用于改善发酵单胞菌属(Zymomonas)中的木糖利用率的PNP基因修饰

本专利申请要求2011年12月20日提交的美国临时申请61/577871的 优先权，该临时申请全文以引用方式并入本文。

政府权利声明

本发明由美国政府支持，以资助号合约号DE-FC36-07GO17056受到能 源部资助。政府拥有本发明中的某些权利。

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，发酵单胞菌属 (Zymomonas)基因组中的pnp基因被鉴定为用于修饰的靶标，以提供改善的 木糖利用率和乙醇的生产。

背景技术

通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因 此成为当前研究的重要领域。希望生产乙醇以及其它有用产品的微生物能 够使用木糖作为碳源，因为木糖是水解的木质纤维素生物质中主要的戊 糖。生物质能够提供丰富的可利用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)和其他天生不会利用木糖的产生乙醇的细菌已接受了遗 传工程改造以利用木糖，上述遗传工程改造是通过引入编码下列的基因进 行的：1)木糖异构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，它 将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶(US  5514583、US 5712133、US 6566107、WO 95/28476，Feldmann等人(1992) Appl.Microbiol.Biotechnol.，38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240- 243；Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)。通常所使用 的编码区是来自大肠杆菌(E.coli)的基因。

即使有上述木糖利用途径的表达，经工程化改造的菌株通常在木糖上 的生长和乙醇生产也不像在葡萄糖上那么好。通过连续传代，已使针对木 糖的利用经工程化改造的菌株在木糖培养基上适应，产生了具有改善的木 糖利用率的菌株，如美国专利7,223,575和美国专利7,741,119中所述。后 者还公开了用以改善木糖利用率的编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的GFOR基 因座的失活。美国专利7,998,722公开了通过从突变的高度活性的运动发酵 单胞菌(Zymomonas mobilis)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子(Pgap)表达大肠 杆菌(E.coli)木糖异构酶，用于改善木糖利用率的工程化改造。

仍然存在对在包含木糖的培养基中具有改善的木糖利用率和乙醇生产 的发酵单胞菌属(Zymomonas)和其他产乙醇细菌的工程化改造的菌株、以及 使用这些菌株来生产乙醇的方法的需求。

发明内容

本发明提供了重组的利用木糖的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌 属(Zymobacter)细胞，在其中编码多核苷酸磷酸化酶的内源性pnp基因是经 修饰的。此外，所述细胞具有提高的核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性和非限制 性的木糖异构酶活性。在这些细胞中，在包含木糖的培养基中的木糖利用 率和乙醇生产是改善的。

因此，本发明提供了重组细菌宿主细胞，所述重组细菌宿主细胞包 括：

a)木糖代谢途径，其包括至少一种具有木糖异构酶活性的多肽；

b)至少一种基因修饰，其与缺少所述基因修饰的宿主细胞中的核糖- 5-磷酸异构酶活性相比，使所述宿主细胞中的核糖-5-磷酸异构酶 活性升高；以及

c)编码多核苷酸磷酸化酶的内源性基因序列中的至少一种基因修 饰，所述基因修饰使编码区缩短，导致C末端截短的蛋白质的表 达；

其中所述细菌宿主细胞利用木糖以生产乙醇，木糖异构酶活性在所述 细菌宿主细胞中不是限制性的。

在另一个实施例中本发明提供用于生产乙醇的方法，所述方法包括：

a)提供上文所述的重组宿主细胞；以及

b)在包含木糖的培养基中培养(a)的宿主细胞，从而使木糖被转化为 乙醇。

附图说明和序列表

序列描述

申请人已经按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩 斯条约(Budapest Treaty)的有关条款进行了以下生物保藏：

保藏菌株信息

图1示出了针对木糖代谢和乙醇生产的途径的示意图。

图2示出了pMODlinker-Spec-GapRpi的质粒图谱。

图3示出了各自具有RPI的过表达的菌株B9、B11、I，和亲本菌株 ZW801-4：在mRM3-X10中的生长(A)；在54小时的木糖消耗和核酮糖生产 (B)，以及在mRM3-G10中的生长(C)。

图4示出了具有附加的木糖异构酶的七个I菌株转化体(I(cm1-5，8，9))以 及I菌株(I-1，2)和ZW801(801-1，2)对照：在mRM3-X10(A)中的生长，以及 在mRM3-G10中的生长(B)。

图5示出了具有附加的木糖异构酶的两个I菌株转化体(I(cm1，9))，以 及I菌株和ZW801-4对照在pH受控条件下在mRM3-X10中的生长。

图6示出了具有附加的木糖异构酶的十个B11菌株转化体(B11(cm1- 10))，以及B11对照(B11-1，2)(A)；或具有附加的木糖异构酶的十个B9菌 株转化体(B9(cm1-10))，以及B9对照(B9-1，2)(B)在mRM3-X10中的生长。

图7示出了野生型运动发酵单胞菌(Z.mobilis)菌株ZM4 pnp编码的多 核苷酸磷酸化酶(SEQ ID NO：2)和由I菌株的经修饰的pnp基因编码的融合 蛋白(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列的比对。

图8示出了pZX21(A)、pZX52(B)、和pZX6(C)的质粒图谱。

图9示出了ZW1-X109(A)、ZW1-X210(B)、和对照ZW1(C)在 mRM3-G10中生长的培养物的生长、葡萄糖利用、和乙醇生产的图。

图10示出了ZW1-109(A)、ZW1-210(B)、和对照ZW1(C)在mRM3- X10中生长的培养物的生长、葡萄糖利用、和乙醇生产的图。

图11示出了pPNP-I(A)、pPNP-IN(B)、pPNP-C(C)、和pPNP-M(D) 的质粒图谱。

图12示出了ZW1-X109-PNPi(A)、ZW1-X109-PNPc(B)、ZW1-X109- PNPm(C)、ZW1-X109-PNPin(D)、和对照ZW1-X109(E)在mRM3-G10中 生长的培养物的生长、葡萄糖利用、和乙醇生产的图。

图13示出了ZW1-X109-PNPi(A)、ZW1-X109-PNPc(B)、ZW1-X109- PNPm(C)、ZW1-X109-PNPin(D)、和对照ZW1-X109(E)在mRM3-X10中 生长的培养物的生长、葡萄糖利用、和乙醇生产的图。

图14示出了ZW801-PNPi(A)、ZW801-PNPc(B)、和对照ZW801(C) 在mRM3-X10中生长的培养物的生长、木糖利用、和乙醇生产的图。

下列序列符合37C.F.R.1.821-1.825(“Requirements for Patent  Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence  Disclosures-the Sequence Rules(对包括核酸序列和/或氨基酸序列公开的专 利申请的要求-序列规则)”)，并且与世界知识产权组织(World  Intellectual Property Organization，WIPO)标准ST.25(2009)和EPO和PCT 的序列表要求(规则5.2和49.5(a-bis规则)，以及行政指导的208节和附 录C)相一致。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R. §1.822所示的规定。

SEQ ID NO：1是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ZM4的 pnp编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ZM4的 pnp编码的多核苷酸磷酸化酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株NCIMB 11163的pnp编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株NCIMB 11163的pnp编码的多核苷酸磷酸化酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ATCC  10988的pnp编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ATCC  10988的pnp编码的多核苷酸磷酸化酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是来自运动发酵单胞菌pomaceae亚种(Zymomonas  mobilis pomaceae)ATCC 29192的pnp编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ATCC  29192的pnp编码的多核苷酸磷酸化酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是I菌株的经修饰的pnp编码的融合蛋白的氨基酸序列， 其具有709个天然的N-末端氨基酸和14个附加的C-末端氨基酸。

SEQ ID NO：10是具有695个天然的N-末端氨基酸和2个附加的C-末 端氨基酸的经修饰的pnp编码的融合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是具有368个天然的N-末端氨基酸和10个附加的C-末 端氨基酸的经修饰的pnp编码的融合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是具有32个天然的N-末端氨基酸和17个附加的C-末 端氨基酸的经修饰的pnp编码的融合蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI蛋白质的编码区的核 苷酸序列。

SEQ ID NO：14是运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI蛋白质的氨基酸序 列。

SEQ ID NO：15是大肠杆菌(E.coli)RPI蛋白质的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是大肠杆菌(E.coli)RPI蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是经密码子优化以在运动发酵单胞菌(Zymomonas  mobilis)中表达的密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)木糖异构酶 的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)木糖异 构酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)核酮糖-磷酸-3-表 异构酶的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)核酮糖-磷酸-3-表 异构酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21是P_gapS(也称为801gap)突变体启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是质粒pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL中的RPI表 达盒的核苷酸序列，其位于唯一的NcoI和NotI位点之间。

SEQ ID NO：23和24是引物PPI-F和PPI-R-SbfI。

SEQ ID NO：25是质粒pZX21的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是GFO-L片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是gfor编码序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28是GFO-R片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29是包含304-bp运动发酵单胞菌(Z.mobilis)Super GAP启 动子、1,185-bp密苏里游动放线菌(A.missouriensis)xylA编码序列、和具有 5’XbaI位点的166-bp大肠杆菌(E.coli)araD 3’UTR的1,661-bp嵌合的xylA 基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是包含191bp P_eno、1,455-bp大肠杆菌(E.coli)xylB编码 序列和314-bp大肠杆菌(E.coli)xylB 3’UTR的1,960-bp嵌合的xylB基因的 核苷酸序列。

SEQ ID NO：31是以lox位点为边界的1,014bp aadA标记(用于奇放线菌 素(spectinomycin)抗性；Spec-R)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：32是穿梭载体pZX52的核苷酸序列。

SEQ ID NO：33是LDH-L片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是LDH-R片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35是ldhA编码序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：36是包含运动发酵单胞菌(Z mobilis)GAP启动子的304-bp T突变体(P_gapT)、954-bp大肠杆菌(E.coli)Tal编码区、1,992-bp大肠杆菌(E. coli)Tkt编码区、和68-bp大肠杆菌(E.coli)Tkt 3’UTR的3,339bp P_gapT-Tal- Tkt操纵子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37是P_gapT启动子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38是包含191bp P_eno、471bp运动发酵单胞菌(Z.mobilis) Rpi编码序列、663bp运动发酵单胞菌(Z.mobilis)Rpe编码序列、和35bp大 肠杆菌(E.coli)xylA 3’UTR的1,443bp P_eno-Rpi-Rpe操纵子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39是DCO穿梭载体pZX6的核苷酸序列。

SEQ ID NO：40是PNP-L片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：41是PNP-R片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42至54是PCR引物。

SEQ ID NO：55是DCO自杀载体pPNP-I的核苷酸序列。

SEQ ID NO：56是用于向pnp基因中整合的上游旁侧序列的核苷酸序 列。

SEQ ID NO：57是用于向pnp基因中整合的下游旁侧序列的核苷酸序 列。

SEQ ID NO：58是DCO自杀载体pPNP-N的核苷酸序列。

SEQ ID NO：59是PNP-U片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：60是PNP-D片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：61是DCO自杀载体pPNP-C的核苷酸序列。

SEQ ID NO：62是DCO自杀载体pPNP-M的核苷酸序列。

SEQ ID NO：63是PNPm-L片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：64是PNPm-R片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：65是起始密码子突变为ATG的运动发酵单胞菌(Z mobilis) RPI蛋白质的编码区的核苷酸序列。

具体实施方式

本文公开了具有内源性pnp基因的基因修饰(pnp修饰)的利用木糖的 细菌细胞，具体地为发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter) 细胞。此外，所述细胞还经过了基因修饰以具有与没有该基因修饰的细胞 相比提高的核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活性的表达。此外，所述细胞在不存在 上述pnp修饰下不受限于木糖异构酶活性。具有这些特性的细胞具有改善 的木糖利用率(这是在包括糖化的生物质的包含木糖的培养基中生长所期 望的)，导致了提高的乙醇生产。乙醇是用于替代化石燃料的重要化合 物，而糖化的生物质提供了用于通过发酵生产乙醇的丰富的可利用的可再 生碳源。

可使用下列定义阐释权利要求和说明书：

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”，或者 其任何其他变型旨在包括非排他的包括。例如，包含一系列元素的组合 物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括 其他未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设 备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的 “或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下中任一者均满足条件A或 B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存 在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

同样，涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分 前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此，应将“一 个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数 形式也包括复数形式，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨 在意指本发明的任何单独实施例，而是涵盖如本说明书和权利要求所述的 所有可能的实施例。

如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量的术语“约”是指可以 通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于生 产浓缩物或使用溶液的典型测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意 的误差；通过在生产组合物或进行所述方法所使用的成分的制造、来源、 或纯度方面的差异等。术语“约”还涵盖由于相对于由特定起始混合物所 得的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修 饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数 值10％范围内，优选地在报告数值5％范围内。

术语“碳底物”或“可发酵碳底物”指能够被本发明的宿主生物代谢 的碳源，并且特别是选自以下的碳源：单糖、低聚糖和多糖。

“基因”指表达特定蛋白质或功能性RNA分子的核酸片段，其可任选 地包括位于编码序列之前的调控序列(5′非编码序列)和之后的调控序列 (3′非编码序列)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列 的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天 然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包来源 于不同来源的调控序列和编码序列，或者来源于相同来源、但排列方式与 天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”指生物 体的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存 在于宿主生物中的基因，它通过基因转移引入宿主生物。外来基因可以包 含插入到非天然生物体内的天然基因或嵌合基因。“基因座”是包含基因 的基因组的区域。

术语“基因构建体”是指编码表达一种或多种特定蛋白质或功能性 RNA分子的核酸片段。在基因构建体中基因可以是天然的、嵌合的、或外 来的。通常基因构建体应包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨 基酸序列的DNA序列。

“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达 的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个 源于天然基因，或者由来源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或 者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动 子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同 的环境条件而指导基因的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时 候表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。

术语“基因修饰”非排他地指宿主细胞或细菌菌株的遗传因子的任何 修饰、突变、碱基删除、碱基添加、密码子修改、基因过表达、基因抑 制、启动子修饰或取代、基因添加(单或多拷贝的)、反义表达或抑制、 或任何其他改变，无论它们是否产生表型的变化。

术语“重组细菌宿主细胞”是指包含至少一种异源性基因或遗传构建 体或核酸片段的细菌细胞。

如本文所用，术语“表达”指来源于基因的编码(mRNA)或功能性 RNA的转录和稳定积聚。表达还可以指mRNA向蛋白质的翻译。“反义抑 制”是指能够抑制靶蛋白的表达的反义RNA转录物的生产。“过表达”指 在转基因生物中超出在正常生物或未转化生物中生产的水平的基因产物的 生产。“共抑制”是指能够抑制相同的或基本上类似的外来或内源性基因 的表达的有义RNA转录物或片段的生产(U.S.5,231,020)。如本文所用，术 语“转化”是指核酸片段向宿主生物内的转移，导致基因稳定遗传。转化 的核酸可以是宿主细胞中保留的质粒形式，或者一些转化的核酸可以被整 合进宿主细胞的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基 因”或“重组”或“转化的”生物体。

如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中 心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形 式。此类元件可以是单链或双链DNA或RNA的线性或环状的、来源于任 何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，在其中 许多核苷酸序列已被接合或重组为能够将针对所选择的基因产物的启动子 片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起引入细胞中的独特构造。

术语“可操作地连接”指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其 中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够 影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则 该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向 可操作地连接至调控序列。

术语“选择性标记”指一种鉴定因子，通常是抗生素或化学药品抗性 基因，该因子能基于标记基因的效应，即，对抗生素的抗性进行选择，其 中所述效应用于追踪受关注核酸的遗传和/或用于鉴定遗传了受关注核酸的 细胞或生物。

如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编 码的蛋白质的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员 非常了解特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出 的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达 时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的 密码子使用频率。

术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因 或编码区时是指在不改变由DNA编码的蛋白质的情况下，改变核酸分子的 基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。

术语“木质纤维质”指包含木质素和纤维素两者的组合物。木质纤维 质材料也可包含半纤维素。

术语“纤维素的”指包含纤维素和包括半纤维素在内的附加组分的组 合物。

术语“糖化”指由多糖生产可发酵糖。

术语“经预处理的生物质”是指在糖化之前，已经经受过物理、化学 和/或热预处理，以提高该生物质中的多糖的可接近性的生物质。

“生物质”指任何纤维素的或木质纤维素的材料并包括包含纤维素的 材料，并且任选地还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖。生 物质也可包含附加组分诸如蛋白质和/或脂质。生物质可来源于单一来源， 或者生物质可包括来源于一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉 米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于生物 能作物、农业残余物、市政固体垃圾、工业固体垃圾、来自造纸业的淤 渣、庭院垃圾、木材和林业垃圾。生物质的例子包括但不限于玉米棒、作 物残余诸如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦秸秆、大麦秸秆、干草、稻秆、 柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆，得自谷物、树、枝、根、叶、木 屑、锯末、灌木及灌丛、蔬菜、水果、花和动物粪肥的研磨物的组分。

“生物质水解产物”指来源于生物质糖化的产物。生物质也可在糖化 前进行预处理或预加工。

术语“木糖代谢途径”或“木糖利用途径”是指将木糖代谢为果糖-6- 磷酸和/或甘油醛-6-磷酸的一系列酶(由基因编码)，并且包括1)木糖异 构酶，其催化木糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以 形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；以及4)转醛醇酶。

术语“木糖异构酶”是指催化D-木糖和D-木酮糖的互变的酶。木糖异 构酶(XI)属于被分类为EC 5.3.1.5的酶的组。

术语“E值”如生物信息学领域中所已知的，是“期望值”，其提供 了匹配将偶然地发生的概率。它提供了与序列的匹配的统计显著性。E值越 低，命中越显著。

术语“核糖-5-磷酸异构酶”或“RPI”是指催化核酮糖-5-磷酸和核糖- 5-磷酸的互变的酶。核糖-5-磷酸异构酶属于被分类为EC 5.3.1.6的酶的组。

术语“核酮糖-磷酸-3-表异构酶”或“RPE”是指催化D-核酮糖-5-磷 酸和D-5-磷酸木酮糖的互变的酶，并且被分类为EC 5.1.3.1。

术语“运动发酵单胞菌(Z.mobilis)RPI-A”是指本领域中已标记为RPI- A的运动发酵单胞菌(Z.mobilis)RPI。然而，运动发酵单胞菌(Z.mobilis) RPI蛋白质与大肠杆菌(E.coli)RPI-B蛋白质(36％)比与大肠杆菌(E.coli) RPI-A蛋白质(20％)具有更接近的序列同一性，并且在作为WO2012/006061 公布的共同拥有和共同未决的美国专利申请13/161734(其以引用的方式并 入本文)中描述的RPI的进一步分析将运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI置于 RPI-B组。然而，在本文中将运动发酵单胞菌(Z.mobilis)RPI称为RPI-A， 以与其公知名称相一致。

术语“pnp基因”是指编码多核苷酸磷酸化酶(也被称为多核糖核苷 酸核苷酸转移酶)的基因。该酶是双功能的，具有磷酸化的3’至5’核糖核 酸外切酶活性和3’末端寡核苷酸聚合酶活性。其参与mRNA加工和降解， 并且被分类为EC 2.7.7.8。

术语“天然氨基酸”是指在由内源性基因编码的肽序列上的位置存在 的氨基酸。

术语“非天然氨基酸”是指在不是由内源性基因编码的位置上的氨基 酸。

术语“N-末端氨基酸序列”是指始于多肽的N-末端的氨基酸序列。第 一个N-末端氨基酸被计为“1”。

术语“异源”指非天然存在于受关注的位置。例如异源基因指宿主生 物中非天然存在的但是通过转基因被导入到宿主生物中的基因。例如，存 在于嵌合基因中的异源核酸分子是与其他嵌合基因片段相关的非天然存在 核酸分子，诸如具有彼此非天然相关的编码区和启动子片段的核酸分子。

如本文所用，“分离的核酸分子”是RNA或DNA的聚合物，它是单 链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚 合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个 或多个片段构成。

当在合适的温度和溶液离子强度条件下单链形式的核酸片段可退火至 另一核酸片段时，核酸片段“可杂交”至另一核酸片段，诸如cDNA、基 因组DNA或RNA分子。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见 Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A  Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring  Harbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式 并入本文)中进行了例示。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。 可调节严格性条件以筛选中度相似的片段(诸如来自远缘生物的同源序 列)，到筛选高度相似的片段(诸如从近缘生物复制功能性酶的基因)。 杂交后的洗涤确定严格性条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开 始是6X SSC、0.5％ SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％ SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％ SDS在50℃下重复洗涤 两次，每次30分钟。更优选的一组严格性条件采用更高的温度，其中洗涤 与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％ SDS中洗涤30分 钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的高度严格性条件是最后两次洗涤 在65℃下用0.1X SSC，0.1％ SDS进行。例如，另一组严格性条件包括在 0.1X SSC、0.1％ SDS中在65℃下杂交并用2X SSC、0.1％ SDS洗涤，随后 用0.1X SSC、0.1％ SDS洗涤。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间 可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互 补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同 源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交 的相对稳定性(对应较高的Tm)按下列顺序依次降低：RNA：RNA、 DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获 得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较 短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的 长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个实 施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的 最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选长度 为至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针 长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

术语“互补的”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例 如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。

如本领域已知的，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之 间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较 确定。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列关联 的程度，根据具体情况，它由这些序列的序列串之间的匹配程度确定。 “同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包 括但不限于下列文献中所描述的那些：1.)Computational Molecular Biology  (Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2.)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY (1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和 Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)Sequence Analysis in  Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；以及5.) Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY (1991)。

设计确定同一性的优选方法来给出待测试序列之间的最佳匹配。确定 同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比 对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包 (LASERGENE bioinformatics computing suite(DNASTAR Inc.，Madison， WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法” 进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为Clustal V比对方法 的“Clustal V比对方法”，该方法描述于Higgins和Sharp，(CABIOS. 5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191 (1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包 (DNASTAR Inc.)中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对， 默认值对应于GAP PENALTY＝10并且GAP LENGTH PENALTY＝10。用 Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为 KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5并且DIAGONALS  SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5， WINDOW＝4，并且DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列 比对后，有可能通过观察相同程序中的“序列距离”表来获得“百分比同 一性”。此外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法对应于称为 Clustal W(在Higgins和Sharp，CABIOS；5：151-153(1989)；Higgins，D.G. 等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)中有所描述)和可以在 LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTAR Inc.)中的MegAlign^TMv6.1 程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAP PENALTY＝10、 GAP LENGTH PENALTY＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs) (％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵 (Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列，DNA权重矩阵(DNA Weight  Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序对序列进行比对之后，可通过查看 同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于从其它物 种中鉴定多肽，其中这类多肽具有相同或相似的功能或活性。有用的百分 比同一性的例子可包括但不限于：25％、30％、35％、40％、45％、50％、 55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或25％至 100％的任何整数百分比可用于描述本发明，诸如25％、26％、27％、 28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、 39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、 50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、 61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不但具有上述同源 性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选 至少150个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算 机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序 列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序套件(Wisconsin Package Version  9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP， BLASTN，BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410 (1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher (Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；以及5.)所述FASTA程序结合了 Smith-Waterman算法(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc. Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor， Plenum：New York，NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，使用序列 分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考程序的“默认值”，除非另 外指明。在此所用的“默认值”将指在首次初始化软件时软件最初加载的 任何值或参数集。

本文所用的标准的重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描 述于Sambrook，J.和Russell，D.，Molecular Cloning：A Laboratory  Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，NY(2001)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L. W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，Short  Protocols in Molecular Biology，第5版Current Protocols，John Wiley and  Sons，Inc.，N.Y.，2002。

本发明涉及利用木糖的细菌经工程化改造的细胞，具体地为在包含木 糖的培养基中发酵时具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属(Zymomonas)或 发酵杆菌属(Zymobacter)。通过在培养基中的生物催化剂进行发酵改善乙醇 生产的一个挑战是获得最佳的木糖利用率，所述培养基包含生物质水解产 物，其通常通过预处理或糖化生物质来生产。木糖是水解的木质纤维素生 物质中的主要戊糖之一，另一种是阿拉伯糖。申请人已发现，内源性pnp 基因的修饰，结合提高的核糖-5-磷酸异构酶的表达和在非限制性的木糖异 构酶活性的存在下，在利用木糖的细胞中导致提高的木糖利用效率，并从 而导致在包含木糖的培养基中发酵时更高的乙醇产量。

内源性pnp基因修饰

本发明涉及具有经修饰的内源性pnp基因的经工程化改造的利用木糖 的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)的细胞。内源性pnp 基因的编码区编码具有多核苷酸磷酸化酶活性的蛋白质。所编码的蛋白质 也被称为多核糖核苷酸核苷酸转移酶。内源性pnp基因的编码区的修饰在 本文中被发现改善了如下文所述附加地经工程化改造的发酵单胞菌属 (Zymomonas)细胞中的木糖利用率。

被鉴定为编码具有多核苷酸磷酸化酶或多核糖核苷酸核苷酸转移酶活 性的蛋白质的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)的任何 基因均可提供用于如本文所述的用于修饰的靶标内源性pnp基因。运动发 酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株ZM4的pnp编码区具有SEQ ID NO：1的 序列。来自发酵单胞菌属(Zymomonas)其他菌株的已知的内源性pnp编码区 具有与SEQ ID NO：1有99％(运动发酵单胞菌(Z.mobilis)NCIMB 11163； SEQ ID NO：3)、98％(运动发酵单胞菌(Z.mobilis)ATCC 10988；SEQ ID  NO：5)、和83％(运动发酵单胞菌pomaceae亚种(Z.mobilis pomaceae)ATCC  29192；SEQ ID NO：7)同一性的序列。任何这些序列，或与这些序列中的任 何一种具有至少约95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，并且被鉴定 为编码多核苷酸磷酸化酶或多核糖核苷酸核苷酸转移酶的任何序列，可被 用作如下文所述的修饰的靶标。使用BLAST分析或其本领域的技术人员所 熟知的其他序列比较分析，可鉴定另外的靶标内源性pnp基因序列。

在本发明的细胞中，pnp编码区被修饰，以缩短3′末端的编码区，导致 与天然地编码的蛋白质相比C-末端截短的蛋白质的表达。运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)的天然编码的多核苷酸磷酸化酶是约748个氨基酸的蛋 白质，其为任何的SEQ ID NO：2、4、6、8或与这些序列中的任何一种有至 少约95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，并被鉴定为多核苷酸磷酸 化酶或多核糖核苷酸核苷酸转移酶的任何序列。在一个实施例中，从经修 饰的pnp编码区表达的截短的蛋白质保留了由编码多核苷酸磷酸化酶的内 源性基因编码的N-末端氨基酸序列的至少约350个氨基酸，它们是天然的 N-末端氨基酸。截短的蛋白质保留了至少约350、360、370、380、390、 400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、 530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、 660、670、680、690、700、或710个天然的N-末端氨基酸。

在一个实施例中，对内源性pnp编码区的基因修饰添加了与截短的天 然编码区紧邻并且同阅读框的非天然的氨基酸的编码序列，使得产生融合 蛋白。例如，另外的介于约1和约20个之间的并非由内源性基因编码的氨 基酸的编码区可被添加为与截短的天然编码区紧邻并且同阅读框，产生了 在C-末端具有至多约20个非天然的氨基酸的融合蛋白。C-末端截短的蛋白 质如此是该融合蛋白的部分。在各种实施例中，在C-末端可以有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 或更多个非天然的氨基酸。融合蛋白的一些非限制性例子可产生自编码多 核苷酸磷酸化酶的内源性基因的基因修饰，包括下列蛋白质：1)保留709个 天然的N-末端氨基酸且包含14个附加的C-末端氨基酸(SEQ ID NO：9)；2) 保留695个天然的N-末端氨基酸且包含2个附加的C-末端氨基酸(SEQ ID  NO：10)；3)保留368个天然的N-末端氨基酸且包含10个附加的C-末端氨 基酸(SEQ ID NO：11)；和4)保留32个天然的N-末端氨基酸且包含17个附 加的C-末端氨基酸(SEQ ID NO：12)。

内源性pnp编码区可如上文所述通过本领域的技术人员已知的任何方 法被修饰。通常，编码区通过重组靶向DNA序列被靶向，所述序列是pnp 编码区的部分并且可包括周围紧邻的基因组DNA。重组靶向DNA序列通 过同源重组指导以它们为界的DNA序列插入至内源性pnp基因内。在一个 实施例中，所界定的DNA序列包括被设计为与天然的pnp编码区中的位置 同阅读框的至多约20个氨基酸的编码序列，如上文所述，然后通过同源重 组进行整合。作为另外一种选择，利用同源重组，可以用被设计为产生如 上文所述具有C-末端截短的蛋白质的编码区替换整个天然的pnp编码区。 此外，替换编码区可在蛋白质的C-末端编码附加的非天然的氨基酸，如上 文所述，导致产生融合蛋白。

经工程化改造的利用木糖的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)

在包含木糖代谢途径的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属 (Zymobacter)细胞中，内源性pnp基因被修饰，赋予了利用木糖以生产乙醇 的能力。棕榈发酵杆菌(Zymobacter palmae)是已通过表达用于利用木糖的基 因，如下文针对发酵单胞菌属(Zymomonas)所描述的，使用运动发酵单胞菌 (Z.mobilis)甘油醛-3-磷酸脱氢酶和烯醇酶启动子(Yanase等人Applied and  Environmental Microbiology(2007)73：2592-2599)，被工程化改造以利用木 糖的产乙醇细菌。

发酵单胞菌属(Zymomonas)的菌株，诸如运动发酵单胞菌(Z mobilis)， 已被工程化改造以将木糖发酵为乙醇。通常，四种基因被引入运动发酵单 胞菌(Z mobilis)，用于表达四种参与木糖代谢的酶，在细胞中形成木糖代谢 途径(图1中以粗体显示)，如美国专利5514583、美国专利5712133、美 国专利6566107、WO 95/28476、Feldmann等人((1992)Appl Microbiol  Biotechnol 38：354-361)、和Zhang等人((1995)Science 267：240-243)中所 述。这些基因包括编码木糖异构酶的基因，该酶催化木糖转化成木酮糖， 以及木酮糖激酶，该酶磷酸化木酮糖以形成5-磷酸木酮糖。另外还表达了 戊糖磷酸途径中的两种酶，转酮醇酶和转醛醇酶，它们将5-磷酸木酮糖转 化成联接戊糖代谢与Entner-Douderoff糖酵解途径的中间体，该途径使木糖 代谢成乙醇(参见图1)。编码这些酶的DNA序列可从能够代谢木糖的多 种微生物中的任何一种获得，诸如肠细菌和一些酵母以及真菌。编码区的 来源可包括黄单胞菌属(Xanthomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏 菌属(Escherichia)、红细菌属(Rhodobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、醋 杆菌属(Acetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、 农杆菌属(Agrobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属 (Pseudomonads)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。大肠杆菌(E.coli)的编码区通 常被使用。

内源性基因可提供木糖发酵途径的一部分，或者可以通过任何已知的 基因操纵技术进行改变以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代谢。例如，内 源转酮醇酶可在建立木糖代谢途径时补充其它导入的酶活性。

被另外地工程化改造以利用与木糖一样不是天然底物的其他糖类的发 酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)菌株，也可被用于本方 法中。经工程化改造以利用阿拉伯糖的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株的例 子描述于美国专利5843760中，该专利以引用方式并入本文。菌株可以以 其他附加的方式被修饰，以改善木糖利用率和乙醇的生产。

提高的RPI的表达

本发明的细胞另外还被工程化改造，以提高核糖-5-磷酸异构酶(RPI)活 性的表达。RPI催化核酮糖-5-磷酸和核糖-5-磷酸的互变(参见图1)。提 高的RPI的表达公开于作为WO2012/006061公布的共同拥有和共同未决的 美国专利申请13/161734(其以引用的方式并入本文)中，该专利申请公开 了提高的RPI的表达赋予了与减少的核酮糖的产生相关联的木糖利用效率 的提高。

提高的RPI的表达可使用在发酵单胞菌属(Zymomonas)中具有核糖-5- 磷酸异构酶活性的任何蛋白质或多肽实现，如作为WO2012006061公布的 美国专利申请USSN 13/161734中所公开的。具有核糖-5-磷酸异构酶活性的 多肽具有EC 5.3.1.6的酶学委员会(EC)分类。有两组核糖-5-磷酸异构酶， 它们被称为RPI-A和RPI-B。RPI-B酶属于糖-磷酸异构酶的 RpiB/LacA/LacB家族。大肠杆菌(E.coli)同时具有两种类型的RPI蛋白质。 运动发酵单胞菌(Z.mobilis)具有被注释为RPI-A的单种RPI蛋白质。然而该 运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI蛋白质与大肠杆菌(E.coli)RPI-B蛋白质 (36％)比与大肠杆菌(E.coli)RPI-A蛋白质(20％)具有更接近的序列同一性。 对作为WO2012/006061公布的美国专利申请13/161734中公开的RPI的进 一步分析将运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI置于了RPI-B组。

可用于本发明的细胞中的RPI蛋白质的序列是非常多样化的，例如运 动发酵单胞菌(Z.mobilis)和大肠杆菌(E.coli)RPI蛋白质(分别为SEQ ID  NO：14和16；编码区分别为SEQ ID NO：13和15)。可使用生物信息学分 析鉴定可用于本发明的微生物中的RPI蛋白质。利用基于剖面隐马尔可夫 模型(使用HMMER软件包的hmmsearch算法；Janelia Farm Research  Campus，Ashburn，VA)的结构/功能生物信息学分析的鉴定、活性位点残基鉴 定、和附加的标识氨基酸筛选描述于作为W02012/006061公布的美国专利 申请USSN 13/161734的实例8中。

满足这些标准和可用于本发明的微生物中的RPI-A和RPI-B蛋白质的 例子描述于作为US20120156746A1公布的美国专利申请USSN 13/161734 中，该文献以引用方式并入本文。可容易地在文献中和生物信息学数据库 中鉴定另外的RPI，如技术人员所熟知的并且如上文所述。使用生物信息学 方法鉴定蛋白质和/或编码序列通常通过BLAST(如上所述)搜索具有RPI 氨基酸序列或编码序列的公开可用的数据库进行，诸如本文提供的那些。 同一性基于Clustal W比对方法，所述方法采用GAP PENALTY＝10、GAP  LENGTH PENALTY＝0.1的默认参数和Gonnet 250系列的蛋白质权重矩 阵。

在本发明的细胞中，进行了使得核糖-5-磷酸异构酶活性与缺少所述基 因修饰的细胞中的核糖-5-磷酸异构酶活性相比提高的基因修饰。RPI活性 的提高的表达可通过表达编码在宿主细胞中有活性的具有核糖-5-磷酸异构 酶活性的蛋白质的分离的DNA分子而实现。具有核糖-5-磷酸异构酶活性的 有用的蛋白质属于EC 5.3.1.6的EC分类，并且包括上文所描述的核糖-5-磷 酸异构酶A和核糖-5-磷酸异构酶B蛋白质。

用于提高细胞中的酶的活性的任何方法可被用于提高RPI活性。此类 方法是本领域的技术人员所熟知的，并且包括提高编码基因的拷贝数和/或 由包含高表达启动子的基因表达。本发明的菌株可被工程化改造，用于提 高内源性RPI编码区的表达和/或引入的异源性RPI编码区的表达，以得到 提高的酶活性。此外，RPI活性可通过突变和筛选所表达的突变型基因以鉴 定具有提高的活性的细胞而被提高。

通常，RPI的提高的表达是通过用编码在嵌合基因或操纵子中可操作 地连接至启动子的RPI的DNA分子进行转化实现的。可使用的RPI的编码 序列包括编码上文所述的RPI-A和RPI-B蛋白质的任何序列。

当使用异源性编码区时，序列可经过密码子优化以在靶标宿主细胞中 最大化地表达，如本领域的技术人员所熟知的。如果天然的起始密码子是 GTG，其可以被改变为ATG以提高蛋白质表达。用于在细菌中表达基因的 方法是本领域中为人们所熟知的。基因在细菌中的表达通常需要可操作地 连接至所关注的编码区的启动子，和转录终止子。可使用的启动子是在发 酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属(Zymobacter)细胞中表达的启动子， 诸如运动发酵单胞菌(Z mobilis)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP启动子；P_gap)基 因、运动发酵单胞菌(Z mobilis)烯醇酶(ENO启动子；Peno)基因和密苏里 游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)木糖异构酶编码基因(GI启动子，Pgi) 的启动子。可使用的尤其高表达的启动子是具有导致高表达的突变的P_gap启动子，如美国专利7,998,722中所公开的，该专利以引用的方式并入本 文。

用于RPI表达的嵌合基因或操纵子通常被构建在或被转移至载体中， 用于进一步的操作。载体是本领域熟知的。某些载体能够在广泛的宿主细 菌中复制并可通过缀合进行转移。pRK404和三个相关的载体，pRK437、 pRK442、和pRK442(H)的完整的和带注释的序列是可用的。这些衍生物已 被证明是在革兰氏阴性菌中进行基因操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid  50(1)：74-79(2003))。

对于在发酵单胞菌属(Zymomonas)中的表达尤其有用的是在大肠杆菌(E. coli)和发酵单胞菌属(Zymomonas)中均能够复制的载体，例如描述于美国专 利5,514,583中的pZB188，该专利以引用的方式并入本文。载体可包括在 细胞中自主复制的质粒和携带构建体整合进细菌基因组的质粒。用于DNA 整合的质粒可包括转座子、与靶细菌基因组同源的核酸序列区或其它支持 整合的序列。其它类型的载体还可是转座体，其使用，例如，可从 商购获得的系统而产生。如何为所需靶宿主和所需功能选择 适当的载体是众所周知的。

通过用人们所熟知的方法(诸如使用冻-融转化、钙介导的转化、电穿 孔、或缀合)引入具有包含RPI编码区的嵌合基因的载体，可工程化改造 细菌细胞。任何将被工程化改造以通过提高RPI酶的表达改善木糖利用率 的细菌细胞均是用于转化以工程化改造如本文所述的菌株的靶标宿主细 胞。尤其适合的宿主细胞是发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆菌属 (Zymobacter)。所引入的嵌合基因可以在稳定复制的质粒上被维持在细胞 中，或者在引入之后被整合进基因组。

对于工程化改造的具有在细菌细胞基因组中整合的RPI嵌合基因或操 纵子的菌株，可使用本领域中为人们所熟知的方法，例如同源重组、转座 子插入、或转座体插入。在同源重组中，侧接靶整合位点的DNA序列位于 邻接奇放线菌素抗性基因或其他选择性标记、和RPI嵌合基因的位置，导 致所述选择性标记和所述RPI嵌合基因向靶基因组位点的插入。此外，选 择性标记可由位点特异性的重组位点限定，使得在表达对应的位点特异性 重组酶后，从基因组中切除抗性基因。

此外，内源性RPI表达基因的启动子可被更高地表达的启动子替代， 以提高细胞中的RPI活性。这可以通过使用如上文所述的载体和方法的同 源重组实现。

木糖异构酶活性

本发明的细胞具有非限制性的木糖异构酶活性水平。当对于如图1中 所显示的木糖利用和乙醇生产途径的功能而言，木糖异构酶(XI)活性在其不 是限速步骤时是非限制性的。当木糖异构酶活性的提高不改善木糖利用率 和乙醇的生产时，木糖异构酶活性是非限制性的。这种情况表明一个或多 个其他途径步骤是限制性的。如本文所发现的，使用本文的实例11中所述 的包括木糖、NADH、MgSO₄、三乙醇胺、和山梨醇脱氢酶的检测法测量 的ZW658细胞中的木糖异构酶活性是约0.25微摩尔产物/毫克蛋白质/分 钟。这种水平的木糖异构酶活性在ZW658菌株中是非限制性的，如本文的 实例3中所述。ZW658菌株是本文所使用的ZW801-4菌株的前体，如本文 的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株构建部分所描述的。在一个实施 例中，如使用本文的实例11中描述的检测法在无细胞提取物中所测量的， 非限制性的XI活性大于约0.25微摩尔产物/毫克蛋白质/分钟。非限制性XI 活性可以是大于约0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、或0.5微摩尔产物/毫克蛋 白质/分钟。

当XI活性在细胞中是限制性时，可通过提高XI酶的表达水平或引入 更高活性的XI酶的表达，将该细胞工程化改造为具有非限制性的XI活 性。提高表达水平可以是通过本领域的技术人员已知的任何方法，诸如提 高编码XI的基因的拷贝数或使用更高活性的启动子来表达XI酶。

例如，可使用与非突变型启动子相比具有提高的表达水平的突变型启 动子表达XI编码区。突变型高表达启动子的一个例子是US 7,989,206中所 公开的并在本文中称为超级GAP启动子(P_gapS)的运动发酵单胞菌(Z mobilis) 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子。

通过在多个拷贝中表达或从突变型高表达启动子表达可提供高活性的 木糖异构酶是任何的US 7,998,722中所描述的那些，该文献以引用方式并 入本文。如本文所公开的，木糖异构酶属于EC 5.3.1.5并且可使用剖面 HMM(上文针对RPI所描述的)鉴定，此外，四个催化部位的氨基酸被发 现是木糖异构酶特征性的。

作为另外一种选择或除此之外，高XI活性可通过表达在发酵单胞菌属 (Zymomonas)细胞中具有比通常使用的大肠杆菌(E.coli)XI更高的活性的XI 酶而获得。共同拥有和共同未决的美国专利申请公布US20110318801(该 文献以引用的方式并入本文)公开了按EC 5.3.1.5鉴定并且属于组I的木糖 异构酶具有比属于组II的大肠杆菌(E.coli)XI更高的活性。此外，可从突 变型高表达启动子表达组I XI，如上文所述，以在宿主细胞中获得高XI活 性。

如美国专利申请公布US20110318801所公开的组I木糖异构酶是指由 下列标准中的至少一种所限定的属于组I的木糖异构酶蛋白质：a)它落于包 括了使用如美国专利申请公布US20110318801的实例4中的分子系统发育 生物信息学分析制备的密苏里游动放线菌(A.missouriensis)XI的50％阈值序 列同一性分组之内；b)在使用从美国专利申请公布US20110318801的实例4 中的分子系统发育分析确定的组I和组II XI组的GroupSim分析鉴定的特 异性决定位置(SDP)，它基本上符合组I的氨基酸；和/或c)当使用如美国专 利申请公布US20110318801的实例4中所述制备的剖面隐马尔可夫模型查 询时，它具有1E-15或更小的E值。例如，来自密苏里游动放线菌 (Actinoplanes missouriensis)的XI(例如，SEQ ID NO：18)被鉴定为属于组I， 并且当在运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)细胞中表达时，它提供了比类 似地表达的大肠杆菌(E.coli)XI更高的活性。

XI的嵌合基因、载体、转化、整合、密码子优化、和表达如上文关于 RPI所描述的，并且是本领域的技术人员所熟知的。

提高的RPE的表达

在一个实施例中，本发明的细胞附加地被工程化改造以提高核酮糖-磷 酸-3-表异构酶(RPE)活性的表达。RPE催化D-核酮糖-5-磷酸和D-木酮糖-5- 磷酸的互变(参见图1)，并且被分类为EC 5.1.3.1。进行了使细胞中的 RPE活性与缺少该基因修饰的细胞中的RPE活性相比提高的至少一种基因 修饰。用于提高表达的修饰是如上文关于RPI所描述的，并且可使用具有 RPE活性的属于EC 5.1.3.1的任何酶。例如，可在细胞中表达运动发酵单胞 菌(Z.mobilis)RPE(SEQ ID NO：20；编码序列SEQ ID NO：19)的附加的拷 贝，或从高表达的启动子表达RPE编码区。

改善的利用木糖的菌株的发酵

本发明的工程化改造的利用木糖的发酵单胞菌属(Zymomonas)或发酵杆 菌属(Zymobacter)细胞可被用于发酵以生产乙醇。例如，描述了通过本发明 的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株生产乙醇。

针对乙醇的生产，使具有提高的RPI活性、非限制性的XI活性、和内 源性pnp基因修饰的利用木糖的重组运动发酵单胞菌(Z mobilis)与包含木糖 的培养基接触。木糖可以是唯一的糖，但通常培养基包含包括木糖和葡萄 糖在内的糖类的混合物。所述培养基也包含含有这些糖的生物质水解产 物，它们来源于经处理的纤维素或木质纤维素生物质。

当混合的糖的浓度高至足以抑制生长时，培养基包含山梨醇、甘露糖 醇、或它们的混合物，如共同拥有的US 7,629,156中所公开的。半乳糖醇 或核糖醇可代替或与山梨醇或甘露糖醇组合。运动发酵单胞菌(Z.mobilis)细 胞在培养基中生长，在培养基中发生发酵并且产生了乙醇。发酵在不补充 空气、氧气、或其它气体(这可包括诸如厌氧、微氧、或微需氧发酵的条 件)的情况下运行至少约24小时，并且可运行30小时或更长时间。达到 最大乙醇产量的时间是不确定的，取决于发酵条件。如果抑制剂存在于培 养基中，通常需要更长的发酵时间。发酵可在约30℃和约37℃之间的温 度、约4.5至约7.5的pH下进行。

可以在实验室用发酵罐中以及放大发酵中(在其中生产了商业规模量 的乙醇)，在包含含有木糖在内的混合糖培养基中培养本发明的运动发酵 单胞菌(Z mobilis)细胞。当需要商业生产乙醇时，可使用多种培养方法。例 如，从本发明的运动发酵单胞菌(Z mobilis)细胞进行的大规模生产可以通过 分批培养方法和连续培养方法两者进行。经典的分批培养方法是封闭系 统，其中培养基的组成在培养开始时设定并且在培养过程期间不进行人工 改变。因此，在培养过程开始时，用所需的生物接种培养基，并且不向系 统中添加任何物质可以发生生长或代谢活性。然而，通常来说，“分批” 培养是指相对于碳源的添加是分批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之 类的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成持续改变直至培养 结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数 期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳 定期中的细胞将最终死亡。在某些系统中对数期中的细胞通常负责最终产 物或中间产物的批量生成。在其他系统中可以获得稳定或指数后期生成。

标准的分批系统的变型是补料-分批系统。分批补料培养方法也适用于 本发明的运动发酵单胞菌(Z mobilis)细胞的培养，并且其包括典型的分批系 统，不同的是底物随着培养进行以递增方式添加。在代谢产物往往抑制细 胞的代谢用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统 是有用的。补料-分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并因此根据可 测量因素例如pH和废气如CO₂的分压的改变来评估。分批和分批补料培养 方法在本领域内是常用的且熟知的，并且例子可见于Biotechnology：A  Textbook of Industrial Microbiology，Crueger，Crueger和Brock，第二版 (1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA，或Deshpande， Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36，227，(1992)，其以引用方 式并入本文。

乙醇的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系 统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器里，并同时取出等量条件 培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长 期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连 续添加碳和营养物质，并且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物 或废弃物。细胞固定可使用宽泛的固体载体范围进行，所述固体载体由本 领域技术人员已知的天然材料和/或合成材料组成。

连续或半连续培养允许调节影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素 或任何数目的因素。例如，一种方法将维持限制性营养物质诸如碳源或氮 水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的 许多因素能够连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连 续系统努力维持稳态生长条件，且因此由于培养基取出的细胞损耗必须针 对培养基中的细胞生长速率进行平衡。对于连续培养过程调节营养物质和 生长因子的方法以及用于使产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领 域熟知的，并且各种方法由上面Brock详述。

尤其适用于乙醇生产的发酵方法如下所述。期望的本发明的运动发酵 单胞菌(Z mobilis)细胞在摇瓶中于半复合培养基中生长，培养温度为约30℃ 至约37℃，在轨道式震荡器中以约150rpm的转速振荡培养，然后将其转移 到包含相似培养基的10L种子发酵罐中。种子培养物在种子发酵罐中厌氧 生长直至OD₆₀₀介于3和6之间，然后将其转移到生产发酵罐中，其中的发 酵参数经最优化用于乙醇生产。从种子罐转移到生产罐的典型种菌体积在 约2％至约20％v/v的范围内。典型的发酵培养基包含基本培养基组分诸如 磷酸钾(1.0-10.0g/l)、硫酸铵(0-2.0g/l)、硫酸镁(0-5.0g/l)、复合 氮源诸如酵母提取物或大豆基产物(0-10g/l)。培养基中存在终浓度约 5mM的山梨醇或甘露糖醇。包含木糖和至少一种附加糖诸如葡萄糖(或蔗 糖)的混合糖提供碳源，当初始批次碳源(50-200g/l)耗尽时将混合糖持续加 入发酵罐中以最大化乙醇比率和滴度。碳源进料速率进行动态调节以确保 培养物不过度积聚葡萄糖，过多的葡萄糖会导致积累毒性副产物诸如乙酸 盐。为了最大化从利用的底物中生产的乙醇产量，通过磷酸盐的量来限制 生物质增长，磷酸盐是初始时成批加入的或在发酵期间加入的。使用苛性 碱溶液(诸如氢氧化铵、氢氧化钾、或氢氧化钠)和硫酸或磷酸将发酵控制 在pH5.0-6.0。将所述发酵罐的温度控制在30℃-35℃。为使发泡最小 化，根据需要向所述容器内加入消泡剂(任何类别-基于硅氧烷的、基于有 机物的，等等)。可任选地使用抗生素(菌株中有该抗生素的抗性标记)诸如 卡那霉素以最小化污染。

上述任何条件组和这些条件中在本领域为人们所熟知的附加变化是通 过利用木糖的重组发酵单胞菌属(Zymomonas)细胞产生乙醇的合适条件。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管 说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上文的讨论 和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的特性，并且在不脱离 其实质和范围的情况下，能对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用 途和条件。

一般方法

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在 如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis， T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor  Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文称为“Maniatis”)； 和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experimentswith Gene  Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)； 以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene  Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版，Hoboken，NJ(1987)。

缩写的含义如下：“kb”是指千碱基，“bp”是指碱基对，“nt”是 指核苷酸，“hr”是指小时，“min”是指分钟，“sec”是指秒，“d”是 指天，“L”是指升，“ml”是指毫升，“μL”是指微升，“μg”是指微 克，“ng”是指纳克，“mM”是指毫摩尔每升，“μM”是指微摩尔每 升，“nm”是指纳米，“μmol”是指微摩尔，“pmol”是指皮摩尔， “Cm”是指氯霉素，“Cm^r”或“Cm-R“是指氯霉素抗性，“Cm^s“是指 氯霉素敏感，“Spec^r“或“Spec-R”是指奇放线菌素抗性，“Sp^s“是指奇 放线菌素敏感，“XI”是指木糖异构酶，“XK”是指木酮糖激酶， “TAL”是指转醛醇酶，“TKT”是指转酮醇酶，“OD600”是指在 600nm的波长测量的光密度，“PCR”是指聚合酶链式反应，“kDa”是指 千道尔顿，“g”是指引力常数，“bp”是指碱基对，“kbp”是指千碱基 对，“HPLC”是指高效液相色谱，“GC”是指气相色谱，“RM”是指包 含10g/L酵母提取物加上2g/L KH₂PO₄的丰富培养基，“MM”是指包含 10g/L醣母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L(NH₄)₂SO₄和0.2g/L KH₂PO₄的接 合培养基。

运动发酵单胞菌(Z mobilis)的转化

采用电穿孔将复制的和非复制的质粒DNA引入了运动发酵单胞菌(Z  mobilis)，基本上如US 5,514,583中所述，该文献以引用方式并入本文。简 而言之，50μL的转化反应包含在10％(v/v)甘油中的～10¹⁰个细胞/mL和 ～0.5-2.0μg的从大肠杆菌(E.coli)SCS110分离的未甲基化质粒DNA。对照 反应进行相同处理，但是不接受任何质粒DNA。电穿孔仪的设置是 16kv/cm、200Ω、和25μF，电击杯的间隙宽度是0.1cm。电穿孔之后，用 MMG培养基(50g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、5g/L胰蛋白胨、2.5g/L (NH₄)₂SO₄、0.2g/L K₂HPO₄、和1mM MgSO₄)稀释了转化反应，并使细胞在 30℃恢复，然后将它们铺板在如所指示的有或没有抗生素的包含1.5％琼脂 的MMG培养基(MMG琼脂平板)上。在厌氧腔室中于30℃孵育平板，直到 菌落出现。更多的细节描述在下文的实例中。

摇瓶实验

除非另外指明，下文描述的全部实验均于30℃在摇瓶(15-ml松弛地盖 着的圆锥形试管)中进行，使用包含葡萄糖或木糖作为唯一碳源的合成培 养基。mRM3-G10培养基包含10g/L酵母提取物、2g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄(7H₂O)和100g/L葡萄糖。mRM3-X10培养基除包含100g/L木糖而 不是葡萄糖之外是相同的。通过跟踪在600nm的光密度作为时间的函数的 变化，以分光光度法监测了细胞的生长。在正文中和配图说明中，“OD” 或“OD600”是指在600nm的光密度。在摇瓶生长研究过程中的所指示的 时间，取出培养物的1.0-ml等分试样用于使用配备了折光率检测器的 Agilent 1100(Hewlett-Packard，Palo Alto，CA)的HPLC分析，以测定发酵液 体培养基中存在的葡萄糖、木糖、核酮糖、和乙醇的浓度。在HPLC分析 之前，离心除去细胞并通过0.22μm的乙酸纤维素Spin-X离心管过滤器 (Costar，产品目录号8160)过滤上清液以除去小颗粒。在Aminex HPX- 87H柱(Bio-Rad)上分离化合物，该柱子在55℃下运行，在等度条件下使用 0.6mL/min的流速并使用0.01N H₂SO₄作为流动相。使用已知浓度的可靠标 准品定量所关注的峰值，全部结果用g/l表示。

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)菌株的构建

从野生型亲本菌株ZW1开始，构建利用木糖的重组菌株ZW801-4的 详细描述，提供在US 7,741,119中(该文献以引用方式并入本文)。菌株 ZW801-4来源于菌株ZW800，后者来源于菌株ZW658，全部如US  7,741,084中所述，该文献以引用方式并入本文。ZW658是通过将包含编码 木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转醛醇酶(tal)、和转酮醇酶(tkt)的四 种利用木糖的基因的P_gapxylAB和P_gaptaltkt两个操纵子，与来自大肠杆菌(E. coli)基因的编码区一起，通过顺序转座事件整合进ZW1(菌株ZM4的重命 名；ATCC 31821)的基因组以产生菌株X13L3(其被重命名为ZW641)， 然后在包含木糖的选择性培养基上进行适应构建的。ZW641在包含木糖的 生长培养基上的进一步适应产生了ZW658，其在木糖中生长得好得多，并 根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏为ATCC PTA-7858。如在共同拥有 的US 7,989,206(该文献以引用方式并入本文)中所公开的，由于在表达 xylA编码区的启动子(P_gap)中的一个点突变，ZW658具有高得多的木糖异构 酶活性。与ZW641中天然的P_gap(641GAP启动子)相比，该启动子(SEQ  ID NO：21)，本文中称为801GAP启动子或超级GAP启动子或P_gapS，在 SEQ ID NO：21的位点116具有“T”而不是“G”。P_gapS具有的表达强度是 运动发酵单胞菌(Z mobilis)中的P_gap的3至4倍。

在ZW658中，使用宿主介导的双交换同源重组和作为选择性标记的奇 放线菌素抗性使编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的基因插入失活以产生菌株 ZW800。使用Cre重组酶，通过位点特异性重组移除以loxP位点为边界的 奇放线菌素抗性标记以产生菌株ZW801-4。

用于酶分析法的发酵单胞菌属(Zymomonas)无细胞提取物的生产

细胞在50ml的RM+2％葡萄糖中于30℃过夜生长至OD₆₀₀为1.0- 1.2。通过在4℃以4500rpm离心10分钟收获细胞。弃去上清液，用25ml 冰冷的超声缓冲液(10mM Tris、pH 7.6、10mM MgCl₂)洗涤细胞沉淀物，然 后以4500rpm离心10分钟。沉淀物被重悬在2.0-2.5ml超声缓冲液加1mM 二硫苏糖醇中。在eppendorf离心机中于4℃离心500μL的等分试样1分 钟。弃去大多数上清液，留下约10-20μL以避免沉淀物变干。冷冻细胞并 保存在约80℃直到进行测定。测定前，解冻细胞并重悬在500μL超声缓冲 液加1mM二硫苏糖醇中。使用Branson超声仪450，以62％的占空比和2 的输出控制，超声处理混合物45秒2次，在超声处理之间使样品冷却约3- 5分钟。在Beckman离心机中于4℃以14,000rpm离心样品60分钟。将上 清液转移至新管并保存在4℃。Pierce BCA测定被用于测定蛋白质浓度。

实例1

pMODlinker-Spec-GapRPi的构建

pMODLinker-Spec-GapRpi(图2)是能够被用于产生包含运动发酵单胞 菌(Z mobilis)RPI表达盒和lox侧接的Spec抗性盒的转座子的质粒。使用质 粒pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL作为模板，通过PCR生成了运动发 酵单胞菌(Z mobilis)RPI表达盒。后一质粒描述于US 7,989,206中，该文献 以引用方式并入本文。其包含运动发酵单胞菌(Z mobilis)核糖-5-磷酸异构酶 (RPI)的表达盒，该表达盒(从5’至3’)由全长641GAP启动子序列、运动 发酵单胞菌(Z mobilis)RPI基因的完整开放阅读框(SEQ ID NO：13)、和存在 于大肠杆菌(E.coli)XylA/B操纵子的基因间隔区的XylA茎-环区域组成。 上文所述的完整的RPI表达构建体(SEQ ID NO：22)位于质粒 pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL的唯一的NcoI和NotI位点之间。

将包含该表达盒的PCR生成的DNA片段插入pMOD-Linker-Spec(其 也描述于US 7,989,206中)。pMOD-Linker-Spec来源于可商购获得的载体 pMOD^TM-2<MCS>Transposon Construction Vector(目录号，MOD0602； Biotechnologies，Madison，WI)。用唯一的AsiSi、FseI和SbfI 的限制性位点替代初始的多克隆位点。赋予对奇放线菌素的抗性(Spec^r)并 且在两端均具有野生型loxP位点的DNA片段被插入至AsiSI和FseI位点之 间，产生了pMOD-Linker-Spec。

用SbfI和FseI顺序消化了pMOD-Linker-Spec，从1％琼脂糖凝胶上纯 化了3.6kb的大载体片段。然后，使用引物PPI-F(SEQ ID NO：23)和引物 PPI-R-SbfI(SEQ ID NO：24)，从质粒pZB188aadA/Gap/Zymo RPI/EcoliSL  PCR扩增了运动发酵单胞菌(Z.molilis)RPI嵌合基因连同其相关联的 641GAP启动子和大肠杆菌(E.coli)Xyl A终止子。同样用FseI和SbfI切割 了所得到的0.96kbp PCR产物，然后将纯化的DNA片段连接至经FseI/SbfI 消化的pMOD-Linker-Spec载体片段，以产生pMODlinker-Spec-GapRpi，如 图2所示。

实例2

RPI在ZW801-4中的过表达：I菌株的生成和表征

将从pMODlinker-Spec-GapRpi(实例1)生成的转座子引入菌株 ZW801-4(参见“一般方法”)以提高RPI的表达。在转变为转座体之后随 机地整合进DNA的该质粒中的转座因子，是在载体中位于两个嵌合末端 (ME)之间的完整的DNA片段，其包括了运动发酵单胞菌(Z mobilis)RPI表 达盒和Spec^r盒。使用EZ::TN^TMpMOD^TM-2<MCS>Transposon Construction  Vector(目录号MOD0602)的说明书中概述的一般规程，基 本上如US 7,989,206中所述在体外生成了转座体。将所得到的转化体电穿 孔至ZW801-4细胞中，转化体在包含奇放线菌素(200μg/ml)的MMG和 MMX(具有50g/L木糖而不是50g/L葡萄糖的相同的培养基)琼脂平板上恢 复。由于转座因子随机地插入DNA中，其能够导致有害的基因分裂事件和 /或改变整合的RPI基因表达水平的位置效应，进行预实验来确定哪些转化 体对于继续进行是最好的。因此，筛选了来自mRM3-G10/Spec平板的30 个菌落和来自mRM3-X10/Spec平板的6个，用于使用mRM3-X10作为测 试培养基的摇瓶中的生长实验(参见“一般方法”)，选择了生长至最高 的最终OD值的三个菌株(菌株B9、B11和I)用于进一步表征。从 MMG/Spec平板上回收了菌株B9和B11，从MMX/Spec平板上回收了I菌 株。

在作为US20120156746A1公布的共同拥有和共同未决的美国专利申请 USSN 13/161734中(该文献以引用方式并入本文)，RPI被公开为是 ZW801-4中木糖代谢的限速酶，而在用mRM3-X10进行的摇瓶实验中，从 多拷贝的质粒表达RPI在该菌株中导致了更好的生长和更快的木糖利用。 尽管细胞有附加的RPI时生长至更高的最终OD值，指数生长速率只有很 少的或没有变化。RPI在ZW801-4中的质粒过表达还降低了所产生的核酮 糖的量，而这导致了从木糖生产乙醇的更高的代谢产率。

如图3所示，对于具有随机整合至ZW801-4基因组中的单个拷贝的 RPI表达转座子的测试菌株，获得了相似的结果。使B9、B11、和I菌株的 种子培养物连同ZW801-4对照在mRM3-X10中生长，并用于在摇瓶中接种 mRM3-X10至每一培养物～0.1的初始OD600值。培养物在30℃生长，并通 过OD600针对生长、以及如“一般方法”中所述针对木糖、核酮糖、和乙 醇，随时间进行了测定。如图3A所示，包含RPI表达转座子的这三个菌株 生长至比亲本菌株ZW801-4高几乎50％的OD。如图3B所示，与对照菌株 相比，它们还以快得多的速率消耗了木糖并产生了更少的核酮糖：在54小 时时间点，就B9、B11和I菌株而言，几乎全部的木糖均用完了，而亲本 菌株ZW801-4仅使用了～75％的木糖。在71小时时间点，就ZW801-4而言 仍然有～8g/L残余的木糖。尽管它们消耗了更多的木糖，具有RPI表达转座 子的这三个菌株还产生了比ZW801-4更少的核酮糖；在72小时时间点，生 长培养基中最终的核酮糖浓度就ZW801-4而言是5.3g/L，相对地，就其他 三种菌株而言是3.2-3.6g/L。

在30℃使相同的4种菌株生长在mRM3-G10中，并通过OD600针对 生长随时间进行了测定(图3C)。与用木糖获得的结果相比，当在葡萄糖 上生长时，全部四种菌株显示出相似的生长速率，在8小时达到约1的 OD600，在20小时达到5.2-5.5。该结果表明，RPI过表达在用B9、B11 和I菌株的木糖摇瓶实验中对生长的刺激效应是碳源依赖性的。

实例3

大肠杆菌(E.coli)木糖异构酶在B9、B11和I菌株中的过表达

尽管B9、B11和I菌株在上文描述的使用葡萄糖和木糖的摇瓶实验中 表现非常相似，后续的实验显示出I菌株和同样具有RPI表达转座子的整合 的拷贝的其他两种菌株之间的重要差异。这种差异是通过评估木糖异构酶 在这3种菌株中较高的表达是否将导致通过工程化改造的木糖途径的碳通 量速率进一步升高发现的。

木糖异构酶是菌株ZW641中木糖代谢的限速酶，在菌株ZW658中， 通过驱动大肠杆菌(E.coli)XylA/B操纵子的P_gap启动子中的点突变(这导致 了木糖异构酶提高的表达)克服了这点(参见“一般方法”中菌株的构 建)。如在作为US20120156746A1公布的共同拥有和共同未决的美国专利 申请USSN 13/161734中所公开的，后续的实验确定了在ZW658和ZW801- 4(具有葡萄糖-果糖氧化还原酶基因失活的ZW658衍生物)中木糖代谢的 新的限速步骤均是RPI。

基于这些观察结果，期望确定RPI瓶颈的消除(如在B9、B11和I菌 株中通过提高RPI的表达所提供的)是否将允许更高水平的木糖异构酶表 达，以导致通过木糖途径的碳通量速率的进一步提高。为了测试该假说， 我们使用了从质粒pMODlinker-Cm-801GapXylA生成的转座子。除了该质 粒在两个lox位点之间具有Cm抗性盒而不是Spec抗性盒之外，它与US  7,989,206中描述的pMOD-Linker-Spec-801GapXylA是相同的。pMOD- Linker-Spec-801GapXylA是具有从ZW801-4获得的增加的DNA片段的 pMOD-Linker-Spec，其包含Pgap、XylA编码区、以及XylA与XylB开放 阅读框之间的茎-环区域。因此，驱动XylA的启动子是801gap启动子(SEQ  ID NO：21)，其在位点116具有使其更具活性的G至T点突变，并且是在 ZW658中驱动大肠杆菌(E.coli)XylA/B操纵子的相同的突变型启动子。

除Cm抗性盒之外，从pMODlinker-Cm-801GapXylA生成的转座子(下 文称为“801GapXylA-Cm转座子”)还包含由801GAP启动子、大肠杆菌(E. coli)XylA开放阅读框和紧随终止密码子的稳定性XylA茎-环区域组成的上 述木糖异构酶表达盒，如US 7,989,206中所详述的。801GapXylA-Cm转座 子如实例2中所述被转变为转座体，而后者被电穿孔至I菌株中。在包含氯 霉素(120μg/ml)的MMG琼脂平板上选择转化体。

在初步研究中，针对在摇瓶实验中于30℃在mRM3-X10中的生长(在 其中周期性地测量了OD600)，测试了从用801GapXylA-Cm转座子进行的 转化反应回收的十个随机选择的Cm^r菌落。尽管全部十个菌株在木糖中均 比亲本菌株生长更好(基于初始的生长速率和最终的OD值)，仅选择了 它们中的七个用于进一步表征：I(cm1)、I(cm2)、I(cm3)、I(cm4)、I(cm5)、 I(cm8)和I(cm9)。为了更详细地检测这些菌株，使用在mRM3-X10中生长 的种子培养物重复了摇瓶实验，并包括了ZW801-4和I菌株作为对照。在 所有情况下初始的OD均是0.075，并且两种对照菌株一式二份地进行。

与之前的实验相符，具有较高表达水平的RPI的I菌株在木糖中比 ZW801-4生长好得多，如图4A所示。注意，一式两份的I菌株的生长曲线 是重叠的并且不能被区分。核酮糖在生长培养基中的最终浓度在56小时时 间点就I菌株而言是比就ZW801-4而言更低的：1.8和1.9g/L对3.4和 4.2g/L。木糖异构酶在I菌株中的过表达极大地改善了在木糖上的生长。包 含801GapXylA-Cm转座子的全部七种菌株比ZW801-4和I菌株生长快得 多，并且尽管它们具有不同的转座子插入位点，它们的生长曲线事实上是 相同的。通过对I(cm1)-I(cm6)的插入位点的DNA测序实际确认了这点。由 于运动发酵单胞菌(Z.mobilis)极其低的转化频率和所使用的方 法，尽管对其他四种菌株没有确定转座子插入位点，它们很可能也是在不 同的基因组位置。

木糖异构酶活性在I菌株中的提高的表达同样提高了指数生长速率， 并且这导致了生物质的更快的积累和更快的木糖利用。包含801GapXylA- Cm转座子的七种菌株的核酮糖终点值在2.9-3.7g/L范围。尽管这些值与 ZW801-4产生的核酮糖的量是相似的，以所使用的每份糖计它们实际上是 更小的，因为在56小时时间点，过表达木糖异构酶的菌株已消耗了培养基 中全部的木糖，而ZW801-4利用了小于80％。

这些结果清楚地表明，木糖异构酶是I菌株中木糖代谢的限速酶。它 们还显示出I菌株具有足够的RPI酶活性来支持高得多的木糖异构酶表达水 平。在染色体上的不同位置包含801GapXylA-Cm转座子的全部七种I菌株 衍生物以相同的动力学在包含木糖的培养基中生长这一事实，有力地表明 由转座子导致的基因分裂事件和/或位置效应并未显著地有助于所观察到的 表型(即，在木糖中更好的生长)。这一结论还受到了图4B所示的实验的 支持，在其中包含所述转座子的七个菌株在用mRM3-G10于30℃进行的摇 瓶实验中全部生长得和ZW801-4与I菌株一样好。

使用pH受控的条件确认了上述观察结果如下。在摇瓶实验过程中， 生长培养基的pH能够下降超过1个pH单位，并且这对运动发酵单胞菌(Z  mobilis)的生长具有抑制作用，尤其是当木糖是唯一碳源时。为了避免这一 问题，进行了图5中所示的pH受控的生物反应器实验。由于过表达木糖异 构酶的全部I菌株衍生物在摇瓶中表现相同，仅使用了它们中的两个用于该 实验，I(cm1)和I(Cm9)。使种子培养物在摇瓶中于30℃在mRM3-X10生长 至OD为～0.5，生物反应器中的起始OD是0.035。生物反应器同样包含 mRM3-X10，温度和pH被分别稳定维持在30℃和5.8，使用2N KOH进行 pH控制。

I菌株和ZW801-4在pH受控条件下的生长曲线是非常相似的(图 5)，尽管明显1菌株在接近实验结束时的确生长得略微更好。然而，有趣 的是，两种菌株在这些条件下均没有产生很多核酮糖；就ZW801-4和I菌 株而言的终点值分别是1.92和1.16g/L。这些观察结果表明，当生长的pH 被维持在5.8时，RPI对于ZW801-4中的木糖代谢并不是很大的瓶颈。它们 还表明，在此类条件下，ZW801-4中天然的RPI基因几乎能够跟得上现有 的木糖异构酶活性水平。然而，从图5所示的生长曲线来看显然的是，甚 至当生长培养基的pH被稳定维持在pH5.8时，在I菌株中过表达木糖异构 酶极大地改善了木糖代谢。

使用与用于I菌株的相同的方法，将801GapXylA-Cm转座子也电穿孔 进B9和B11菌株，针对在于30℃使用mRM3-X10的摇瓶实验中在木糖中 的生长，测试了这些菌株中每一种的十个初级转化体(图6)。尽管一些转 化体的确在木糖中比亲本菌株生长更好，两种菌株的结果都远不像用I菌株 获得的那些那样显著。在不同的转化体之间还具有高的变异度，表明基因 分裂事件和/或插入的位置效应对所观察到的表型有所贡献。这些观察结果 表明，除提高的RPI表达水平之外，在I菌株中可能还存在有利于木糖生长 和代谢的与RPI表达转座子的染色体位置有关的重要因素。

通过DNA测序将RPI表达转座子在I菌株中的插入位点确定为在运动 发酵单胞菌(Z mobilis)基因组(GenBank登录号AE008692)的核苷酸 543506和543507之间。插入区域的测序显示，转座子的整合导致了编码多 核糖核苷酸核苷酸转移酶的pnp基因的开放阅读框3’端的移框。野生型pnp 基因产物和I菌株的预测的pnp基因产物的比对显示在图7中。注意，突变 型蛋白质缺失了天然蛋白质的最后39个氨基酸残基(保留了从N端起的 709个氨基酸)并且在其C末端具有14个新的氨基酸(SEQ ID NO：9)。并不 知道该假定蛋白是否是功能性的，以及如果它是，也不知道在RPI的过表 达之外可能以何种程度有助于I菌株的表型。无论答案如何，上述结果表 明，在与I菌株中相同的位置，在pnp编码区中，过表达RPI导致了在木糖 中更好的生长，并且使得木糖异构酶的更高表达水平能够是有效的。

实例4

用于使用靶向整合构建利用木糖的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株的载体构建体

通过将嵌合的xylA、xylB、tal、和tkt基因引入ZW1菌株，构建了新 的利用木糖的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株。xylB、tal、和tkt编码区是 来自如在“一般方法”中描述的ZW658菌株中的大肠杆菌(E.coli)基因。 xylA编码区是来自密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis) (AMxylA)，其公开于共同拥有和共同未决的美国专利申请公布 US20110318801中(该文献以引用方式并入本文)，编码具有比运动发酵 单胞菌(Z mobilis)中的大肠杆菌(E.coli)木糖异构酶更高的活性的酶。 AMxylA的编码区是针对在运动发酵单胞菌(Z mobilis)中的表达经密码子优 化的(SEQ ID NO：17)。还引入了运动发酵单胞菌(Z.mobilis)rpi和rpe基因的 附加的拷贝，以提高核糖-5-磷酸异构酶(RPI)和核酮糖-磷酸-3-表异构酶 (RPE)活性。设计了双交换(DCO)转化载体，以特异性地将嵌合基因整合进 运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中的靶标区域。

使用了标准的分子重组方法构建DCO(双交换)自杀整合载体。为了 在运动发酵单胞菌(Z mobilis)中表达木糖异构酶和木酮糖激酶，构建了 10,250-bp DCO自杀载体pZX21(SEQ ID NO：25；图8A)。该载体具有 pBluescript主链，其包含针对大肠杆菌(E.coli)的复制起点但没有运动发酵 单胞菌(Z mobilis)复制起点，因此它不能在运动发酵单胞菌(Z mobilis)中增 殖，使得它是自杀载体。它包含来自编码葡萄糖-果糖氧化还原酶的运动发 酵单胞菌(Z mobilis)基因的DNA序列，GFO-L和GFO-R，侧接待整合的序 列。两种片段均是使用运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA作为模板， 通过PCR合成的。1,186-bp GFO-L片段(SEQ ID NO：26)包括gfor编码序列 (SEQ ID NO：27)的前654bp(从nt-1至nt-653)和533bp的上游基因组序列。 1,446-bp GFO-R片段(SEQ ID NO：28)包括GFOR编码序列的后480bp(从nt- 823至nt-1302)和966bp的下游基因组序列。GFO-L和GFO-R指导向gfor 基因座中的整合，替换了运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中gfor编码序列 的片段(从nt-655至nt-822)。这破坏了葡萄糖-果糖氧化还原酶的表达，这 降低了木糖醇的生产且提高了乙醇的生产，如US 7,741,119中所公开的， 该文献以引用方式并入本文。

pZX21中介于GFO-L和GFO-R之间的区域包括三个嵌合基因。一个 是1,661-bp嵌合的xylA基因(SEQ ID NO：29)，包含304-bp运动发醣单胞菌 (Z.mobilis)超级GAP启动子(P_gapS；描述于US 7,989,206中)、1,185-bp密苏 里游动放线菌(A.missouriensis)xylA编码序列(AMxylA)和具有5’XbaI位点 的166-bp大肠杆菌(E.coli)araD 3’UTR(ECaraD 3’UTR)。AMxylA编码区 是针对在运动发酵单胞菌(Z mobilis)中的表达，按照运动发酵单胞菌(Z  mobilis)ZM4的密码子偏好性经优化的(SEQ ID NO：17)。ECaraD 3’UTR来 自大肠杆菌(E.coli)araBAD操纵子。第二个基因是1,960-bp嵌合的xylB基 因(SEQ ID NO：30)，包含191bp P_eno、1,455-bp大肠杆菌(E.coli)xylB编码序 列(ECxylB)和314-bp大肠杆菌(E.coli)xylB 3’UTR(ECxylB3’UTR)。P_eno是 来自运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA的强组成型启动子，具有P_gap大约28％的活性。第三个基因是由lox位点界定的1,014bp aadA标记(用于 奇放线菌素抗性；Spec-R)(SEQ ID NO：31)。该标记能够通过表达Cre重组 酶在整合之后被移除。

为了在运动发酵单胞菌(Z mobilis)中表达转醛醇酶、转酮醇酶、核糖-5- P-异构酶、和D-核酮糖-P-3-表异构酶，构建了12,198-bp DCO穿梭载体 pZX52(SEQ ID NO：32；图8B)。该载体是基于载体pZB188(Zhang等人 (1995)Science 267：240-243；US 5,514,583)的发酵单胞菌属-大肠杆菌穿梭载 体，其包含含有使得该载体能够在发酵单胞菌属(Zymomonas)细胞中复制的 复制起点和909-bp大肠杆菌(E.coli)复制起点(Ori)的2,582bp运动发酵单胞 菌(Z.mobilis)基因组DNA片段。其具有用于选择大肠杆菌(E.coli)或运动发 酵单胞菌(Z mobilis)转化体的911bp氯霉素抗性标记(Cm-R)。pZX52包含来 自编码乳酸脱氢酶的运动发酵单胞菌(Z mobilis)ldhA基因的DNA序列， LDH-L(875bp；SEQ ID NO：33)和LDH-R(1,149bp；SEQ ID NO：34)，侧接待 整合的序列。这些序列指导在运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中在核苷酸 493和494之间向ldhA编码序列(SEQ ID NO：35)中的整合，从而破坏了乳 酸脱氢酶的表达。

pZX52中介于LDH-L和LDH-R之间的区域包括两个嵌合的操纵子。 第一个是3,339bp P_gapT-Tal-Tkt操纵子(SEQ ID NO：36)，包含运动发酵单胞 菌(Z mobilis)GAP启动子的304-bp T突变体(P_gapT)、954-bp大肠杆菌(E.coli) Tal编码区(ECTal)、1,992-bp大肠杆菌(E.coli)Tkt编码区、和68-bp大肠杆 菌(E.coli)Tkt 3’UTR(ECTkt 3’UTR)。除了P_gapT启动子(SEQ ID NO：37)之 外，该操纵子是与天然存在的大肠杆菌(E.coli)Tal-Tkt操纵子相同的，P_gapT启动子是在SEQ ID NO：21中的位点83具有“G”至“A”的变化和在位点 285的“T”缺失的P_gap。另一嵌合的操纵子是1,443bp P_eno-Rpi-Rpe操纵子 (SEQ ID NO：38)，包含191bp P_eno、第一密码子变为ATG的471bp运动发酵 单胞菌(Z.mobilis)Rpi编码序列(SEQ ID NO：65)(ZMRpi)、663bp运动发酵 单胞菌(Z.mobilis)Rpe编码序列(ZMRpe)、和35bp大肠杆菌(E.coli)xylA 3’UTR(ECxylA 3’UTR)。

构建了另一个命名为pZX6的穿梭载体(SEQ ID NO：39；图8C)。这 种12,704bp的载体是用来自编码多核苷酸磷酸化酶的运动发酵单胞菌(Z mobilis)pnp基因的序列替换了LDH-L和LDH-R序列的pZX52的修改形 式。1,318bp PNP-L片段(SEQ ID NO：40)是pnp编码序列(SEQ ID NO：1)从 nt-767至nt-2,084的片段，而1,225bp PNP-R片段(SEQ ID NO：41)包括pnp 编码序列的最后59bp(从nt-2189至nt-2247)和1,166bp的下游基因组序列。 因此，pZX6能够指导P_gapT-Tal-Tkt操纵子和P_eno-Rpi-Rpe操纵子在靠近pnp 编码序列末端处向内源性pnp基因内的整合和替换运动发酵单胞菌(Z  mobilis)基因组中pnp编码序列的片段(从nt-2,084至nt-2,188)。

实例5

利用木糖的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株的开发

用两种质粒在两个步骤中转化了ZW1菌株。ZW1的感受态细胞通过 在30℃、150rpm振荡条件下在mRM3-G5(1％酵母提取物，15mM  KH₂PO₄，4mM MgSO₄，和50g/L葡萄糖)中培养种子细胞过夜至OD₆₀₀值 接近5进行制备。收获细胞并将其重悬在新鲜培养基中至OD₆₀₀值为0.05。 细胞在相同条件下生长至对数期的早期至中期(OD₆₀₀接近0.5)。收获细 胞并用冰水洗涤两次，然后用冰冷的10％甘油洗涤一次。收集所得到的感 受态细胞并重悬在冰冷的10％甘油中至OD₆₀₀值接近100。由于运动发酵单 胞菌(Z.mobilis)的转化需要非甲基化的DNA，将DCO质粒pZX21、 pZX52、和pZX6各自转入大肠杆菌(E.coli)SCS110感受态细胞(Stratagene， La Jolla，CA)。对于每一转化，使转化的细胞的一个菌落于37℃在10mL  LB-Amp100(包含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基)中生长过夜。使 用QIAprep Spin DNA Miniprep Kit(Qiagen)，从10mL培养物制备DNA。

将大约1μg非甲基化的pZX21DNA与50μL ZW1感受态细胞在1MM 电穿孔杯(VWR，West Chester，PA)中混合。在2.0KV下使用BT720  Transporater Plus(BTX-Genetronics，San Diego，CA)将质粒DNA电穿孔到 细胞中。转化细胞在30℃下，在1mL MMG5培养基(10g/L葡萄糖， 10g/L酵母提取物，5g/L胰蛋白胨，2.5g/L(NH₄)₂SO₄，0.2g/L K₂HPO₄，和 1mM MgSO₄)中恢复4小时，并且在30℃下，在带有AnaeroPack (Mitsubishi Gas Chemical，New York，NY)的厌氧广口瓶内的MMG5- Spec250平板(具有250mg/L的奇放线菌素和15g/L的琼脂的MMG5)上 生长3天。

由于pZX21是DCO自杀载体，存活的Spec^R菌落具有整合进gfor基 因座的P_gapS-AMxylA::P_eno-ECxylB::Spec-R片段。菌落被划线接种并生长在 新鲜的MMG5-Spec250平板上，然后对其进行PCR以检测嵌合基因的整 合。第一次PCR使用正向引物ara285(SEQ ID NO：42)和反向引物ara120 (SEQ ID NO：43)来检测pZX21中GFO-L片段介导的双交换重组。ara285引 物匹配基因组中GFO-L片段上游494bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组 序列片段，而ara120与pZX21中P_gapS的最后18bp和AMxylA的前17bp互 补。如果整合如所设计的发生，PCR将从转化体扩增出1,903bp片段。第二 次PCR使用正向引物ara46(SEQ ID NO：44)和反向引物ara274(SEQ ID  NO：45)来检测pZX21中GFO-R片段介导的双交换重组。ara46引物是靠近 pZX21中Spec^R基因末端的序列，而ara274与GFO-R片段下游83bp的运 动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA的片段互补。这次PCR将从具有成功 的整合的菌落扩增出1,864-bp片段。两项检测均产生了所预期的PCR产 物，从而确认了准确的转基因整合。所得到的菌株被命名为ZW1-pZX21。

在第二个步骤中，用pZX52转化了ZW1-pZX21，并在MMG5- Spec250-CM120(具有120mg/L氯霉素的MMG5-Spec250)平板上进行选 择。因为pZX52是具有用于质粒选择的Cm^R标记和无标记整合片段(P_gapT- ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe)的DCO穿梭载体，回收的菌落应当不仅 在运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中包含早先整合的构建体P_gapS- AMxylA::P_eno-ECxylB::Spec-R，而且在增殖的pZX52质粒中包含非整合的 构建体P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe。这些转化体应当具有木糖 利用途径全部所需的基因。为了证明全部的转基因在运动发酵单胞菌(Z  mobilis)中是功能性的，在木糖中对十个选择的菌落进行了48小时的生长测 定。在该测定中，用选择的菌落接种了14mL Falcon聚丙烯圆底管中的 2mL mRM3-G5-Spec200-CM120(具有200mg/L奇放线菌素和120mg/L氯霉 素的mRM3-G5)，并于30℃以150rpm摇动培养过夜。盖紧管，但是用 23G1针在盖子顶部刺一个孔，用于在细胞生长和发酵期间释放压力。收获 细胞，用MRM3X10(具有100g/L木糖的MRM3)洗涤，并重悬在mRM3- X10-Spec200-CM120(包含200mg/L奇放线菌素和120mg/L氯霉素的 mRM3-X10)至具有0.1的起始OD₆₀₀。将五毫升的悬浮液置于新的14mL  Falcon聚丙烯圆底管中。用顶部有一孔的盖盖上管。使细胞在30℃以 150rpm摇动生长48小时，在Shimadzu UV-1201分光光度计上测量 OD₆₀₀。然后以10,000xg离心1mL培养物以除去细胞。将上清液滤过 0.22μm的Costar Spin-X离心管过滤器(Corning Inc，Corning，NY)并通过 Agilent 1100 HPLC系统(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上的 BioRad Aminex HPX-A7H离子排阻柱(BioRad，Hercules，CA)，在55℃以 0.6mL/分钟的0.01N H₂SO₄流速，针对木糖和乙醇进行分析。结果表明，全 部10种转化体均已获得了用于生产乙醇的木糖利用途径。新的菌株被命名 为ZW1-pZX21-pZX52，并将培养物之一用于进一步的实验。

然后，使ZW1-pZX21-pZX52依次经受三个转化后程序，以整合P_gapT- ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe构建体。

(1)使菌株在木糖上适应。在该程序中，将ZW1-pZX21-pZX52以0.2 的起始OD₆₀₀值悬浮在5-mL mRM3-G1X9-Spec200-CM120培养基 (具有10g/L葡萄糖、90g/L木糖、200mg/L奇放线菌素和 120mg/L氯霉素的MRM3)中，并于30℃生长，以倍增3至4次 (OD₆₀₀值从0.2升至2；一次传代)。然后将培养物稀释至起始 OD₆₀₀值并进行另一代的生长。总共完成了4次传代(大约15次 倍增)。

(2)通过使10μL的适应细胞池于较高的温度(37℃)在2mL mRM3-G5- Spec200培养基中生长过夜，进行了P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno- ZMRpi-ZMRpe构建体的质粒消除和整合。然后，将10μL培养物 稀释在2mL mRM3-G5-Spec200培养基中并再生长一代。总共在 葡萄糖培养基中于37℃进行了5次传代。作为高温生长的结果， 群体中的大多数应当不再具有pZP52质粒，但P_gapT-ECTal- ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe构建体(缺少选择性标记)应当已被 整合进运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组的ldhA基因。群体中的 少数可能维持了pZX52，没有整合。

(3)通过使50μL的细胞池于30℃在2mL mRM3-X10-Spec200中生长 过夜，富集了群体。使富集的群体于30℃在MMG5-Spec250平板 上生长过夜。选择单独的菌落并以重复形式划线接种至MMG5平 板和MMG5-CM120平板上。于30℃过夜孵育之后，选择在 MMG5上生长但不在MMG5-CM120上生长的那些菌落用于进一 步的PCR检测。第一次PCR使用正向引物ara45(SEQ ID NO：46) 和反向引物ara356(SEQ ID NO：47)来检测pZX52中LDH-L片段 介导的双交换重组。ara45引物匹配基因组中LDH-L片段上游 86bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA片段，而ara356与 pZX52中ECTal编码区的片段(从nt-91至nt-112)互补。如果整 合如所设计的发生，PCR将从所述菌落扩增出1,383bp片段。第 二次PCR使用正向引物ara354(SEQ ID NO：48)和反向引物ara43 (SEQ ID NO：49)来检测pZX52中LDH-R片段介导的双交换重 组。ara354引物是靠近pZX52中ZMRpe的3′端的序列。ara43引 物与LDH-R片段上游122bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组 DNA的片段互补。当重组如所预期的发生时，PCR将从所述菌落 扩增出1,468bp片段。两次PCR均产生了具有预期大小的DNA 片段，这确认了在所检测的全部菌落中，P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno- ZMRpi-ZMRpe构建体均已如所设计的正确地整合。所得到的菌 落被命名为ZW1-X109。

在第二种方法中，用pZX6DCO穿梭载体转化了ZW1-pZX21菌株， 并如上文关于ZW1-X109所描述的进行了三个转化后程序，不同的是适应 进行了10次传代而不是4次传代。因此，P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi- ZMRpe构建体被靶向至内源性pnp基因。如关于ZW1-X109的构建所描述 的，在三个转化后程序之前，进行了48小时生长测试，以确保全部的转基 因如所预期的起作用。在三个转化后程序之后，同样通过PCR检测了整 合。第一次PCR使用正向引物ara340(SEQ ID NO：50)和反向引物ara356 (SEQ ID NO：47)来检测pZX6中PNP-L片段介导的双交换重组。ara340引物 匹配PNP-L片段上游75bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA。所使 用的ara356引物与pZX6中ECTa1的片段(从nt-91至nt-112)互补。如对于 正确的整合事件所预期的，PCR从转化体产生了1,815-bp的片段。第二次 PCR使用正向引物ara354(SEQ ID NO：48)和反向引物ara339(SEQ ID  NO：51)来检测pZX6中PNP-R片段介导的双交换重组。在这种情况下， ara354引物匹配pZX6中靠近ZMRpe的3′端的序列，而ara339引物与PNP- R片段序列下游59bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA片段互补。 PCR从转化体扩增出1,549bp的片段，该大小是成功的整合所预期的。因 此，PCR检测确认了在所检测的全部菌落中，P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno- ZMRpi-ZMRpe构建体均已被正确地整合。新的菌株被命名为ZW1-X210。

概括地说，从野生型ZW1重新构建了两种利用木糖的运动发酵单胞菌 (Z mobilis)菌株。它们均具有整合进gfor基因座的P_gapS-AMxylA::P_eno- ECxylB::Spec-R构建体。ZW1-X109菌株具有整合进IdhA基因座的P_gapT- ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe构建体，而ZW1-X210菌株具有整合进内 源性pnp基因的相同构建体。两种菌株在整合的P_gapS-AMxylA::P_eno- ECxylB::Spec-R构建体中均具有一个标记基因，其能够通过Cre重组酶的 引入被除去。

实例6

新的利用木糖的运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株的表征

通过如实例5中所述的标准生长测定，展示了ZW1-X109和ZW1- X210菌株发酵木糖的能力。为了定量测定这些新的菌株的生长和代谢特征 并将它们与ZW1进行比较，在摇瓶发酵测定中对这些菌株进行了表征。首 先使用MRM3G10对它们进行了摇瓶发酵，以测定它们的基础葡萄糖代 谢。在30℃以150rpm摇动，使菌株在2mL mRM3-G5-Spec250中生长过 夜。收获细胞，用mRM3-G10洗涤，并重悬在mRM3G10中，以具有0.1 的起始OD₆₀₀。将二十mL悬浮液置于45mL带螺旋盖的VWR离心管中并 在30℃、150rpm振荡条件下生长。为了避免由于乙醇在发酵期间挥发而积 聚压力，将盖子盖紧，然后旋松一图。在时间进程中，在0、10、和24小 时时间点，在Shimadzu UV-1201分光光度计上测量了OD₆₀₀。在每个时间 点，以10,000xg离心1mL培养物以除去细胞。将上清液滤过0.22μm的 Costar Spin-X离心管过滤器并通过Agilent 1100 HPLC系统上的BioRad  Aminex HPX-A7H离子排阻柱，在55℃以0.6mL/分钟的0.01N H₂SO₄流速 进行分析。使野生型ZW1在抗生素不存在下生长并作为对照进行分析。图 9中给出的结果显示，每一菌株在24小时内迅速耗尽了可用的葡萄糖； ZW1-X109和ZW1-X210菌株(分别为图8A、8B)均与ZW1(图8C)相似 地利用葡萄糖。例如，在10小时的发酵后，ZW1-X109已利用了大约 34.8％的葡萄糖(从102.7g/L减少至66.9g/L)来支持16.4g/L的乙醇滴度和达 到4.88的OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X210已利用了大约32.1％的葡萄糖 (从102.7g/L减少至69.7g/L)来支持15.2g/L的乙醇滴度和达到4.68的OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1已利用了大约33.9％的葡萄糖(从103.1g/L减少至 68.2g/L)来支持16.4g/L的乙醇滴度和达到4.6的OD₆₀₀值的生物质生长。因 此，两种新的菌株均具有健康的基础葡萄糖代谢。

在20mL mRM3-X10中进行了摇瓶发酵，以测定每一菌株利用木糖的 能力。在0、24、48、和72小时测定了OD₆₀₀值以及木糖和乙醇浓度。图 10是ZW1-X109(A)、ZW1-210(B)和ZW1(C)的结果的总结。该结果同样 确认了两种新菌株均能够发酵木糖。在72小时的发酵后，ZW1-X109已利 用了大约64.2％的木糖(从105.6g/L减少至37.8g/L)来支持31.5g/L的乙醇滴 度和达到3.51的OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X210已利用了几乎全部可用 的木糖(从105.6g/L减少至1.6g/L)来支持48.5g/L的乙醇滴度和达到5.22的 OD₆₀₀值的生物质生长。然而，ZW1由于缺少木糖代谢途径，不能在 mRM3-X10中生长。因此，在新菌株之中，ZW1-X210能够在包含木糖的 单种糖培养基中比ZW1-X109更快地发酵木糖。ZW1-X109和ZW1-X210 之间的主要差异是P_gapT-ECTal-ECTkt::P_eno-ZMRpi-ZMRpe构建体在ZW1- X109中插入至ldhA基因座，而在ZW1-X210中插入至内源性pnp基因。 该结果表明，pnp基因的插入可有利于运动发酵单胞菌(Z mobilis)中的木糖 代谢。

实例7

用于在运动发酵单胞菌(Z mobilis)菌株中插入内源性pnp基因的载体构建体

为了直接测试内源性pnp基因的插入是否有利于木糖代谢，通过标准 的分子重组方法构建了图4中显示的四种DCO自杀载体。

pPNP-I(SEQ ID NO：55；图11A)是5,548-bp的基于pUC18的DCO载 体。其主链包含653bp复制起点(pUC Ori)和1,144bp氨苄青霉素抗性标记 (Amp-R)，使得该载体能够增殖并选择用于大肠杆菌(E.coli)。pPNP-I包含 911bp氯霉素抗性基因(Cm-R)和将该基因的整合靶向至内源性pnp基因的旁 侧序列。891bp上游旁侧序列(SEQ ID NO：56)由775bp PNPi-L序列(pnp编 码区(SEQ ID NO：1)从nt-1,345至nt-2,119)、9bp直接倒置片段(DR)、19-bp ME(嵌合末端)元件、和34bp Lox元件组成。1,030bp下游旁侧序列(SEQ ID  NO：57)由19bp ME元件、9bp直接倒置片段(DR)、和916bp PNPi-R序列组 成。PNPi-R序列包含pnp编码区的最后116bp(从nt-2,129至nt-2,244)和 pnp编码序列下游的800bp DNA序列。PNPi-L和PNPi-R均扩增自运动发 酵单胞菌(Z mobilis)ZW1的基因组DNA。在pPNP-I中，PNPi-L和PNPi-R 序列指导它们之间的DNA序列通过双交换同源重组在pnp编码区的nt- 2,119和nt-2,129之间向运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中的整合。整合插 入了内源性pnp基因，并且与实例3中描述的I菌株的基因型相似，其中整 合的转基因是Cm-R而不是Rpi::Spec-R。其导致了截短的723个氨基酸的 pnp融合蛋白产物，如实例3中所述，它比野生型pnp蛋白产物(748个氨 基酸的多核苷酸磷酸化酶；SEQ ID NO：2)短25个氨基酸。截短的蛋白质与 野生型有相同的前709个氨基酸残基，但具有连接在C末端的新的14个氨 基酸的序列(SEQ ID NO：9)。

pPNP-IN(图11B；SEQ ID NO：58)也是基于pUC18的DCO载体，大小 为6,471bp。它通过用PNP-U替换PNPi-L和用PNP-D替换PNPi-R而直接 来源于pPNP-I。PNP-U(SEQ ID NO：59)是1,369-bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA片段，它由pnp编码区的前96bp和pnp编码区上游的 1,273-bp序列组成。PNP-D(SEQ ID NO：60)是1,251-bp的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA片段，它包括pnp编码序列的一部分，从nt-97至nt- 1,347。在载体pPNP-IN中，PNP-U和PNP-D是指导两个9bp DR元件之间 的序列在pnp编码区的nt-96和nt-97之间向运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因 组中的整合的同源重组片段。整合插入了内源性pnp基因，并导致了仅具 有49个氨基酸残基的截短的pnp蛋白产物(SEQ ID NO：12)，其比野生型 pnp蛋白产物短699个氨基酸。这种短蛋白质与野生型具有相同的前32个 氨基酸，然后具有连接在C末端的17个新的氨基酸残基。

pPNP-C(SEQ ID NO：61、图11C)是6,342-bp的基于pBluescript的载 体。其主链由f1(+)复制位点(f1(+)Ori)、氨苄青霉素抗性标记(Amp-R)、和 pUC复制位点(pUC Ori)组成，用于在大肠杆菌(E.coli)中的增殖和选择。在 该载体中，911-bp氯霉素抗性基因(Cm-R)侧翼是1,318-bp PNP-L片段和 1,225-bp PNP-R片段。PNP-L和PNP-R片段扩增自运动发酵单胞菌(Z mobilis)ZW1基因组DNA，并且与实例4中描述的pZX6中的那些是相同 的。PNP-L片段是从pnp编码序列从nt-767至nt-2,084的片段，而PNP-R 片段包含pnp编码序列的最后56bp(从nt-2189至nt-2244)、它的终止密码 子、和1,166bp的下游序列。因此，pPNP-C指导Cm-R标记在nt-2,085和 nt-2,188之间向pnp编码区中的整合。该整合位点靠近pnp编码序列的3′ 端，在pPNP-I的靶标整合位点上游34bp。截短的pnp编码区产生697个氨 基酸的蛋白质(SEQ ID NO：10)，它比野生型短51个氨基酸残基，并且与野 生型具有695个相同的氨基酸残基，在C末端有2个新的氨基酸。

与pPNP-C相似，pPNP-M(SEQ ID NO：62；图11D)是6,322-bp的基于 pBluescript的载体，它同样具有由f1(+)Ori、Amp-R、和pUC Ori组成的主 链序列。然而，在pPNP-M中，911bp氯霉素抗性转基因(Cm-R)的侧翼是 1,200bp PNPm-L片段和1,324bp PNPm-R片段。两段侧翼片段均扩增自运 动发酵单胞菌(Z mobilis)ZW1基因组DNA。PNPm-L(SEQ ID NO：63)包含 pnp编码序列上游的96bp基因组序列和pnp编码序列的前1,104bp(从nt-1 至nt-1104)，而PNPm-R(SEQ ID NO：64)包含pnp编码序列的最后1140bp (从nt-1,105至nt-2244)、它的终止密码子、和181bp下游序列。因此， pPNP-M能够指导Cm-R标记在运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组中在nt- 1,104至nt-1,105之间向内源性pnp基因中的整合。整合位点靠近pnp编码 序列的中间，在pPNP-I的整合位点上游1,015bp。其导致了截短的378个 氨基酸的pnp蛋白产物(SEQ ID NO：11)，比野生型pnp蛋白产物短370个氨 基酸。截短的蛋白质与野生型有相同的前368个氨基酸残基，但具有连接 在C末端的新的10个氨基酸的序列。

实例8

菌株ZW1-X109中内源性pnp基因的插入

为了确定内源性pnp基因的插入是否有利于运动发酵单胞菌(Z mobilis) 中的木糖利用，用pPNP-I、pPNP-C、pPNP-M、和pPNP-IN分别转化了 ZW1-X109，如实例5中所述。由于全部四种载体都是自杀载体，在 MMG5-CM120平板(具有120mg/L氯霉素和15g/L琼脂的MMG5)上直接选 择了转化体。所得到的菌株被命名为ZW1-X109-PNPi、ZW1-X109-PNPc、 ZW1-X109-PNPm、和ZW1-X109-PNPin。每种菌株的一些菌落被划线接种 并生长在新鲜的MMG5-CM120平板上。通过PCR检测确认了转基因的整 合。

在PCR检测中使用了五种引物。正向引物ara448(SEQ ID NO：52)是位 于全部pPNP质粒中的Cm-R标记开始处的序列。反向引物ara339(SEQ ID  NO：51)与pnp基因下游的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组序列片段互补。 它们被用于检测下列重组片段介导的双交换重组：pPNP-I中的PNPi-R， pPNP-C中的PNP-R，pPNP-M中的PNPm-R，和pPNP-IN中的PNP-D。如 果整合是成功的，这两种引物将从ZW1-X109-PNPi菌株扩增出2,393bp的 PCR产物、从ZW1-X109-PNPc菌株扩增出2,256bp的PCR产物、从ZW1- X109-PNPm菌株扩增出3,361的PCR产物、以及ZW1-X109-PNPin菌株扩 增出4,565bp的PCR产物。正向引物ara340或4R0(分别为SEQ ID NO：50 和53)和反向引物ara449(SEQ ID NO：54)被用于检测下列重组片段介导的双 交换重组：pPNP-I中的PNPi-L，pPNP-C中的PNP-L，pPNP-M中的 PNPm-L，和pPNP-IN中的PNP-U。ara340引物匹配位于运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组DNA中PNPi-L和PNP-L序列上游的pnp编码序列的片段 (从nt-702至nt-724)。4R0引物是位于pnp基因外和PNPm-L和PNP-U 序列上游的运动发酵单胞菌(Z mobilis)基因组序列的片段。ara449引物与 pPNP质粒中Cm-R标记末端的序列互补。因此，当整合是成功的时， ara340和ara449能够从ZW1-X109-PNPi菌株扩增出2,551-bp PCR产物、从 ZW1-X109-PNPc菌株扩增出2,306-bp PCR产物，而4R0和ara449能够从 ZW1-X109-PNPm菌株扩增出3,424-bp PCR产物、从ZW1-X109-PNPin菌 株扩增出2,430-bp PCR产物。使用Invitrogene的PCR Supermix，在新鲜生 长的菌株上直接进行了标准的PCR反应。结果显示了正确的整合。

实例9

pnp整合菌株的表征

在摇瓶发酵中对ZW1-X109-PNPi、ZW1-X109-PNPc、ZW1-X109- PNPm、和ZW1-X109-PNPin菌株进行了进一步表征，以测定它们的生长和 代谢特征。包含未插入的内源性pnp基因的亲本ZW1-X109菌株被用作对 照。发酵按照如实例6中所述的标准规程进行，不同的是细胞培养物的体 积从20mL减少至10mL，因此使用了在顶部带有穿刺的孔的带盖14mL Falcon圆底管而不是45mL VWR离心管。第一次摇瓶发酵在mRM3-G10中 进行。在发酵的0、10、和24小时，在Shimadzu UV-1201分光光度计上测 量了OD₆₀₀，同时使用BioRad Aminex HPX-A7H离子排阻柱，通过Agilent  1100 HPLC系统测定了葡萄糖和乙醇浓度。结果图示在图12中，显示了全 部四种pnp插入的菌株均具有与亲本ZW1-X109菌株相似的基础葡萄糖代 谢。例如，在10小时的发酵后，ZW1-X109-PNPi(A)利用了大约37.7％的 葡萄糖(从120.8g/L减少至75.3g/L)来支持22.9g/L的乙醇滴度和达到 5.36的OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X109-PNPc(B)利用了大约37.7％的葡 萄糖(从120.8g/L减少至75.3g/L)来支持23.0g/L的乙醇滴度和达到4.98 的OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X109-PNPm(C)利用了大约39.1％的葡萄糖 (从120.8g/L减少至73.6g/L)来支持23.5g/L的乙醇滴度和达到5.14的 OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X109-PNPin(D)利用了大约36.8％的葡萄糖 (从120.8g/L减少至76.4g/L)来支持22.6g/L的乙醇滴度和达到5.32的 OD₆₀₀值的生物质生长；亲本ZW1-X109菌株(E)利用了大约39.5％的葡萄糖 (从120.8g/L减少至73.4g/L)来支持24.0g/L的乙醇滴度和达到5.62的 OD₆₀₀值的生物质生长。在24小时的发酵之后，全部的pnp插入的菌株均 耗尽了葡萄糖来支持接近58.1g/L的乙醇滴度和约7.90的OD₆₀₀值的生物质 生长，而ZW1-X109也耗尽了葡萄糖来支持57.3g/L的乙醇滴度和7.64的 OD₆₀₀值的生物质生长。

然后，在10mL mRM3-X10中进行了摇瓶发酵，如上文所述。在0、 24、48、和72小时测定了OD₆₀₀值以及木糖和乙醇浓度。图13显示了结果 的图。其显示了全部四种pnp破坏的菌株在发酵中比亲本ZW1-X109菌株 更好地利用了木糖。在48小时的发酵后，ZW1-X109-PNPi(A)已利用了大 约95.5％的木糖(从117.9g/L减少至5.3g/L)来支持54.7g/L的乙醇滴度和达 到5.34的OD₆₀₀值的生物质生长。又发酵了24小时之后，其几乎用尽了木 糖(仅剩1.4g/L)来支持56.0g/L的乙醇滴度和5.62的OD₆₀₀值的生物质生 长。在相同的72小时期间，ZW1-X109-PNPc(B)利用了大约94.2％的木糖 (从117.9g/L减少至6.8g/L)来支持53.6g/L的乙醇滴度和达到4.64的 OD₆₀₀值的生物质生长；ZW1-X109-PNPm(C)利用了大约83.3％的木糖(从 117.9g/L减少至19.7g/L)来支持47.5g/L的乙醇滴度和达到4.24的OD₆₀₀值 的生物质生长；ZW1-X109-PNPin(D)利用了大约79.8％的葡萄糖(从 117.9g/L减少至23.8g/L)来支持45.5g/L的乙醇滴度和达到4.04的OD₆₀₀值 的生物质生长。亲本ZW1-X109菌株(E)利用了大约61.7％的木糖(从 117.9g/L减少至45.1g/L)来支持34.8g/L的乙醇滴度和达到3.26的OD₆₀₀值 的生物质生长。上述结果还表明，具有pnp编码的蛋白质的较小截短的菌 株，诸如ZW1-X109-PNPi和ZW1-X109-PNPc，比具有较大的截短的菌 株，诸如ZW1-X109-PNPm和ZW1-X109-PNPin，更有效地利用了木糖。以 这些菌株利用木糖的能力顺序(最好的在前)对它们进行的排序是：ZW1- X109-PNPi、ZW1-X109-PNPc、ZW1-X109-PNPm、ZW1-X109-PNPin、最 后是ZW1-X109。

概括地说，本实例展示了运动发酵单胞菌(Z mobilis)的内源性pnp基因 中的整合没有影响葡萄糖代谢，但改善了在发酵中的木糖利用。

实例10(比较)

在不存在RPI过表达的ZW801-4中内源性pnp基因的插入

使用在ZW1-X109中对在木糖上的生长和代谢具有最大效应的两种自 杀构建体(例如，pPNP-I和pPNP-C，描述于实例7中)，在ZW801-4中 检测了内源性pnp基因修饰的效应(参见“一般方法”)。用这些自杀载 体中的每一种分别转化ZW801-4，如实例8中所述。在使用木糖的摇瓶实 验中评估了每一构建体的两个转化体，并且包括了ZW801-4作为对照(同 样一式两份地进行)。生长培养基是mRM3-X10，温度是33℃。针对 OD600、木糖、和乙醇测定了每一培养物的样品，如前文所述。该实验的 结果显示在图14中。与对照相比，仅由pPNP-I构建体制备的转化体显示 了略微的改善。注意，pPNP-I自杀构建体与ZW801-4染色体的双交换同源 重组导致了与I菌株中所存在的完全相同的pnp基因修饰。

实例11

木糖异构酶活性的测定

在包含20μL无细胞提取物(参见“一般方法”)、0.256mM  NADH、50mM木糖、10mM MgSO₄、10mM三乙醇胺、和1U/ml SDH(山 梨醇脱氢酶)的反应中，于30℃测量了ZW658中的木糖异构酶活性(参见 “一般方法”)。在读板机上读取了3-5分钟的A₃₄₀。如下计算了XI活 性：

1单位的XI对应于在30℃1微摩尔D-木酮糖每分钟的形成

U(微摩尔/分钟)＝斜率(dA₃₄₀/分钟)*反应体积(μL)/6220/0.55cm(在 1cm比色杯中NADHP→NAD的摩尔数是6220 A₃₄₀每摩尔每升)(微孔 板中200μL每孔的路径长度＝0.55cm)

比活性(微摩尔/分钟-毫克)＝微摩尔/分钟/蛋白质浓度(毫克)

就ZW658而言测量的活性是0.25+/-0.033微摩尔产物/毫克蛋白质/分 钟。