利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及应用

技术领域

本发明涉及一种利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜载体支架的方法及 应用，属于生物组织工程领域角膜载体支架的制备技术。

背景技术

角膜是位于眼球最前端的一层透明薄膜，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并 为眼睛提供大部分屈光力。由于角膜直接与外界环境接触，故极易受到机 械外伤、热灼伤以及微生物的感染等，致使角膜发生病变，轻者引起角膜 透明度下降影响患者视力，严重者将引起角膜混浊而使患者失明。据WHO 统计，目前全世界角膜病盲患者近6000万人、我国有近500万人，绝大多 数患者可以通过角膜移植来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部 分患者得不到角膜移植而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展 为组织工程角膜的体外重建及其临床应用创造了条件，也为角膜病盲患者 通过组织工程角膜的移植重见光明带来了新的希望，但如何获得正常足量 的人角膜种子细胞和理想的载体支架仍然是当前组织工程角膜体外重建研 究的热点和难点。

在种子细胞方面，樊廷俊等(2005年)在国际上成功建立了没有任何 致瘤性的非转染人角膜内皮(ZL 2005 1 0044143.3)、上皮(ZL201110039014. 0)和基质组织细胞系，首次解决了组织工程角膜规模化重建所需大量种子 细胞的来源问题。

在载体支架方面，虽然国内外学者对天然生物材料(包括捐献人角膜 基质、胶原、明胶、羊膜、丝素蛋白、壳聚糖、纤维蛋白、角膜后弹力层 和异种脱细胞角膜基质等)、人工合成材料(包括聚羟基乙酸、聚乳酸-聚 羟基乙酸共聚物等)以及复合材料(即天然材料和人工合成材料通过一定 的比例或者特定的方法进行交联和整合)等进行了广泛的研究与探索，但 真正能制成满足组织工程角膜规模化体外重建需要的载体支架极少，且均 存在一定的缺点和不足。如人源天然生物材料来源有限，无法满足组织工 程角膜规模化体外重建的需求，而已报道的异种(猪等动物来源)角膜基 质等天然生物材料经脱细胞处理制成的组织工程角膜载体支架也存在有结 构破坏程度大、透明度低、力学性能欠佳等诸多缺陷。而且在制备脱细胞 角膜基质片的过程中有的使用十二烷基硫酸钠、曲酮X-100(Triton X-100) 等去垢剂，有的使用中性蛋白酶或胰酶，这些物质对角膜基质片的作用剧 烈，对其基质中胶原板层和蛋白聚糖有一定的破坏作用，移植后也可能引 起炎症反应；而利用胶原、明胶、丝素蛋白等天然生物大分子制成的组织 工程角膜载体支架仍存在有结构致密度不足、力学性能欠佳、降解过快等 缺陷；人工合成材料制成的组织工程角膜载体支架存在有生物相容性还不 够理想、免疫原性较大的缺点。由此可见，如何筛选和制备具有透明性好、 结构致密、机械性强、与人角膜种子细胞生物相容性好的理想载体支架仍 然是制约组织工程角膜规模化体外重建的瓶颈问题。

因此，建立理想载体支架的制备技术，力争早日实现组织工程角膜的 规模化体外重建及其临床应用，已成为各国学者们竞相开展角膜组织工程 研究的主攻目标，也是全世界角膜病盲患者重见光明的希望之所在。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用新鲜猪角膜制备组织工程角膜的载体支 架的方法及应用，以克服现有技术的不足。

本发明的方法：

首先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角 膜刀切取厚度100～500微米的角膜片；再用低渗溶液对切取的角膜片溶胀 2～3小时，去除角膜上皮层，获得角膜基质片；再将该角膜基质片在-80℃ 冰箱冻1～2小时后，于37℃融化10～30分钟，冻融重复3～5遍；然后用漂 洗缓冲液漂洗2次，每次15～20分钟；

再将冻融漂洗后的角膜基质片放入溶于DNA-RNA酶溶液，于37℃处 理2～4小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15～20分钟，再用超纯水漂 洗15～20分钟，获得脱细胞角膜基质片；

然后将脱细胞角膜基质片浸入角膜专用交联剂溶液中，于37℃浸泡处 理20～30分钟后，利用波长310～400纳米的紫外光照射20～30分钟，照射 距离为2～10厘米；之后用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，每次15～20分 钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15～20分钟；

最后将交联漂洗后的脱细胞角膜基质片平铺于24孔培养板中，风干 48～72小时后使用剂量为14～25千戈瑞的电离射线进行辐照灭菌，即制成 组织工程角膜的载体支架。

本发明所用低渗溶液的配方：0.1～0.3％(w/v)KCl溶液。

上述漂洗缓冲液的配方：100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)。

上述DNA-RNA酶溶液的配方：100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，25mM  MgCl₂，1mM CaCl₂，5～7单位/毫升DNase I，5～7微克/毫升RNase A。

上述角膜专用交联剂溶液的配方为：10～20％(w/v)右旋糖苷溶液， 0.1～0.2％(w/v)核黄素。

为了提高角膜载体支架的透明度并防止细菌滋生，又将上述交联剂溶 液的配方添加了1～2％妥布霉素。

本发明的方法由于仅使用物理(低渗、冻融、风干)和酶(DNA-RNA 酶)处理，未使用任何有毒的化学试剂和药品，安全性高、抗原性小，所 得载体支架结构完整、更接近于天然角膜等特点，且其生产成本低，适于 规模化生产和临床推广应用。因此所制备出的组织工程角膜载体支架具有 透明性好、结构致密、机械性强、与人角膜种子细胞生物相容性好、易于 人角膜种子细胞贴附和生长等特点。因而适于批量生产，从而满足了组织 工程角膜所用大量载体支架的需要。

本发明制备的组织工程角膜载体支架广泛地应用于组织工程角膜上 皮、基质、内皮、前板层半角膜(上皮-基质)、后板层半角膜(基质-内皮) 及全层角膜的载体支架，从而满足组织工程角膜批量生产的需要。

本发明所制备的组织工程角膜载体支架对新西兰兔、比格犬眼进行角 膜板层移植发现，可达到使移植眼的角膜保持透明660天以上，故也可被 用作人角膜基质的替代物而用于未累及全层的角膜溃疡的临床移植和治 疗。即本发明所制备出的组织工程角膜载体支架可以作为人角膜基质的替 代物直接应用于未累及全层的角膜溃疡的临床移植和治疗。

具体实施方式

本发明涉及的各种溶液的配制方法：

1、上述低渗溶液的配制方法：取超纯水800毫升，加入1～3克KCl， 完全溶解后用超纯水定容至1000毫升；

2、上述漂洗缓冲液的配制方法：取超纯水800毫升，加入15.764克 Tris-HCl，调pH值至7.5，定容至1000毫升；

3、上述DNA-RNA酶溶液的配制方法：取超纯水800毫升，加入15.764 克Tris-HCl，2.38克MgCl₂，0.111克CaCl₂，调pH值至7.5，定容至1000 毫升，4℃备用；使用前取100毫升加入500～700单位DNase I和500～700 微克RNase A，即为本发明的DNA-RNA酶溶液；

4、角膜专用交联剂溶液的配制：取超纯水80毫升，加入10～20克右 旋糖苷，再加入0.1～0.2克核黄素，完全溶解后用超纯水定容至100毫升， 完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过滤，即为本发明的角膜专用交联剂溶 液；

为了提高角膜载体支架的透明度并防止细菌滋生，又将上述交联剂溶 液的配方添加了1～2克妥布霉素。

本发明的具体实施步骤：

1、角膜片的取材与溶胀：取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲 洗干净后，用微型角膜刀切取厚度100～500微米的带有前弹力层或后弹力 层的角膜片；再将角膜片浸入低渗溶液中，于37℃摇床中溶胀处理2～3小 时；之后，用镊子小心剥去角膜的上皮层，获得角膜基质片；

2、角膜基质片的反复冻融破碎细胞：将角膜基质片放置在盛有漂洗缓 冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1～2小时，之后于37℃融化10～30 分钟，冻融重复3～5遍，以破碎角膜基质片内的细胞；然后用漂洗缓冲液 漂洗2次，每次15～20分钟；

3、角膜基质片的酶处理去除残留核酸物质：将破碎细胞的角膜基质片 放入DNA-RNA酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理2～4小时后，用漂 洗缓冲液漂洗2次，每次15～20分钟，再用超纯水漂洗15～20分钟，获得 脱细胞角膜基质片；

4、脱细胞角膜基质片的交联：将脱细胞角膜基质片浸入角膜专用交联 剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理20～30分钟后，将脱细胞角膜基 质片平铺于24孔板中，放置到波长310～400纳米的紫外灯下方2～10厘米 处，照射交联20～30分钟；然后使用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，每 次15～20分钟，再用超纯水漂洗2次，每次15～20分钟；

5、交联脱细胞角膜基质片的风干和灭菌：交联漂洗后的脱细胞角膜基 质片平铺于24孔培养板中，置于超净台无菌风干48～72小时；最后使用剂 量14～25千戈瑞的电离射线进行电离辐射灭菌，即制成了组织工程角膜载 体支架。

实施例1

先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角膜 刀切取100微米厚度的带有前弹力层的角膜片；

再取超纯水800毫升，加入1克KCl，完全溶解后用超纯水定容至1000 毫升，配制成低渗溶液；用低渗溶液漂洗角膜片，将其浸入低渗溶液中， 于37℃摇床中溶胀2小时；之后，用镊子小心剥去角膜片的上皮层，获得 角膜基质片；

然后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，完全溶解后，调pH 值至7.5，用超纯水定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜基质片 放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1小时，之后 于37℃融化10分钟，冻融重复3遍；再用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15 分钟；

之后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，2.38克MgCl₂，0.111 克CaCl₂，调pH值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫 升加入500单位DNase I和500微克RNase A，配制成DNA-RNA酶溶液， 将冻融漂洗后的角膜基质片放入DNA-RNA酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢 摇动处理2小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次 15分钟，获得脱细胞角膜基质片；

再取超纯水80毫升，加入10克右旋糖苷，再加入0.1克核黄素，完 全溶解后用超纯水定容至100毫升，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过 滤，配制成角膜专用交联剂溶液；将脱细胞角膜基质片浸入角膜专用交联 剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理20分钟，立即平铺于平皿中， 放置到波长310～400纳米的紫外灯下方10厘米处，照射交联20分钟；然 后使用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，再用超纯水漂洗2次，每次15分 钟；

最后将交联漂洗后的脱细胞角膜基质片平铺于24孔板中，置于超净台 风干48小时后使用20千戈瑞剂量进行电离辐射进行灭菌，即制成组织工 程角膜上皮载体支架。

实施例2

先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角膜 刀切取300微米厚度的带有前弹力层的角膜片；

再取超纯水800毫升，加入2克KCl，完全溶解后用超纯水定容至1000 毫升，配制成低渗溶液；用低渗溶液漂洗角膜片，将其浸入低渗溶液中， 于37℃摇床中溶胀2.5小时；之后，用镊子小心剥去角膜片的上皮层，获 得角膜基质片；

然后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，完全溶解后，调pH 值至7.5，用超纯水定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜基质片 放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1.5小时，之后 于37℃融化15分钟，冻融重复4遍；再用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15 分钟；

之后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，2.38克MgCl₂，0.111 克CaCl₂，调pH值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫 升加入600单位DNase I和600微克RNase A，配制成DNA-RNA酶溶液， 将冻融漂洗后的角膜基质片放入DNA-RNA酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢 摇动处理3小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次 15分钟，获得脱细胞角膜基质片；

再取超纯水80毫升，加入10克右旋糖苷，再加入0.1克核黄素和1 克妥布霉素，完全溶解后用超纯水定容至100毫升，完全溶解后用0.22微 米的微孔滤膜过滤，配制成角膜专用交联剂溶液；将脱细胞角膜基质片浸 入角膜专用交联剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理25分钟，立即 平铺于平皿中，放置到波长310～400纳米的紫外灯下方6厘米处，照射交 联25分钟；然后使用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，再用超纯水漂洗2 次，每次20分钟；

最后将交联漂洗后的脱细胞角膜基质片平铺于24孔板中，置于超净台 风干60小时后使用25千戈瑞剂量进行电离辐射进行灭菌，即制成组织工 程角膜基质或前板层半角膜(上皮-基质)载体支架。也可作为人角膜基质 的替代物直接应用于未累及全层的角膜溃疡的临床移植和治疗。

实施例3

先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角膜 刀切取500微米厚度的带有后弹力层的角膜片；

再取超纯水800毫升，加入3克KCl，完全溶解后用超纯水定容至1000 毫升，配制成低渗溶液；用低渗溶液漂洗角膜片，将其浸入低渗溶液中， 于37℃摇床中溶胀3小时；之后，用镊子小心剥去角膜的内皮层，获得角 膜基质片；

然后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，完全溶解后，调pH 值至7.5，用超纯水定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜基质片 放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻2小时，之后 于37℃融化30分钟，冻融重复5遍；再用漂洗缓冲液漂洗2次，每次20 分钟；

之后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，2.38克MgCl₂，0.111 克CaCl₂，调pH值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫 升加入700单位DNase I和700微克RNase A，配制成DNA-RNA酶溶液； 将冻融漂洗后的角膜基质片放入DNA-RNA酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢 摇动处理4小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次 20分钟，获得脱细胞角膜基质片；

再取超纯水80毫升，加入20克右旋糖苷，再加入0.2克核黄素和2 克妥布霉素，完全溶解后用超纯水定容至100毫升，完全溶解后用0.22微 米的微孔滤膜过滤，配制成角膜专用交联剂溶液；将脱细胞处理的角膜基 质片浸入角膜专用交联剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理30分钟， 立即平铺于平皿中，放置到波长310～400纳米的紫外灯下方2厘米处，照 射交联30分钟；然后使用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，再用超纯水漂 洗2次，每次20分钟。

最后将交联漂洗的脱细胞角膜基质片平铺于24孔板中，置于超净台风 干72小时后使用25千戈瑞剂量进行电离辐射进行灭菌，即制成组织工程 后板层半角膜(基质-内皮)或全层角膜载体支架。

实施例4

先取新鲜猪眼球，用0.9％(w/v)生理盐水冲洗干净后，用微型角膜 刀切取100微米厚度的带有后弹力层的角膜片；

再取超纯水800毫升，加入1克KCl，完全溶解后用超纯水定容至1000 毫升，配制成低渗溶液；用低渗溶液漂洗角膜片，将其浸入低渗溶液中， 于37℃摇床中溶胀2小时；之后，用镊子小心剥去角膜片的内皮层，获得 角膜基质片；

然后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，完全溶解后，调pH 值至7.5，用超纯水定容至1000毫升，配制成漂洗缓冲液；将角膜基质片 放置在盛有漂洗缓冲液的50毫升离心管中，在-80℃冰箱冻1小时，之后 于37℃融化10分钟，冻融重复3遍；再用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15 分钟；

之后取超纯水800毫升，加入15.764克Tris-HCl，2.38克MgCl₂，0.111 克CaCl₂，调pH值至7.5，定容至1000毫升，4℃备用；使用前取100毫 升加入500单位DNase I和500微克RNase A，配制成DNA-RNA酶溶液， 将冻融漂洗后的角膜基质片放入DNA-RNA酶溶液，置37℃恒温摇床缓慢 摇动处理2小时后，用漂洗缓冲液漂洗2次，再用超纯水漂洗1次，每次 15分钟，获得脱细胞角膜基质片；

再取超纯水80毫升，加入10克右旋糖苷，再加入0.1克核黄素，完 全溶解后用超纯水定容至100毫升，完全溶解后用0.22微米的微孔滤膜过 滤，配制成角膜专用交联剂溶液；将脱细胞角膜基质片浸入角膜专用交联 剂溶液中，置37℃恒温摇床缓慢摇动处理20分钟，立即平铺于平皿中， 放置到波长310～400纳米的紫外灯下方10厘米处，照射交联20分钟；然 后使用0.9％(w/v)生理盐水漂洗2次，再用超纯水漂洗2次，每次15分 钟；

最后将交联漂洗后的脱细胞角膜基质片平铺于24孔板中，置于超净台 风干48小时后使用20千戈瑞剂量进行电离辐射进行灭菌，即制成组织工 程角膜内皮载体支架。

本发明通过上述的几个实施例，展示了本发明制备方法可广泛地应用 于组织工程角膜上皮、基质、内皮、前板层半角膜(上皮-基质)、后板层 半角膜(基质-内皮)及全层角膜的载体支架的制备，从而满足了大量组织 工程角膜的需求。