一种观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法

技术领域

本发明涉及一种应用激光扫描共聚焦显微镜观测动物肝脏组织细胞骨架系统变化方法，更具体的说是一种应用激光扫描共聚焦显微镜观测鱼类肝脏组织切片中微管蛋白(β-tubulin)表达和分布的方法。 

背景技术

细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构，真核细胞借其才得以维持基本形态，因此这一重要结构被形象地称为细胞骨架，它通常也被认为是广义上细胞器的一种。细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。肝脏是大多数污染物重要的蓄积器官和解毒器官，某些污染物胁迫下肝脏细胞骨架系统可能会发生重组甚至破坏，由于细胞骨架对于维持细胞的形态结构及内部结构的有序性，以及在细胞运动、物质运输、能力转换、信息传递和细胞分化等一系列方面起重要作用，因此准确观察动物肝脏细胞骨架发生的变化对阐明污染物致毒机理具有十分重要的意义。 

细胞骨架是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，由主要的三类蛋白纤丝(filament)构成，包括微管、微丝(肌动蛋白纤维)和中间纤维。微管主要分布在核周围，并呈放射状向胞质四周扩散；微丝主要分布在细胞质膜的内侧；而中间丝则分布在整个细胞中。微管(microtubule)可在所有哺乳类动物细胞中存在，直径大于12nm，除了红细胞(红血球)外，所有微管均由约55kD的α及β微管蛋白(tubulin)组成。它们正常时以β二聚体形式存在，并以头尾相连的方式聚合，形成微管蛋白原纤维(protofilament)，一般由13根这样的原纤维构成一个中空的微管，直径22～25nm。少数变异的微管如线虫等所有的则有其他数目的原纤维。到目前为止，已有多种技术研究细胞骨架相关蛋白的含量和分布，如应用蛋白质印迹(Western blotting)技术研究目标 骨架蛋白在组织蛋白提取液中的表达，但该技术只能研究目标骨架蛋白在组织中的丰度，不能研究细胞骨架系统整体的形态变化；应用荧光抗体标记的细胞骨架蛋白，可用荧光显微镜研究(活)细胞的细胞骨架的动力学，包括组装、去组装和物质运输等，但这一技术经常被用来研究细胞试验中离体细胞的细胞骨架的形态，应用范围有限，而大多数毒理试验是用试验动物开展污染物暴露试验，因此这一技术并不能有效衡量动物试验中受污染物暴露的动物肝脏组织的肝细胞骨架的受损状况。 

细胞骨架是细胞结构和功能的组织者，其在保持细胞内一些细胞器和生物大分子的正常生理活动(如分泌蛋白的合成)和信号传递上有着重要作用，因此近年来成为污染物致毒机理相关研究中的热点之一。Tubulin(微管蛋白)是细胞骨架的重要组成部分，广泛存在于各种哺乳动物细胞中，主要由α-tubulin和β-tubulin组成。其中β-tubulin蛋白表达水平相对稳定，常被用于免疫染色观察细胞的微管结构中的目标蛋白。本发明专利即围绕着用荧光探针标记β-tubulin抗体来标记肝脏组织切片中细胞结构中的微管蛋白，进而使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞骨架微管结构。激光扫描共聚焦显微镜是利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑(针孔)阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。用其来观察组织切片中的细胞骨架，可避免因切片厚度带来的视野不清晰的问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有细胞骨架系统观测方法的不足，提供了一种观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，采用β-Tubulin(9F3)Rabbit(Alexa 488Conjugate)单克隆抗体(Sigma)作为一抗，结合动物肝脏切片中细胞骨架中的微管蛋白，应用激光扫描共聚焦技术观察细胞骨架结构，可以实现准确、直观的细胞骨架系统观察，并为污染物胁迫导致动物肝脏组织细胞骨架系统发生重组变化提供直接证据。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下： 

一种观察动物肝脏组织中细胞骨架的微管结构的方法，它包括如下步骤： 

(1)将动物肝脏组织，经PBS清洗，4v/v％多聚甲醛水溶液固定8～12h，石蜡包埋，连续切片； 

(2)对步骤(1)得到的石蜡切片进行脱蜡，抗原修复，封闭，荧光标记抗体孵育； 

其中，所述的脱蜡，将石蜡切片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃烘片2～6小时，置于二甲苯中脱蜡30分钟，取出，再放入新鲜的二甲苯中再次脱蜡10分钟；之后，进行梯度酒精复水； 

其中，所述的抗原修复，室温下将脱蜡后的切片置于10mM、pH 6.0的枸橼酸缓冲液修复液中，用微波炉100％火力处理3min至微微沸腾，再用50％火力维持7min，停止加热后自然冷却20～30min；去离子水清洗3次，每次5min；再用PBS清洗5min，用滤纸擦去标本外的PBS； 

其中，所述的封闭，是用封闭液室温下孵育封闭1h，倾去封闭液；所述的封闭液用含0.3v/v％TritonX-100的PBS将山羊血清稀释至5～10v/v％； 

其中，所述的荧光标记抗体孵育，是用Alexa488Conjugate的β-Tubulin(9F3)Rabbit单克隆抗体稀释液4℃湿盒孵育标本过夜；之后，用PBS 3min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS；滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma)避光孵育2～5min，对标本细胞核进行标记，用PBS 1min×3次洗去4',6-二脒基-2-苯基吲哚，用滤纸擦去标本外的PBS，最后用甘油封片； 

(3)对于甘油封片后的标本，在24h内使用激光扫描共聚焦显微镜观察，488和4',6-二脒基-2-苯基吲哚分别在488nm和405nm下激发，室温、暗室环境下立即观察，拍片。 

步骤(1)中，切片厚度为4～5μm。 

步骤(1)或(2)中，所述的PBS为0.01M、pH 7.2的磷酸缓冲液。 

步骤(2)中，所述的梯度酒精复水，使用以下溶剂依次浸泡：100v/v％酒精3min，100v/v％酒精3min，95v/v％酒精水溶液3min，85v/v％酒精水溶液3min，75v/v％酒精水溶液3min，50v/v％酒精水溶液3min，去离子水3min，去离子水3min，0.01M、pH 7.2PBS 5min。 

步骤(2)中，荧光标记抗体孵育过程中，单克隆抗体稀释液配制方法如下：用含0.3v/v％TritonX-100和1m/v％(m/v为溶质质量mg与溶剂体积mL之比，以下相同)牛血清白蛋白的PBS稀释单克隆抗体，单克隆抗体的与PBS的体积比为1:500～1:800。 

步骤(3)中，激光扫描共聚焦显微镜为Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜。 

有益效果： 

本发明采用免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜检技术，公开了一种观测动物肝脏组织细胞骨架系统变化的方法，与以往的技术相比，本发明具有以下优点： 

(1)快速、简单。本发明大部分操作建立在传统的石蜡切片免疫组化技术基础之上，较为简单，容易掌握，选用合适的细胞骨架抗体，能在较短的时间内直接观察到动物组织细胞骨架系统，并通过激光扫描共聚焦显微镜成像。 

(2)直观、准确。根据商业化的细胞骨架相关蛋白的带荧光探针的抗体，结合合适的前处理技术，可直接、高效、准确地定位细胞骨架，观测其发生的变化，若辅以合适的计算机软件，甚至可以半定量蛋白表达强度，而不像蛋白质印迹技术只能半定量检测细胞骨架相关蛋白的含量变化。 

(4)较强的实用性和扩展性。本发明对大多数动物肝脏组织的冷冻切片同样适用，若同时孵以微丝相关蛋白的带荧光标记的抗体，可以完整观测整个细胞骨架系统。由于制作石蜡切片前期采用4％(v/v)多聚甲醛水溶液常温即可以固定，因此适用于除细胞试验之外的大多数动物毒理试验，应用范围较广，运用激光扫描共聚焦显微镜技术，弥补了同类研究中只能对细胞进行清晰成像的缺陷。 

(3)可研究污染物胁迫下细胞骨架的剂量-效应变化关系。研究结果表明多种污染物在低浓度下能显著诱导动物肝脏细胞骨架发生重组、破坏。细胞骨架系统变化或受损程度与暴露物在一定浓度范围内存在着一定的剂量-效应关系。 

附图说明

图1为激光扫描共聚焦显微镜成像的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)正常肝脏细胞核(蓝色部分)和细胞骨架系统(绿色部分)。标尺为5μm。 

图2为腹腔注射50μg/kg MC-LR作用12h后，激光扫描共聚焦显微镜显示的鲤鱼肝脏细胞骨架结构发生的变化。标尺为10μm。 

图3为腹腔注射120μg/kg MC-LR作用5h后，激光扫描共聚焦显微镜显示的鲤鱼肝脏细胞骨架结构发生的变化。标尺为10μm。 

图4为腹腔分别单独注射MC-LR和丁胱亚磺酰亚胺(BSO)、以及共同注射MC-LR和BSO作用48h后鲤鱼肝脏细胞骨架结构发生的变化对比。(A)腹腔注射50μg/kg MC-LR作用48h，标尺为10μm；(B)腹腔注射200mg/kg BSO作用48h，标尺为5μm； (C)腹腔注射50μg/kg MC-LR 1h前预先注射BSO 200mg/kg，共同作用48h，标尺为10μm。 

图5为含不同浓度MC-LR水溶液暴露14d对鲤鱼肝脏β-tubulin表达的影响，采用Image-Pro Plus软件计算阳性表达区域平均累计光密度(MIOD)；数值表示为平均值±标准误(n＝6)；*表示处理组相对于对照组有显著性差异(p<0.05)。 

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 

实施例1：利用激光扫描共聚焦显微镜成像鲤鱼(Cyprinus carpio)正常肝脏细胞骨架系统。 

选择购自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心某渔场的幼龄(约6个月)鲤鱼为受试生物，平均体长和重量分别为14.00±1.08cm和29.26±5.09g。在曝气自来水中驯养14d，驯养期间，环境条件如下：水温(16.1±0.2℃)，pH值(7.20±0.35)，溶解氧(8.6±0.5mg/L)，光暗比(12h/12h)，换算为CaCO₃的总硬度(129.7±8.3mg/L)。在驯养和实验期间保持曝气。暴露前2天停止喂食，两天暴露期间每天喂食一次。 

驯养结束后，随机选择数条健康鱼于冰上处死，迅速取出鱼肝，经0.01M且pH为7.2的磷酸缓冲溶液(PBS)清洗，4％(v/v)多聚甲醛水溶液固定过夜(8～12h)，石蜡包埋，将包埋好的肝脏标本用切片机切石蜡连续切片(4～5μm)。将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上，60℃烘片2～6小时，置于二甲苯中脱蜡30分钟(第一道脱蜡)，取出，再放入新鲜二甲苯中脱蜡10分钟(第二道脱蜡)脱蜡10分钟；之后，进行梯度酒精复水(100％酒精3min，100％酒精3min，95％酒精3min，85％酒精3min，75％酒精3min，50％酒精3min，去离子水3min，去离子水3min，PBS 5min)；将复水后的切片置于10mM且pH为6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100％火力3min至微微沸腾，再用50％火力维持7min，停止加热后自然冷却20～30min；去离子水清洗3次，每次约5min；再用PBS清洗5min，用滤纸擦去标本外的PBS；用含0.3％(v/v)TritonX-100的PBS(0.01M、pH 7.2)稀释的5％(v/v)山羊血清封闭液室温下封闭1h， 倾去封闭液；用含0.3％(v/v)TritonX-100、1％(m/v)牛血清白蛋白的PBS封闭液稀释的一抗(1:500)，即用β-Tubulin(9F3)Rabbit(Alexa488Conjugate)单克隆抗体稀释液4℃湿盒孵育过夜。之后，用PBS 3min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS；滴加DAPI(Sigma)避光孵育2～5min，可对标本细胞核进行标记。用PBS 1min×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS，最后用甘油封片。使用Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜，488和DAPI分别在488nm和405nm下激发，立即观察，拍片。 

图1为激光扫描共聚焦显微镜成像的鲤鱼(Cyprinus carpio L.)正常肝脏细胞核(蓝色部分)和细胞骨架系统(绿色部分)。由图可知，经过本技术处理，正常肝脏细胞细胞核和细胞骨架系统清晰可见，肝脏细胞核被微观蛋白所包围，绿色荧光标示的β-tubulin蛋白呈拉丝状由细胞核辐射出去。 

实施例2：微囊藻毒素胁迫下鲤鱼(Cyprinus carpio)肝脏细胞骨架系统出现的变化。 

选择购自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心某渔场的幼龄(约6个月)鲤鱼为受试生物，平均体长和重量分别为14.00±1.08cm和29.26±5.09g。实验前先将鲤鱼在曝气自来水中驯养14d，随机分成两大组，每大组按暴露时间再细分成2小组，每个处理小组6条鱼。两大组鱼按MC-LR腹腔分别注射亚致死剂量50μg/kg和120μg/kg(MC-LR溶于生理盐水)，然后分别在5和12h之后冰上处死，迅速取出鱼肝，按实例1所述方法对标本进行前处理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜，488和DAPI分别在488nm和405nm下激发，立即观察，拍片。 

在整个驯养和实验期间，环境条件如下：水温(16.1±0.2℃)，pH值(7.20±0.35)，溶解氧(8.6±0.5mg/L)，光暗比(12h/12h)，换算为CaCO₃的总硬度(129.7±8.3mg/L)。在驯养和实验期间保持曝气。暴露前2天停止喂食，两天暴露期间每天喂食一次。 

图2与图3分别显示了腹腔注射50μg/kg MC-LR作用12h后与注射120μg/kg MC-LR作用5h后，激光扫描共聚焦显微镜显示的鲤鱼肝脏细胞骨架结构发生的变化。由图可知，50μg/kg MC-LR作用下，鲤鱼肝脏细胞骨架结构开始发生有规律的变化，骨架蛋白以细胞核为中心汇聚，浓缩，这种现象在12h时候非常明显(图2)，还需注意的是，在这个时间点相比正常组细胞核发生固缩，出现“空心核”现象。120μg/kg MC-LR作用下可以发现类似的现象，5h开始骨架蛋白发生明显的浓缩并向细胞核聚集现象(图 3)，且细胞核发生明显的固缩变形，出现凋亡症状，并伴随明显的“空心核”现象，这应该是MC-LR作用引起细胞核内染色质高度盘绕出现的空泡结构，与明显浓缩聚集的细胞核一起，可以视为出现细胞凋亡的征兆。 

实施例3：微囊藻毒素和丁胱亚磺酰亚胺共同作用对鲤鱼(Cyprinus carpio)肝脏细胞骨架系统的影响。 

选择购自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心某渔场的幼龄(约6个月)鲤鱼为受试生物，平均体长和重量分别为14.00±1.08cm和29.26±5.09g。实验前先将鲤鱼在曝气自来水中驯养14d，随机分成三组，每个处理小组6条鱼。两腹腔分别注射亚致死剂量50μg/kg MC-LR(溶于生理盐水)、200mg/kg BSO、以及200mg/kg BSO+50μg/kg MC-LR(腹腔注射50μg/kg MC-LR 1h前预先注射BSO 200mg/kg)，分别作用48h后，将鱼冰上处死，迅速取出鱼肝，按实例1所述方法对标本进行前处理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜，488和DAPI分别在488nm和405nm下激发，立即观察，拍片。 

图4为腹腔分布单独注射MC-LR和丁胱亚磺酰亚胺(BSO)、以及共同注射MC-LR和BSO作用48h后鲤鱼肝脏细胞骨架结构发生的变化对比。由图可见，单独注射MC-LR48h后细胞骨架损伤并不严重，除了部分细胞因为细胞解离破裂导致细胞物质流失外，大部分细胞骨架蛋白恢复正常，充满整个细胞(图4中A)；而由于BSO是一种常见的GSH合成抑制剂，能抑制胞内重要解毒物质GSH的合成，改变胞内氧化还原电位，单独注射BSO使肝细胞细胞核发生轻微的固缩，骨架蛋白含量也有所降低(图4中B)，但相对BSO处理后再注射MC-LR的组别(图4中C)，损伤要轻得多，图4C显示鲤鱼肝脏细胞骨架结构已基本完全丧失，且相当数量的细胞核消失。 

实施例4：不同浓度MC-LR水溶液暴露14d对鲤鱼肝脏β-tubulin表达强度的影响。 

选择购自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心某渔场的幼龄(约6个月)鲤鱼为受试生物，平均体长和重量分别为13.98±1.06cm和27.69±5.20g。实验前先将鲤鱼在装有45L曝气自来水的玻璃缸(60×30×35cm，每缸8–10条鱼)中驯养10d。驯养期间鲤鱼死亡率<1％。驯养期间鲤鱼死亡率<1％。驯养结束后，随机分成5组，每组设三组重复，采用体表暴露方式，分别于空白、0.1、1.0、5.0、10.0μg/L MC-LR溶液 中暴露14d。暴露期间，隔天换一半水，并补充MC-LR至预设值，定期采水样检测实际水体中MC-LR浓度。暴露结束后将鱼于冰上处死，迅速取出鱼肝,按实例1所述方法对标本进行前处理，甘油封片后，使用Zeiss公司的LSM 710激光扫描共聚焦显微镜， 488和DAPI分别在488nm和405nm下激发，立即观察，拍片。之后，采用Image-Pro Plus软件计算β-tubulin蛋白阳性表达区域的平均累积光密度(mean integrated optical density,MIOD)来表征蛋白表达强度。每张切片至少观察六个区域。所得结果如图5所示。不同浓度MC-LR静态暴露14d后，0.1–1.0μg/L MC-LR处理组肝脏β-tubulin的表达水平略有上升但未出现显著性差异，随着处理浓度的进一步加大，β-tubulin的表达水平转为下降，并在10.0μg/L MC-LR处理组出现显著性下降(为对照组的71.9％，p<0.05)。引入计算机软件，结合本发明方法，实现了对细胞骨架蛋白表达强度的定量计算。