G-1在制备基于G蛋白偶联受体30的三阴性乳腺癌靶向药物方面的应用

技术领域

 本发明属于医药技术领域，具体涉及本发明涉及G-1在制备基于G蛋白偶联受体30的三阴性乳腺癌靶向药物方面的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有140万妇女患乳腺癌。据2013年最新统计数据表明，美国2012年共新增23万例女性乳腺癌患者，占女性新生恶性肿瘤的29％，排名第一。其死亡率占女性肿瘤死亡率的34％，列各恶性肿瘤第一位。我国乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤首位，死亡率高达40％以上，成为危害我国妇女健康的重大原因。随着对乳腺癌分子分型的深入研究，2006年Bryan等首先提出了三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)这一概念，其指的是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2（HER2）均为阴性的一类乳腺癌，约占全部乳腺癌的15～20％，在我国约有25%的乳腺癌为TNBC患者。

TNBC的概念一经提出，就引起了学者们的广泛关注。相对于其它类型的乳腺癌，TNBC具有高度侵袭性的生物学行为，大部分患者术后1～3年易复发转移，并且在复发后快速进展，从而导致大多数病人在5年内死亡。研究表明转移性TNBC患者如果仅接受化疗，其中位无进展生存期(PFS)<4个月。多项临床研究结果表明，与其它类型乳腺癌相比，TNBC有最差的总生存率和无病生存期。究其治疗失败的原因，主要在于TNBC缺乏雌孕激素受体的表达，没有HER2的过表达，导致无法实行内分泌治疗及靶向治疗，从而缺乏特别有效的系统治疗手段。由于肿瘤自身的生物学特点，许多患者都因迅速出现远处转移而导致死亡。目前针对TNBC的系统治疗手段仅为依靠化疗，即使是化疗有效，患者的缓解期也比较短，短期内肿瘤容易再次进展。

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是目前极少数的治疗TNBC靶点之一，虽然目前围绕着EGFR进行了大量的工作，试图通过EGFR找到治疗TNBC的最佳办法，但最终结果均不理想。以上结果说明，我们需要寻找出针对TNBC更为有效且安全的治疗方法。因此，针对TNBC的发生发展分子机制，开发其针对性的药物治疗靶点，已经成为当前乳腺癌领域亟待解决的关键问题。

G蛋白偶联受体30（GPR30，又名G蛋白偶联雌激素受体，GPER）是七次跨膜的G蛋白偶联受体，可介导雌激素的快速反应。其活化后可刺激腺苷酸环化酶，反式激活表皮生长因子受体，诱导动员细胞内钙离子（Ca²⁺）和活化促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）信号传导途径，从而介导雌激素的快速非基因组效应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是目的在于针对三阴性乳腺癌的靶向治疗技术不足，提供G-1在制备基于G蛋白偶联受体30的三阴性乳腺癌靶向药物方面的应用，基于本发明，可以实现全新的三阴性乳腺癌靶向治疗方案，即以G蛋白偶联受体30（又名G蛋白偶联雌激素受体，GPER）为治疗靶点，通过其特异性活化从而实现靶向治疗三阴性乳腺癌。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供G-1在制备基于G蛋白偶联受体30的三阴性乳腺癌靶向药物方面的应用。

具体是采用G-1作为药物或者药物的重要成分，靶向激活GPR30受体的策略为利用GPR30受体特异性激动剂如G-1活化GPR30，从而靶向抑制三阴性乳腺癌体内外增殖。  

本发明的技术原理在于在三阴性乳腺癌细胞中，利用G-1特异性活化GPR30受体后，可通过时间依赖性下调细胞周期蛋白cyclinB从而造成G2/M细胞周期阻滞，诱导活性氧（ROS）的升高和线粒体膜电位（ΔΨm）的降低从而使得细胞发生凋亡，其介导的分子机制是GPR30活化后可通过转录和转录后修饰上调p53，并通过GPR30/EGFR持续性激活ERK1/2，并上调p21，从而抑制三阴性乳腺癌细胞的体内外增殖。

基于本发明，可实现一种靶向治疗三阴性乳腺癌的方法，以G蛋白偶联受体30（G Protein-Coupled Receptor 30，GPR30）为靶点，利用其特异性激动剂G-1靶向活化GPR30受体，通过细胞周期阻滞和诱导线粒体介导的细胞凋亡，从而抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖并体内靶向治疗三阴性乳腺癌的发生发展。

所述的三阴性乳腺癌靶向药物策略，即以G蛋白偶联受体30（又名G蛋白偶联雌激素受体，GPER）为靶点，通过其特异性活化从而靶向治疗三阴性乳腺癌。即利用GPR30受体的特异性激动剂如G-1，激活GPR30受体后，从而靶向抑制三阴性乳腺癌体内外增殖。

进一步地，过表达GPR30或利用基于G-1改造的GPR30受体特异性激动剂，激活GPR30受体从而靶向抑制三阴性乳腺癌体内外增殖的策略。

G-1应用于制备抑制三阴性乳腺癌肿瘤的体内生长的药物方面。

G-1是作为所述G蛋白偶联受体30的特异性激动剂，通过细胞周期阻滞和/或诱导线粒体介导的细胞凋亡，应用于抑制三阴性乳腺癌细胞的体内外增殖。

G-1是作为所述G蛋白偶联受体30的特异性激动剂活化G蛋白偶联受体30后通过诱导细胞G2/M期阻滞从而抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。

G-1通过上调p53的表达，抑制三阴性乳腺癌细胞的体内外增殖。

G-1通过GPR30/EGFR持续活化ERK1/2并促使其入核介导细胞增殖抑制作用。

G-1通过EGFR/ERK1/2和p53上调p21的表达及其相互串话抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。

所述诱导线粒体介导的细胞凋亡是通过下调线粒体膜电位进行。

所述的药物含有G-1，可以还含有药学上可接受的辅料。

所述含G-1的药物，其剂型可以为口服型片剂、丸剂、胶囊、注射用注射液、粉剂或经皮或皮下吸收的剂型等。

本发明的有益效果是：

三阴性乳腺癌（TNBC）指的是雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2 （HER2）均为阴性的一类乳腺癌，约占全部乳腺癌的15～20％。由于无法实行靶向治疗，TNBC与其它类型乳腺癌相比生存率和无病生存期最差。因此，开发出针对TNBC的药物治疗靶点，已经成为当前乳腺癌领域亟待解决的关键问题。本发明人经长期大量深入的研究，总结出GPR30在三阴性乳腺癌发生发展中发挥了重要作用，是靶向治疗三阴性乳腺癌的重要靶标分子，总结出G蛋白偶联受体30为三阴性乳腺癌可靠的治疗靶点，为三阴性乳腺癌的靶向治疗及后续药物的开发奠定了良好的基础。并基于所述研究成果，针对目前三阴性乳腺癌极差的临床预后及无靶可治的临床局面，提供了一种有效的靶向激活GPR30受体从而抑制三阴性乳腺癌体内外增殖的有效方法，提供G-1在制备治疗基于GPR30的三阴性乳腺癌药物方面的应用。本发明研究表明GPR30的活化可通过G2/M周期阻滞及线粒体介导的细胞凋亡靶向抑制TNBC的增殖，其中p53、ERK1/2及其上调p21介导了这一过程。移植瘤模型表明G-1可有效抑制TNBC在体内的发生发展。本发明提供了GPR30活化可体内外显著抑制TNBC肿瘤细胞的增殖并阐明其发生作用的分子机制，突破了以往认为TNBC无靶可治的传统观念，并利用G-1作为治疗手段，为TNBC的临床治疗提供了新的具有重要潜力的临床治疗方式及治疗策略。实现了体内外靶向抑制三阴性乳腺癌的发生发展，为三阴性乳腺癌开辟性地提供了一种全新的靶向治疗策略及方法，具备良好的应用前景。

附图说明

图1 G-1的化学结构示意图。

图2 SkBr3和MDA-MB-231细胞利用10^-8～10^-5 M G-1处理48h，然后利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。

图3 SkBr3 和MDA-MB-231细胞利用 1μM G-1处理24，36和48h，然后

利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。

图4利用空白siRNA（si-NC)及si-GPR30 转染SkBr3和MDA-MB-231细胞24h后利用Western-blotting技术检测GPR30 蛋白的表达情况。

图5利用空白siRNA（si-NC）及si-GPR30转染SkBr3和MDA-MB-231 细胞 24h后，再加入1μM G-1 处理 24h，然后利用CCK-8 试剂盒检测细胞增殖。 *p < 0.05；**p < 0.01。

图6利用双重胸腺嘧啶（TdR）阻滞法，将SkBr3细胞阻滞在G1/S 期，加入 1μM G-1处理如图示时间，利用流式细胞仪检测细胞周期。

图7将SkBr3细胞周期同步化后，加入 1μM G-1处理24、48 和72h，

利用流式细胞仪检测细胞周期。

图8利用 1μM G-1处理SkBr3细胞24h后，细胞周期蛋白利用荧光定量PCR进行测定。

图9 SkBr3和 MDA-MB-231细胞1μM G-1处理72h后,细胞周期蛋白的蛋白表达水平利用Western-blotting进行检测。

图10利用 1μM G-1处理SkBr3和MDA-MB-231不同时间后，cyclinB 的表达水平利用Western-blotting进行检测；*p < 0.05。

图11 SkBr3和MDA-MB-231 利用不同浓度 G-1处理48h后，利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

图12利用不同浓度 G-1 处理 SkBr3 细胞 24h 后，细胞的线粒体膜电位通过加入JC-1染料进行分析。

图13不同浓度G-1处理SkBr3细胞48h后，线粒体介导凋亡的相关蛋白如

Bcl-2、Bax、Bim和caspase3等利用Western-blotting进行检测。

图14利用 1μM G-1处理SkBr3和MDA-MB-231 24h后利用荧光定量PCR进行检测p53 的mRNA表达水平。

图15利用 1μM G-1处理SkBr3和MDA-MB-231 24h后利用荧光定量PCR进行检测MDM2 的mRNA表达水平。

图16利用Western-blotting进行检测p53 的蛋白表达水平。

图17利用si-NC和si-p53 转染SkBr3 细胞 24h后, mRNA和蛋白表达水平，表明p53成功被干扰。

图18成功干扰p53后，用G-1(1μM)处理细胞24h，利用CCK-8检测细胞增殖。

图19利用不同浓度 G-1处理SkBr3细胞 24h后，分别提取细胞浆和细胞核的蛋白，检测p53在细胞浆和细胞核中的蛋白表达变化。

图20利用 1μM G-1处理SkBr3细胞 24h后，利用激光共聚焦显微镜观察p53的细胞定位（红色）的变化。

图21利用 1μM G-1处理SkBr3细胞不同时间后，利用免疫共沉淀检测p53 的泛素化水平。

图22利用 1μM G-1处理SkBr3细胞不同时间后，利用Western-blotting检测p-Ser-p53和p53的表达变化。*p < 0.05；**p < 0.01。

图23 SkBr3细胞利用 1μM G-1处理不同时间后，ERK1/2、JNK、和p-38 的蛋白表达及磷酸化水平的Western-blotting 检测结果。

图24 MDA-MB-231细胞利用1μM G-1处理不同时间后，ERK1/2、JNK、和 p-38的蛋白表达及磷酸化水平的Western-blotting检测结果。

图25利用 1μM G-1处理SkBr3 细胞24h后，利用激光共聚焦显微镜观察p-ERK1/2的细胞定位（绿色）。

图26将SkBr3细胞分别加入10μM MEK抑制剂PD98059(PD)，PI3K抑制剂LY294002(LY)，p38 MAPK 抑制剂 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制剂AG1478 (AG)处理24h 后，再利用 1μM G-1处理48h，利用 Western-blotting检测蛋白表达。*p < 0.05。

图27将SkBr3细胞分别加入10μM MEK抑制剂PD98059(PD)，PI3K抑制剂LY294002(LY)，p38 MAPK 抑制剂 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制剂AG1478 (AG)处理24h 后，再利用 1μM G-1处理48h，利用cck-8 细胞增殖。**p < 0.01。

图28利用si-NC或 si-p21 转染SkBr3 细胞 24h后，Western-blotting表明p21 的表达被成功抑制。

图29成功抑制p21后，加入1μM  G-1 处理细胞 24h后，利用CCK-8 检测细胞增殖。

图30将SkBr3细胞分别加入10μM MEK抑制剂PD98059(PD)，PI3K抑制剂LY294002(LY)，p38 MAPK 抑制剂 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制剂AG1478 (AG)处理24h 后，再利用 1μM G-1处理24h，利用Western-blotting检测p21的蛋白表达。*p < 0.05。

图31将SkBr3细胞分别加入10μM MEK抑制剂PD98059(PD)，PI3K抑制剂LY294002(LY)，p38 MAPK 抑制剂 SB203580 (SB)，或 EGFR 抑制剂AG1478 (AG)处理24h 后，再利用1μM G-1处理24h，利用Western-blotting检测p-Ser -p53、 p53的蛋白表达。*p < 0.05。

图32利用 2×10⁶个 MDA-MB-231细胞在左侧第四对乳腺脂肪垫处构建裸鼠TNBC移植瘤模型，然后静脉注射G-1（0.4mg/kg），每隔三天注射一次，绘制肿瘤体积变化曲线。

图33实验结束后，取出裸鼠肿瘤发现G-1组小鼠肿瘤体积明显小于对照组，结果显示。

图34利用Western-blotting检测两组小鼠瘤体内GPR30 诱导增殖抑制的相关蛋白的表达水平。*p < 0.05；**p < 0.01。

图35 GPR30 受体活化后靶向抑制TNBC细胞体内外增殖的分子机制。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。除非特别说明，本发明实施例采用的生物材料、试剂为本领域常规使用的生物材料、试剂；除非特别说明，本发明实施例采用的方法为本技术领域常规方法。

实施例1  GPR30活化后能剂量/时间依赖性抑制TNBC细胞的体外增殖

利用GPR30特异性激动剂G-1（化学结构见图1），探讨其对TNBC细胞体外增殖的影响。

实验材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

TNBC乳腺癌细胞株SkBr3 (ERα-, ERβ-) 和MDA-MB-231 (ERα-, ERβ+)由本实验室保种或采用其他常规实验检验室以及细胞库来源的TNBC乳腺癌细胞株SkBr3和MDA-MB-231，不因乳腺癌细胞株来源限定本发明。胎牛血清购自Gbico公司，细胞转染试剂、siRNA空白对照、及si-GPR30购自锐博生物科技有限公司，G-1以及其余试剂为Sigma公司（分析纯或以上）。Cell Counting Kit-8试剂盒购自同仁化学公司荧光显微镜购自Olympus公司，荧光定量PCR仪 LightCycler 480II购自Roche公司，激光共聚焦显微镜 LSM710购自Zeiss公司。

细胞复苏及培养

将冻存于液氮罐中TNBC乳腺癌细胞株SkBr3 (ERα-, ERβ-) 和MDA-MB-231 (ERα-, ERβ+)取出，于37℃水浴锅中快速融化。超净工作台中，转移细胞悬液至10 mL离心管中，加入5 mL 1640培养基，低速离心1000 rpm×5 min，弃上清，加入含10% FBS的1640培养基内，于5% CO₂、37℃条件下培养。

细胞处理及增殖测定

将贴壁的SkBr3和MDA-MB-231细胞进行消化重悬，铺板至96孔板，每孔加入100 μl细胞悬液（5000 cells/well），将培养板在培养箱中预培养24 h，将10 μl不同浓度的G-1加入培养板中，养箱孵育适当的时间后，将10 μl CCK-8溶液加入到每孔中，培养箱内孵育2小时，酶标仪测定450 nm处的吸光度，分析G-1活化GPR30后对细胞增殖的影响。

干扰实验

转染前将SkBr3和MDA-MB-231细胞接种至6孔细胞培养板中，细胞密度能够达到50～60%的汇合度时，采用Lipofectamine 2000进行转染。主要步骤为：用100 μl不含血清Opti-MEM培养基稀释2.5 μl 10 mM的siRNA（加入的siRNA终浓度为100 nM），轻轻混匀，室温孵育5 min，用100 μl不含血清培养基Opti-MEM稀释2 μl Lipo 2000，将两者轻轻混匀，室温孵育20 min后加入含有细胞以及培养液的培养板各孔中。将细胞置于37 ℃的CO₂培养箱中培养4～6 h后，移去含siRNA-lipo2000混合液的培养基，更换新鲜的细胞培养基继续培养。干扰si-GPR30的细胞24 h后，进行G-1处理，利用CCK-8 Kit检测细胞增殖。

分析

收集处理后的细胞，PBS洗涤2次，加入三去污细胞裂解液，冰上放置15～20 min。收集细胞裂解液于EP管，最大转速离心20 min，收集上清。Bradford法测定蛋白质浓度。以每孔20 μg蛋白上样量，电压80～120 V进行SDS-PAGE电泳分离。恒流200 mA、90 min的条件下电转印至甲醇预处理的PVDF膜上。5%脱脂奶粉（PBST配制）封闭PVDF膜2 h。检测抗体以1: 1000比例与封闭液稀释， 4℃孵育PVDF膜过夜。PBST洗涤PVDF膜10 min×3次，加入HPR标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（1:5000，封闭液稀释），室温孵育1 h。PBST洗涤PVDF膜10 min×3次。加入ECL发光液用X光片曝光。

结果

本实施例两种TNBC乳腺癌细胞株，SkBr3 (ERα-，ERβ-) 和MDA-MB-231 (ERα-，ERβ+)，利用G-1激活GPR30受体后对细胞增殖的影响，实验发现用G-1处理细胞48小时后，细胞的增殖受到抑制并呈现出浓度依赖性（图2 ）。G-1对SkBr3和MDA-MB-231细胞的IC50分别是4.05μM和7.84μM。利用1μM的G-1作用SkBr3和MDA-MB-231 24、36、48h后，发现G-1对两种TNBC细胞成显著抑制效应，且随时间的延长抑制效果显著增加（图3）。为确认GPR30受体介导了G-1对TNBC细胞体外增殖的抑制作用，利用si-GPR30特异性抑制GPR30在SkBr3和MDA-MB-231的表达后（图4），发现其能显著逆转G-1诱导的细胞增殖抑制作用（图5）。以上实验结果表明，利用G-1活化GPR30受体后能显著抑制TNBC细胞的体外增殖。

实施例2  GPR30活化后诱导TNBC细胞G2/M周期阻滞及线粒体介导的细胞凋亡

利用GPR30特异性激动剂G-1（化学结构见图1），探讨其对TNBC细胞周期及细胞凋亡的影响。

实验材料和方法

1.1 PI单染检测细胞周期与凋亡

将TNBC细胞SkBr3或MDA-MB-231铺板至6孔板（5×10⁵ cells/well），培养24 h后加入不同浓度的G-1处理。胰酶消化、收集细胞，3000 rpm/min离心3 min，弃去培养液。PBS洗涤1次，3000 rpm/min离心3 min，弃去PBS。加入冰预冷的70%的乙醇， 4℃固定2小时，离心弃去固定液。PBS洗涤1次，3000 rpm/min离心3 min，弃去PBS。加入150 μl RNaseA（250-500 μg/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。3000 rpm/min离心3 min，弃去PBS。加入0.5 mL PI染色液（100 μg/ml），4℃避光染色30 min。400目的筛网过滤，转至流式检测管。流式细胞仪检测： PI用488nm氩离子激光器激发，由630带通滤光片接收，通过FS/SS散点图收集10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和在碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期（G0/G1、S、G2/M）的百分率和凋亡细胞（sub-G1）百分率。

探针检测细胞膜电位(?Ψm )

将TNBC细胞SkBr3或MDA-MB-231铺板至6孔板培养24h后加入不同浓度G-1进行处理，用PBS洗涤细胞1次，每孔加入1 ml细胞培养液，充分混匀，细胞培养箱中37℃孵育20 min。在孵育期间，按照每1 ml JC-1染色缓冲液（5×）加入4 ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次。每孔加入2 ml细胞培养液，荧光显微镜下观察。

细胞总RNA提取与Real-time PCR检测细胞周期蛋白

采用E.Z.N.A. HP Total RNA Kit根据说明书提取细胞内总RNA。并对提取的RNA采用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录，37℃逆转录反应15 min得到cDNA，然后采用TaKaRa SYBRPremix Ex Taq?试剂盒进行Real Time PCR分析。起始温度设为65℃；温度变化设为0.5℃，结束温度设为95℃。Real Time PCR反应结束后，确认Real time PCR的扩增曲线和融解曲线，采用ΔΔCt法对结果进行统计分析。其中ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，基因相对表达量=2^-ΔΔCt。

其余实验方法见实施例1。

结果

2.1 GPR30活化导致TNBC细胞G2/M期阻滞

我们用胸腺嘧啶核苷双阻断法同步化处理细胞以便于细胞都处于G1期，再用G-1处理SkBr3 12 小时后进行流式分析，结果发现G-1处理组G2/M 期显著升高，在同步化后的第一个周期中，细胞在9小时后都同时进入了G2/M期但G-1延缓了它往G2/M期的进程（图6），且这种由G-1处理后引起的G2/M期阻滞可待续至72小时（图7），以上证据表明GPR30受体活化后可通过诱导细胞G2/M期阻滞从而抑制TNBC细胞增殖。

细胞周期蛋白是调控细胞周期进程的关键蛋白分子。我们利用qRT-PCR及Western-blotting检测相关周期蛋白的表达变化。结果表明G-1能显著下调cyclin B的mRNA，而对其它周期蛋白无影响（图8），这一结果在蛋白水平得到了验证（图9），且G-1处理前细胞用血清饥饿cyclin B 的下调更明显。进一步研究表明，G-1能呈时间依赖性下调cyclinB在SkBr3和MDA-MB-231细胞中的表达（图10）。cyclinB被认为是调控细胞G2/M期转换的关键周期蛋白，实验结果表明G-1可以通过下调cyclinB而且导致TNBC细胞的G2/M期阻滞。

激活GPR30 可以诱导TNBC细胞发生线粒体介导的细胞凋亡

利用1～5 μM G-1处理SkBr3和MDA-MB-231细胞48h后，流式细胞仪分析发现G-1处理组的细胞凋亡呈剂量依赖性增加（图11）。蛋白检测结果表明G-1可以剂量依赖性地上调Bax、Bims、和caspase3成熟体的表达，并抑制Bcl-2的表达（图13）。以上结果表明G-1可诱导线粒体介导的细胞凋亡效应从而抑制细胞增殖。

我们进一步探讨G-1对TNBC细胞株的线粒体膜电位影响。如图12所示，G-1能使细胞红色荧光向绿色荧光（FITC）的转变呈剂量依赖性增加。JC-1在线粒体膜电位较高时，聚集在线粒体的基质中所形成聚合物能产生红色荧光；JC-1在线粒体膜电位较低时，不能聚集在线粒体的基质中而单体形式存在，产生绿色荧光。线粒体膜电位的变化通过荧光颜色的转变来检测。从而表明G-1诱导细胞发生线粒体介导的细胞凋亡可通过下调线粒体膜电位进行。

实施例3  p53、ERK1/2及其串话介导了GPR30对TNBC细胞的增殖抑制作用

为进一步阐明GPR30活化后抑制TNBC细胞增殖的分子机制，本实施例研究探讨p53、ERK1/2及其串话在其中的作用。

实验材料和方法

1.1细胞核和细胞质蛋白的提取

采用细胞核和细胞质蛋白提取试剂盒分别提取细胞核蛋白和胞质蛋白。收集处理后的细胞，PBS洗涤细胞2次。加入200μl遇冷的Buffer A（使用前每ml Buffer A加入1 μl DTT，10μl PMSF，1μl 蛋白酶抑制剂），剧烈震荡15 s，冰上放置15 min。加入11 μl Buffer B，剧烈震荡15 s，冰上放置15 min。4 ℃ 12000 g离心5 min，此时溶液分为3层：最下层为透明层，中间为白色细胞核沉淀，最上层为胞质蛋白裂解液。收集上层胞质蛋白裂解液，吸出下层液体并丢弃，剩余白色细胞核沉淀。在细胞核沉淀中加入100μl Buffer C（使用前每ml Buffer A加入1 μl DTT，10μl PMSF，1μl 蛋白酶抑制剂），剧烈震荡15 s，冰浴40 min，期间剧烈震荡30 s多次。4 ℃ 12000 g离心5 min，收集上清即为细胞核裂解液。

激光共聚焦检测p53和p-ERK1/2的核转位

SkBr3细胞在多聚赖氨酸预处理过的盖玻片上培养，血清饥饿处理12 h；G-1处理细胞24h后，PBS洗涤细胞3次；4%多聚甲醛固定细胞30 min；山羊血清于37 ℃封闭细胞30 min；加入抗p53或p-ERK1/2抗体（1：200稀释）4℃孵育过夜； PBS清洗细胞3次；加入FITC标记的羊抗小鼠二抗（1: 1000稀释）于37 ℃孵育1h； PBS洗涤细胞3次；加入10 μg/ml的 DAPI孵育10 min染细胞核；激光共聚焦显微镜检测分析FOXO3a的核转位情况。

免疫共沉淀检测p53的泛素化

细胞按1 × 10⁶个/皿接种在10 mm²的细胞培养皿中，培养24h 后，加相应浓度的化合物继续培养12h。弃旧的细胞培养基，预冷的PBS 缓冲液洗涤1 次，然后加入500 μL IP 细胞裂解液在冰上裂解细胞20 min。9,000 g，20 min，4 °C 离心收集细胞碎片，得上清的蛋白样品。经BCA 法测定蛋白浓度后，取约1 mg 的上清蛋白样品，加入1μg 跟一抗同源的普通IgG 和20μL 混匀的Protein A+G Agarose，4 °C 慢摇1h。1,000 g，5 min，4 °C 离心收集上清的蛋白样品，再加入1μg 相应的一抗，4 °C 慢摇过夜。接着加入20μL 混匀的Protein A+G Agarose，4 °C 慢摇3h，1,000 g，5 min，弃上清。用IP 细胞裂解液洗涤Protein A+G Agarose 5 次，1,000 g，5 min，弃上清。最后加入20μL SDS 上样裂解缓冲液重新Protein A+GAgarose，100 °C 煮沸5 min，冷却离心后，上清液用于Western blot 分析。

其余实验方法见实施例1及2。

结果

2.1 p53参与介导GPR30活化后对TNBC的增殖抑制作用

本发明研究发现，1μM G-1能时间依赖性上升p53的mRNA（图14）及蛋白（图16）在SkBr3细胞中的表达，并降低p53的活性抑制剂MDM2的mRNA表达（图15）。为验证p53在G-1抑制细胞增殖中重要作用，我们利用si-p53特异性敲除p53在SkBr3细胞中的表达（图17），发现p53的抑制能显著逆转G-1对SkBr3细胞的增殖抑制作用（图18）。以上结果表明G-1能上调p53的表达从而发挥TNBC细胞增殖抑制作用。

研究表明p53的翻译后修饰及细胞定位对其肿瘤抑制功能发挥了重要作用。我们利用0.5μM 和1μM G-1刺激SkBr3 24小时分别提取细胞的核蛋白与浆蛋白，WB检测结果表明G-1显著上调了p53的细胞核表达（图19），且这一实验结果同样被免疫荧光所证实（图20）。细胞内p53 稳定性主要通过泛素介导的蛋白酶体降解过程调节的，我们检测结果发现G-1刺激后可以降低它的泛素化水平（图21）。文献报导p53蛋白15位丝氨酸位点的磷酸化在p53的入核中起着重要的作用，我们的检测结果表明G-1能显著促进SkBr3细胞中p53蛋白15丝氨酸位点的磷酸化，并随着时间的推移p53蛋白的表达量增加（图22）。以上结果表明G-1抑制TNBC的增殖是通过上调p53的转录及翻译，促使其15丝氨酸磷酸化后入核并抑制其泛素化，从而发挥作用。

的持续活化参与了GPR30活化后对TNBC细胞的增殖抑制作用

本发明研究发现在SkBr（图23）和MDA-MB-231（图24）中，G-1刺激可以快速活化ERK1/2 并持续超过48h，而对ERK1/2 蛋白表达没有影响，同样JNK和p38等另外两个重要的MAPK信号分子不受G-1的刺激发生变化。免疫荧光发现，G-1刺激后能使得p-ERK1/2入核显著增加（图25）。以上结果表明G-1可诱导ERK1/2的持续磷酸化并促进其入核。

为探讨G-1诱导ERK1/2持续磷酸化的分子机制及其作用，我们分别用MEK 抑制剂PD98059(PD), PI3K抑制剂LY294002(LY), p38-MAPK 抑制剂 SB203580(SB), 和EGFR 抑制剂AG1478(AG)处理SkBr3细胞24h后加入G-1。结果表明AG1478 和PD98059可以减弱G-1引起的cyclin B的上调和ERK1/2的磷酸化（图26），并显著逆转G-1对SkBr3细胞的增殖抑制作用（图27）。以上结果证实G-1可通过GPR30/EGFR持续活化ERK1/2并促使其入核从而介导细胞增殖抑制作用。

上调参与了GPR30活化后对TNBC细胞的增殖抑制作用

图16表明G-1在上调p53表达的同时可显著上调p21。为探讨p21是否参与了G-1的细胞增殖抑制作用，我们利用si-p21特异性敲除SkBr3细胞中的p21（图28），发现p21的敲除能显著逆转G-1对SkBr3细胞的增殖抑制作用（图29）。研究表明ERK1/2的活化可通过转录和翻译后修饰上调p21的表达，为探讨非p53依赖型信号在G-1上调p21中的作用，我们分别用MEK 抑制剂PD98059(PD), PI3K抑制剂LY294002(LY), p38-MAPK 抑制剂 SB203580(SB), 和EGFR 抑制剂AG1478(AG)处理SkBr3细胞24h后加入G-1，发现AG和PD, 而非LY和SB，能显著地减弱G-1上调p21的作用（图30），从而表明GPR30/EGFR/ERK1/2介导了G-1对p21的上调作用。同时，AG和PD能显著逆转G-1诱导的p53第15位丝氨酸的磷酸化水平（图31），而对p53蛋白水平没有显著变化。以上结果表明G-1可通过EGFR/ERK1/2和p53上调p21的表达，并且它们相互串话参与G-1对TNBC细胞的增殖抑制作用。

实施例4  激活GPR30受体可以抑制TNBC细胞的体内生长

为探讨GPR30活化对TNBC体内生长的影响，我们通过构建TNBC移植瘤模型，绘制肿瘤体积曲线，探讨G-1对肿瘤体内生长的影响及分子机制。

实验材料和方法

1.1裸鼠TNBC移植瘤模型的构建

裸鼠20只，随机分为2组。溶剂对照组10只，G-1处理组10只。每只裸鼠利用2 × 10⁶ 个MDA-MB-231细胞在左侧第四对乳腺脂肪垫处构建裸鼠TNBC移植瘤模型。接种15天后可以触摸到芝麻粒大小肿瘤长出，将移植瘤组裸鼠随机分为2组，其中G-1处理组静脉注射G-1（0.4mg/kg），每隔三天注射一次，给药时间为15天。

裸鼠体内生长评价

给药前用游标卡尺测定肿瘤的长径a和短径b，按v=1/2ab²计算肿瘤体积，隔天测量一次，绘制肿瘤体积变化曲线。于给药后第22天采用颈椎脱臼法处死裸鼠，解剖裸鼠，剥离移植瘤并称量重量。并利用Western-blotting检测肿瘤内蛋白的变化。

结果

两组小鼠肿瘤生长曲线见图32。10天后，对照组细胞长出可测量大小的肿瘤，且体积随着时间的增加而增大。而G-1处理组细胞在18天后才长出可测量大小的肿瘤，且生长缓慢。24天后，所有的裸鼠被处死因为对照组的肿瘤已经大到影响裸鼠的生存。在这整个观察过程中，G-1组形成的肿瘤大小明显比对照组小(图32和图33)。结果表明G-1可显著抑制TNBC在体内的发生发展。WB结果表明，G-1能显著地增加p53、p21、ERK1/2、cyclinB在瘤内的表达(图34)， 从而可以按图35所示机制体内抑制TNBC的发生发展。本发明研究表明GPR30的活化可通过G2/M周期阻滞及线粒体介导的细胞凋亡靶向抑制TNBC的增殖，其中p53、ERK1/2及其上调p21介导了这一过程(图35)。移植瘤模型表明G-1可有效抑制TNBC在体内的发生发展。