是用于在第一切割工序中使用限制性内切酶切割，其后出于得到环状DNA的目的进行切割末端彼此的连接的序列。因此，只要是回文型限制性内切酶位点，可以包含任意的限制性内切酶位点。优选包含识别尽可能不切割目标DNA的这种稀有基因序列的限制性内切酶的位点。作为衔接头(A)所含的限制性内切酶位点X，例如，可举出以下BamHI位点、NotI位点、BclI位点等。

在序列编号1(正向链)和序列编号2(反向链)中示出优选的衔接头(A)的序列的例子。

上述优选的衔接头(B)是用于在第二切割工序中使用限制性内切酶切割，期待被切割的DNA分子的再次环化而进行切割末端彼此的连接的序列。因此，只要是识别回文序列的限制性内切酶位点可以包含任意的限制性内切酶位点。优选包含识别尽可能不切割目标DNA的这种稀有基因序列的限制性内切酶的位点。作为衔接头(B)的Y部分所含的限制性内切酶位点，例如，可举出以下EcoRI位点、PacI位点。

通过切割衔接头(B)内的回文型限制性内切酶位点y₁和y₂产生的切割末端全部彼此互补，通过该切割末端彼此的连接，得到衔接头(b)部分中具有2个相同或不同固有序列的结构。

另外，上述优选的衔接头(B)在Y部分具有2个相同的限制性内切酶位点(y₁和y₂)。因此，具有能够将在第二切割工序后没有除去这2个限制性内切酶位点间的序列的环状DNA分子作为第二切割工序中的没有顺利进行限制性内切酶处理的“不完全克隆”辨别出来并排除的优点(图7)。

在序列编号3(正向链)和序列编号4(反向链)中示出优选的衔接头(B)的序列的例子。

使用包含回文型限制性内切酶位点X的衔接头(A)和具有上述结构Z₁－Y－Z₂－A的衔接头(B)时，本发明的第一和第三方式的各工序如下。

工序1)是使第一步环化用衔接头(A)与各目标DNA分子的一末端结合，并使第二步环化用衔接头(B)与另一末端结合的工序(图5)。

工序2)是利用识别衔接头(A)所含的回文型限制性内切酶位点X的限制性内切酶(图6中的BamHI)切割工序1)中得到的DNA分子的第一切割工序(图6的A1和B1)。

工序3)是使工序2)中得到的DNA分子的两个末端连接而环化的第一步环化工序(图6的A2和B2)。

工序4)是除去工序3)中未环化的线性DNA分子的工序。

工序5)是利用识别衔接头(b)中的回文型限制性内切酶位点y₁和y₂的限制性内切酶(图6中的EcoRI)切割工序3)和工序4)中得到的环状DNA分子的第二切割工序(图6的A3和B3)。

工序6)是使工序5)中得到的DNA分子的两个末端连接而环化的第二步环化工序(图6的A4、B4-1、B4-2、B4-3和B4-4)。通过该工序，得到衔接头(b)内包含2个相同或不同固有序列的结构。

本发明的第三方式所含的工序7)是针对工序6)中得到的环状DNA分子，对衔接头(b)部分进行序列确定，根据所含的2个固有序列相同或不同，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序。在工序6)之后，多分子环状DNA(图6的B4-2、B4-3和B4-4)和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(图6的B4-1)具有不同的2个固有序列在衔接头(b)内并列的结构(图6中的c-b、d-b、e-c、d-a、e-a、a-f)。另一方面，不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(图6的A4)具有2个相同的固有序列并列的结构(图6中的a-a)。因此，通过从工序6)中得到的环状DNA分子中选择衔接头(b)所含的2个固有序列相同的分子，能够仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA作为分析对象。

另外，如果第二切割工序中的限制性内切酶处理成功，则第二步环化工序后的衔接头(b)部分成为2个固有序列夹着1个限制性内切酶位点并列的结构。另一方面，限制性内切酶处理不完全时，限制性内切酶位点间的序列没被除去，成为仍存在2个限制性内切酶位点的结构(图7)。因此，通过衔接头(b)部分的序列确定，能够辨别后者结构的克隆为不完全克隆，从分析对象中除去。

关于固有序列的长度

衔接头(b)中的固有序列的长度(在具有上述结构Z₁－Y－Z₂－A或者Z₁－Y－Z’₂－A的衔接头中，是指结构中的“n”)没有特别限定，优选为1～40个碱基，更优选为4～15个碱基，进一步优选为5～10个碱基。碱基数越多固有序列的种类越多，在第一步环化工序中具有相同的衔接头(b)部分的(即，具有相同的固有序列的)不同DNA分子彼此结合形成多分子环状DNA的概率越低。

例如，如果固有序列的长度为8个碱基长，则固有序列的种类(衔接头(b)的种类)存在4的8次方＝65536。此时，第二步环化工序后的来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(例如图6的B4-1)具有2个相同的固有序列的概率与第一步环化工序中具有相同的衔接头(b)部分的不同DNA分子彼此结合而形成多分子环状DNA的概率相同，为1/65536×1/65536＝2.3×10e-10。另外，无法区别第二步环化工序后的多分子环状DNA(例如图6的B4-2、B4-3和B4-4)与不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA(例如图6的A4)的情况是例如由2个分子进行环化时，相同的固有序列并列在2个衔接头(b)部分的双方的情况。由此，其概率是1/65536的4次方＝5.4×10e-20(B4-2的情况)、1/65536的3次方＝3.6×10e-15(B4-3的情况)或者1/65536的平方＝2.3×10e-10(B4-4的情况)。应予说明，像配对分析等中进行的那样，切下衔接头部分和其邻接序列，仅对该切下的部分进行序列确定时，无法区别图6的B4-2、B4-3以及B4-4中任一分子与同图的A4的分子的概率是1/65536的平方＝2.3×10e-10。

认为这些概率已经足够低了，但由于固有序列的长度没有特别限制，所以通过使长度进一步增长到9个碱基、10个碱基、11个碱基···，能够使错误辨别多分子环状DNA或者来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA为不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的可能性无限接近于0。

因此，通过在第二步环化工序后对包含固有序列的衔接头(b)部分进行序列确定，能够完全辨别不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者多分子环状DNA或来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

关于本发明的第四方式

作为本发明的第四方式，提供一种衔接头，是在上述本发明的第一到第三方式的方法中使用的优选的衔接头(B)，即，由具有下述结构Z₁－Y－Z₂－A或者Z₁－Y－Z’₂－A的彼此互补的双链DNA构成的环状DNA制作用衔接头，用于能够从使用该衔接头制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA：

[结构中，

A是包含回文型限制性内切酶位点X的双链DNA；

Y是包含回文型限制性内切酶位点y₁和y₂的双链DNA；

y₁和y₂相同，具有与X不同的序列，且产生与通过切割X产生的切割末端不互补的切割末端；

Z₁和Z₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C₂的双链DNA序列，其中，C₁和C₂是彼此取向相反的相同的序列；

n是1～40的整数；

N₁～N_n各自相同或不同，是选自dAMP、dCMP、dGMP和dTMP中的脱氧核苷酸；

N’₁～N’_n与上述N₁～N_n相对应，分别是下述脱氧核苷酸，其中，k是1～n的整数，

表4

或者

[结构中，

Z₁和Z’₂是包含对每个衔接头而言不同的固有序列C₁和C’₂的双链DNA序列，其中，C₁和C’₂是在相同方向取向的相同的序列；

A、X、Y、y₁、y₂、n、N₁～N_n、N’₁～N’_n和k的定义与上述结构Z₁－Y－Z₂－A中的定义相同]。

上述Z₁－Y－Z₂－A和Z₁－Y－Z’₂－A的任一结构中，n均为1～40，优选n为4～15，进一步优选n为5～10。但是，即便n大于40也能够实施本发明的方法。

与上述第一和第三方式同样地，在本发明的第四方式中，作为A部分所含的限制性内切酶位点X，例如，可举出BamHI位点、NotI位点、BclI位点等，作为Y部分所含的限制性内切酶位点y₁和y₂，例如，可举出EcoRI位点、PacI位点。

关于衔接头(b)的制作方法

以上述第四方式的衔接头中的结构Z₁－Y－Z₂或者Z₁－Y－Z’₂为代表的、上述本发明的第一到第三方式中优选使用的、具有2个相同的固有序列的衔接头(b)例如可以通过使用具有发夹结构的核酸，进行聚合酶延伸、切口制作、聚合酶延伸这样的3步反应来制作(图8)。但是，制作方法并不局限于此，例如也可以通过序列合成等制作所希望的衔接头(b)。

关于本发明的第五方式

作为本发明的第五方式，提供一种试剂盒，是包含上述本发明的第一到第三方式的方法中使用的优选的衔接头(A)和衔接头(B)的环状DNA制作用试剂盒，能够从使用该试剂盒制作的环状DNA分子的集团中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。即，提供一种包含由双链DNA构成的衔接头(A)和上述第四方式中记载的衔接头(B)的环状DNA制作用试剂盒，所述双链DNA包含与上述第四方式中记载的限制性内切酶位点X相同的限制性内切酶位点。

本发明的上述环状DNA制作用试剂盒包含衔接头(A)和衔接头(B)，通过使它们与目标DNA分子的两个末端结合，进行本发明的第一或第三方式中的二步环化方法，能够获得具有可辨别不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的特定结构的环状DNA，并且能够仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。

关于本发明的第六方式

本发明的第六方式是使用本发明的第一到第三中任一方式的二步环化方法制作cDNA文库的方法。

通过将本发明第一方式的方法用于由直链状cDNA构成的文库，能够制作对于文库的组成而言通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定而仅选择作为不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的组成的cDNA文库。因此，例如使用该cDNA文库进行基因分析时，能够在对该文库进行全面序列解读后，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的数据作为分析对象。

另外，通过将本发明的第二或第三方式的方法用于由直链状cDNA构成的文库，能够制作仅由不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA构成的cDNA文库。

关于本发明的第七方式

本发明的第七方式是通过将环状DNA分子供于配对法来鉴定基因的方法，包括以下工序：

1)解读碱基序列的工序，所述碱基序列是由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团、由本发明的第二方式的方法制作的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者由本发明的第三方式的方法选择的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基，其中，使用由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团时，在该工序之前、与该工序同时或者在该工序之后，进一步包括对衔接头(b)部分的序列进行序列确定而仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序；和

2)通过将工序1中解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较，来鉴定该不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA所含的基因的工序。

本发明的第七方式的方法的工序1)是解读使用本发明的第一到第三方式的方法而得的环状DNA分子中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基的碱基序列的工序。优选解读的碱基序列是15～100个碱基，进一步优选为25～35个碱基。但是，即便解读600个碱基以上也能够实施本发明的方法。碱基序列的解读可以使用对于本领域技术人员而言公知的方法解读，例如使用测序仪解读。

该工序1)中，“与该工序同时”对衔接头(b)部分的序列进行序列确定的情况例如是下述情况，即，在解读与衔接头(B)的两侧邻接的碱基序列的测序反应中，从该邻接的碱基序列的外侧向衔接头(B)开始读取序列，这样一直向衔接头(B)内部进行读取直至衔接头(b)部分的序列被同时进行序列确定。

或者也可举出下述情况，即，将相同的样品分成多个，用于衔接头(B)的外侧的序列解读和衔接头(b)部分的序列解读，将它们同时供试于测序反应，获取各自的序列数据。

在任一情况下，均能够仅选择衔接头(b)部分中的2个固有序列相同的样品(即，不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA)的数据作为分析对象。

本发明的第七方式的方法的工序2)是通过将解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较，来鉴定环状DNA分子所含的基因的工序。如果与目标DNA分子的两个末端序列对应的解读的碱基序列确认为与已知的基因的两个末端序列相同，则目标DNA分子被鉴定为该已知的基因。

关于本发明的第八方式

本发明的第八方式是通过将环状DNA分子供于配对法来检测融合基因的方法，包括以下工序：

1)解读碱基序列的工序，所述碱基序列是由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团、由本发明的第二方式的方法制作的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA或者由本发明的第三方式的方法选择的不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基，其中，使用由本发明的第一方式的方法制作的环状DNA分子的集团时，在该工序之前、与该工序同时或者在该工序之后，进一步包括通过对衔接头(b)部分的序列进行序列确定而仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的工序；和

2)将工序1中解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较的工序，其中，当两个末端的基因与已知的相异的基因对应时，该不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA所含的基因被鉴定为融合基因。

本发明的第八方式的方法的工序1)是解读使用本发明的第一到第三方式的方法而得的环状DNA分子中的与衔接头(B)的两侧邻接的各15个碱基～600个碱基的碱基序列的工序。优选解读的碱基序列为15～100个碱基，进一步优选为25～35个碱基。但是，即便解读600个碱基以上也能够实施本发明的方法。碱基序列的解读可以使用对于本领域技术人员而言公知的方法解读，例如使用测序仪解读。

该工序1)中，“与该工序同时”对衔接头(b)部分的序列进行序列确定的情况与上述第七方式同样。

本发明的第八方式的方法的工序2)是将解读的碱基序列与已知的基因的两个末端的序列比较的工序。其中，当两个末端的基因与已知的相异的基因对应时，环状DNA分子所含的基因被鉴定为融合基因。即，如果对应于目标DNA分子的两个末端序列的与解读的碱基序列的一末端相对应的部分与已知的基因的一侧末端相同，与另一末端相对应的部分与其它已知的基因的一侧末端相同，则目标DNA分子被鉴定为由2个已知的基因构成的融合基因。

例如，与衔接头(B)的两侧邻接的两侧的序列与已知融合基因的两侧的末端对应时，则目标DNA被检测为已知融合基因。在知道已知融合基因的表达与疾病的关系的情况下，可以使用由该方法检测到的融合基因作为标志物，检测以该融合基因的表达为特征的疾病。

另外例如，与衔接头(B)的两侧邻接的序列与相异的基因的末端序列对应且不与已知融合基因的两侧的末端对应时，环状DNA分子所含的基因被鉴定为新型融合基因。由该方法检测出的新型融合基因可以在药物开发筛选中应用。

实施例

以下，对使衔接头与目标DNA分子的两端(目标DNA分子的左端、右端)结合的具体的方法进行说明。

实施例1：本发明的方法在使用由mRNA合成的cDNA的融合基因表达中的应用

由mRNA合成cDNA文库时，在现在使用的最常用的方法(ClontechSMART cDNA method)中，如图9所示，利用具有与mRNA的3’末端的poly A位点互补的poly T序列的寡核苷酸(1)，首先用逆转录酶合成互补链DNA。如图9所示，合成结束时在mRNA的5’末端并入特定寡核苷酸序列(2)。接着由与该特定序列互补的寡核苷酸进行DNA合成，或者利用PCR制作cDNA文库。

合成cDNA时同时并入本发明的衔接头的情况

这种情况下，预先向具有与mRNA的3’末端的poly A位点互补的poly T序列的寡核苷酸(1)序列导入衔接头(B)，并在寡核苷酸(2)序列中加入衔接头(A)。由此，在合成cDNA文库时，自动地变成本发明的基本结构，不需要在右端左端结合新的序列，可以直接进入下一个步骤(图9)。该方法中，在通过PCR进一步扩增cDNA文库时，如果直接扩增则特定的固有序列必定扩增。因此，为了保持了固有序列的多样性，进行以下等操作，即，使用例如加入了5’磷酸基的引物作为上游引物并使用包含固有序列的引物作为下游引物进行扩增，PCR后用λ核酸外切酶分解并入了磷酸基引物侧的链，再次由上游引物进行引物延伸，完成保持了固有序列的多样性的cDNA文库。其中，如果是衔接头结合法则不需要该过程，为了在进行文库的片段化等修饰的基础上导入本发明的衔接头，进行下述衔接头结合法。

在通常的cDNA合成后并入本发明的衔接头的情况

制作cDNA文库时，如图9的(3)所示可以预先向3’末端、5’末端分别导入限制性内切酶位点。作为这种情况下的限制性内切酶位点，可以使用通常的回文型限制性内切酶位点，为了区别末端，也可以使用非回文型限制性内切酶位点。另外，为了可靠地进行衔接头结合，也可以将衔接头结合在非平滑末端而具有A突出碱基的末端。为了在进行文库的修饰的基础上导入本发明的衔接头，优选这个方法。

实施例2：本发明的方法在基因组的配对法分析中的应用

以基因组为对象时状况与cDNA文库不同。基因组片段与cDNA不同，无法区别DNA片段的左右。因此可以如图10所示通过PCR法、使用修饰接头的方法或者使用非回文序列作为两端的限制性内切酶位点X、使用包含N区域的限制性内切酶(BstXI等)在相同部位设置多个限制性内切酶位点的方法等仅选择将左端的衔接头、右端的衔接头这双方结合而使两个衔接头适当结合的产物，即图10的(a)。

例如，如果是PCR法，则可以使用相对于某一个接头(衔接头)区域的引物进行检测，如果是使用修饰接头(衔接头)的方法，例如可以预先对左端接头进行生物素修饰，对右端接头进行DIG(地高辛)修饰，利用链霉亲和素对生物素修饰接头进行阳性选择和利用抗DIG抗体对DIG修饰接头进行阳性选择，从而能够浓缩具有左端接头和右端接头这两方的片段。使用的修饰不限于生物素、DIG，只要左端接头和右端接头进行不同的修饰即可。关于使用非回文序列的限制性内切酶位点的情况，以下详述。

关于将衔接头(A)和(B)分别加入到DNA分子的两个末端的情况

基本上采用如下的方法将衔接头(A)和(B)分别加入到DNA分子的两个末端。首先使衔接头(A)与根据目标DNA分子数确定了某种程度的浓度的多个DNA组结合。这种情况下，使衔接头(A)的添加量比存在的对象DNA分子量少。但是，在化学计量上可以与对象DNA分子数的数目相同，或者可以在DNA片段上酶催化使一个碱基突出，使互补的衔接头结合，特别是这种情况下衔接头的浓度可以过量。由此，使衔接头(A)与DNA分子的末端结合。接着，使衔接头(B)结合。

本发明中，如图10的(a)中记载，需要制作一末端与衔接头(A)结合且另一末端与衔接头(B)结合的分子。其中，如图10的(b)、(c)中记载，需要排除仅结合了衔接头(A)的DNA分子(图10的(b))和仅结合了衔接头(B)的DNA分子(图10的(c))。以下，对其方法进行说明。

·衔接头(A)的限制性内切酶位点X使用非回文序列的情况

例如，使用产生切割末端W1的衔接头“A1”作为衔接头(A)，使用产生切割末端W2的衔接头“A2”作为衔接头(B)所含的衔接头(A)。其中，切割末端W1与W2互补，另一方面，W1彼此和W2彼此不互补，即，以仅能在衔接头“A1”与“A2”之间连接的方式设计或选择序列。

在图10的(a)类型的分子的情况下，毫无问题地进行第一步环化、第二切割、第二步环化，毫无问题地制作目标环化DNA。另一方面，在图10的(b)类型(两端为“A1”)和(c)类型(两端为“A2”)的分子的情况下，由于无法单独环化，所以在第一步环化工序后作为线性分子被除去。

另外，在(a)类型的分子(一端为“A1”，另一端为“A2”)和(b)类型的分子之间以及(a)类型的分子和(c)类型的分子之间，由于一末端无法结合，无法进行第一步环化，所以仍就作为线性分子被除去。

在(b)类型的分子和(c)类型的分子之间，能够进行第一步环化，形成多分子环化DNA。但是，如下所述，由于经过第二切割工序分离的该(b)类型的分子与(c)类型的分子再结合的概率实质上为0，且经过第二切割工序分离的(b)类型的分子和(c)类型的分子各自自身环化成的单分子DNA具有2个不同的固有序列并列的结构，所以能够对其进行辨别并排除。

·衔接头(A)的限制性内切酶位点X使用回文序列的情况

在图10的(a)类型的分子的情况下，毫无问题地进行第一步环化、第二切割、第二步环化，毫无问题地制作目标环化DNA。另一方面，在图10的(b)类型的分子的情况下，能够单独进行第一步环化，但由于不具有衔接头(b)部分，所以没进行第二切割而保持环状DNA的状态，无法排除。作为防止这点的方法的例子，有下述“BstXI法”。

另外，在图10的(c)类型的分子的情况下，能够单独进行第一步环化。但是，如果经过第二切割和第二步环化工序，则具有2个不同的固有序列并列的结构，能够对其进行辨别并排除。

在(a)类型的分子与(b)类型的分子之间发生了第一步环化的情况下，即便在第二步环化后也无法根据其结构与不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA区别开。但是，由于包含衔接头(B)所不含的衔接头(A)彼此的结合部位，所以通过使用例如下述“BstXI法”形成线性分子，能够排除。

在(a)类型的分子与(c)类型的分子之间发生了第一步环化的情况下，通过第二切割产生3个线性分子，但它们像最初那样再结合的概率实质上为0，另外，这些线性分子在第二步环化工序中各自自身环化而产生的环状DNA均具有2个不同的固有序列并列的结构。因此，能够对这些进行辨别并排除。

在(b)类型的分子与(c)类型的分子之间，能够进行第一步环化，形成多分子环化DNA。但是，如下所述，由于经过第二切割工序分离的该(b)类型的分子与(c)类型的分子再结合的概率实质上为0，且经过第二切割工序分离的(b)类型的分子和(c)类型的分子各自自身环化成的单分子DNA具有2个不同的固有序列并列的结构，所以能够对其进行辨别并排除。

·关于BstXI法

在两端加入了衔接头(A)的情况下，在第一步连接，但在第二步无法进行开裂，因此保持环状存在。作为解决该问题的方法，可举出向包含衔接头(A)的限制性内切酶位点的外侧引入例如BstXI。换言之，在下述限制性内切酶位点BstXI部位并入BamHI位点，使得例如CCANNNNNNTGG转化成CCAGGATCCTGG。

BstXI

即，该方法中，使衔接头(A)以及衔接头(B)所含的衔接头(A)的限制性内切酶位点成为例如BamHI位点。然后，仅针对于衔接头(A)，使BamHI位点的外侧的序列成为例如BstXI的识别序列。换言之，使衔接头(A)的序列成为CCAGGATCCTGG。另一方面，衔接头(B)所含的衔接头(A)虽包含BamHI位点，但没有引入BstXI的识别序列，不会被BstXI切割。由此，如果两端仅结合了衔接头(A)，它们彼此会合时，通过被BstXI切割而打开环，能够被排除。当然结合了衔接头(A)和(B)的情况下，由于衔接头(B)中没有BstXI的识别序列，所以不会被BstXI打开。

根据如上的方法，即使与cDNA不同而无法区别上游·下游的基因组DNA片段，使用本发明的方法也能够制作和/或选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，能够显著提高配对分析的精度。

实施例3：多分子环状DNA中相同的DNA分子彼此再结合的可能性

从概率上讲可以完全忽略经过第二切割工序分离的DNA分子彼此再次会合的可能性，以下说明其根据。

为了从概率上推断多分子环状DNA经过第二切割工序被切割而产生的一个DNA分子与切割前结合的对象DNA分子再次会合的可能性，分为以下情况：(1)用DNA分子的体积和反应溶液量(体积)推断的情况和(2)由反应溶液中的分子数推断的情况来估算可能性。

(1)用DNA分子的体积和反应溶液量(体积)推断的情况

首先将1分子DNA设为球形推断其体积，估算在反应体系中已经分离的分子彼此以球体形态在溶液中会合的可能性。

一个碱基的长度：0.34nm(0.34×10e-9m＝3.4×10e-8mm)

3kbp(3000bp)的质粒的长度：1×10e-4mm

推断作为球体所占的体积：4/3×3.14×(1×10e-4)×(1×10e-4)×(1×10e-4)mm³＝4×10e-12mm³

如果将一分子的体积假定为4×10e-12mm³则在100μL中存在100mm³/4×10e-12mm³＝2.5×10e13个球体的体积。

因此，如果反应体系是均匀的，则一个球体与同其互补的同等球体会合的可能性是(1/(2.5×10e13))＝4×10e-14，极小。

(2)由反应溶液中的分子数推断的情况

另一方面，如下计算分子数：

3kbp的质粒的分子量：625×3000＝1.8×10e6

1摩尔的质粒质量：1mol＝1.8×10e6g＝1.8×10e12μg

3μg的质粒的摩尔数：3μg/(1.8×10e12)μg＝3/1.8×10e-12mol＝1.6×10e-12mol

假定阿伏伽德罗常数为6×10e23，则3μg的质粒的分子数为1.6×10e-12×6×10e23＝1.6×6×10e11＝1×10e12个。

因此，在例如100μL的反应系中存在3μg的质粒时，第二切割工序中分离的一方的分子与另一方的(即具有相同的固有序列的)分子再次会合的可能性是1/((1×10e12)－1)＝1×10e-12，极低。

因此由这些估算可以得出下述结论：在多个DNA形成环状后再分离的情况下，与分离前相同的DNA彼此再结合的可能性极低，完全可以忽略。

产业上的可利用性

通过使用本发明的衔接头和方法，基因分析的精度得到显著改善。具体而言，通过使用本发明的衔接头和方法，能够完全辨别不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA、多分子环状DNA和来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，能够以几乎100％的概率仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA。其结果，能够进行空前的高精度的配对分析，提供一种对基因组分析极其有用的工具。特别是通过将本发明的方法应用于cDNA文库的制作，极有可能发现新型的融合基因。即，通过在序列分析的阶段排除配对分析中导致问题的多分子环状DNA，仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA，能够开发新型诊断工具·方法。

根据本发明，提供一种在DNA的环化中仅选择不来自于多分子环状DNA的单分子环状DNA的方法。由此，能够解决配对分析等基因分析中的污染问题，使高精度的分析成为可能。另外，通过将本发明的方法用于融合基因的检测·分析，使高精度的融合基因的分析成为可能，能够提供有效的诊断工具。