三七皂苷R1对小肠缺血再灌注损伤的保护作用

技术领域

本发明涉及一种药物的应用，特别涉及三七皂苷R1小肠缺血再灌注损伤的 保护作用。

背景技术

小肠缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤可在多种情况下发生， 例如肠系膜上动脉栓塞、小肠肠管移植、心肺分流术、腹主动脉瘤手术、创伤或 失血性休克。小肠缺血再灌注能够导致败血症、全身炎症反应综合征和多器官衰 竭，发生率和死亡率高。

氧自由基的产生和炎症级联反应的启动长久以来被认为是引起小肠缺血再 灌注损伤的两个主要机制。以氧化应激和炎症反应为靶点的治疗一向是以往研究 的重点。然而，结果仍令人无法满意。由于氧化应激和炎症级联反应是一个复杂、 多因素的过程，并且它们主要生于再灌注阶段，所以一旦级联反应被起始就难以 再进行干预和阻断。因此，有效的治疗手段应是在早期通过多条途径干预其病理 过程。

缺血再灌注（I/R）损伤以缺血为起点，这造成了组织缺氧以及营养失调， 导致了以三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）减少为特征的能量代谢紊 乱，从而影响了一系列ATP参与的生命活动，包括阳离子泵功能、纤维型肌动蛋 白的聚合等。阳离子泵的紊乱促使细胞死亡，而纤维型肌动蛋白的解聚导致内皮 和上皮细胞屏障功能障碍。在小肠I/R损伤过程中，能量代谢的紊乱已经受到重 视并作为一种评估小肠损伤、I/R或小肠移植后肠活力的标准。然而，目前没有 通过调节能量代谢保护或治疗小肠I/R损伤的报道。

三七皂苷R1结构式如下：

【英文名称】NotoginsenosideR1

【分子式】C47H80O18

【分子量】933.131

提取自三七的干燥根及根茎，其功能为：散瘀止血，消肿定痛。

三七皂苷R1（NotoginsenosideR1，R1，图1A）是三七的主要有效成分之 一，三七作为治疗各种心血管疾病的有效中药，在我国已被长期应用。R1具有 抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用。我们早先已在体内研究证明，它能够缓解由肠缺 血再灌注引起的肝脏微循环紊乱。已有研究观察了三七皂苷主要成份人参皂苷 Rb1(Rb1)、人参皂苷Rg1(Rg1)以及

三七皂苷R1(R1)对LPS连续静脉给药引起的大鼠肠系微循环障碍的改善 作用及其原理。但是，R1对在体小肠缺血再灌注损伤的保护作用至今仍无报道。 本发明意外的发现，三七皂苷R1用于可以治疗小肠缺血再灌注引起的损伤，本 发明发现其是通过三七皂苷R1维护小肠屏障系统完整而实现的，是通过三七皂 苷R1抑制白细胞侵润和NF-κB激活，是通过三七皂苷R1维持小肠能量代谢平 衡而实现的。

发明内容

本发明提供一种七皂苷R1的新的治疗用途，特别是用三七皂苷R1治疗小肠 缺血再灌注引起的损伤。

为此，本发明提供三七皂苷R1用于制备治疗缺血再灌注引起的小肠粘膜损 伤、肠管炎性细胞浸润和/或微血管通透性增高药物中的应用；

所述应用是通过三七皂苷R1抑制IκBα降解和NF-κBP65向细胞核转移， 进而，抑制了炎性因子释放实现的；

所述应用是通过三七皂苷R1抑制白细胞游出微血管，向组织中浸润实现的；

所述应用是通过三七皂苷R1抑制细胞凋亡实现的；

所述应用是通过三七皂苷R1抑制血管细胞间紧密连接蛋白的降解，抑制血 浆白蛋白漏出实现的；

所述应用是通过三七皂苷R1调节ATP5D，增加肠管组织中ATP含量,促进 肠粘膜上皮细胞修复实现的。

三七皂苷R1，一般用三七经提取分离获得，纯度一般在10%-98%，其提取分离过 程属于现有技术。

本发明所述的三七皂苷R1包括市售的纯度在10%-98%的三七皂苷R1，也可 通过现有技术提取分离。

优选的本发明的纯度在50%以上，优选80%以上，最有选90%以上。

本发明实验中所使用的三七皂苷R1为市场上购买得到，纯度在90%以上。

本发明所述的应用。其中所述药物是指包括三七皂苷R1的药物组合物，是 用上述所述的三七皂苷R1作为药物活性成分制备成的药物制剂组合物。优选以 三七皂苷R1为唯一活性成分。

本发明的药物制剂组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中三七 皂苷R1作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9%，其 余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂组合物，以单位剂量形式存在，所述 单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶， 颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

本发明的药物制剂组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、 糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、 口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注 射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。

本发明的中药制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、 填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时 可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩 解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润 滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合 可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或 酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种 液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、 明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂， 例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体（它们可以包括食用 油），例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐 剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常 规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据 载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质 溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。 辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高 其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的中药制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、 硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA 钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、 磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右 旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、 藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、 表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、 硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次 1-20剂，如：1-20袋或粒或片，每剂1mg-1000mg。

本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的：

材料和方法

药品和试剂

三七皂苷R1购自风山渐药物公司（昆明，中国）。ATP、ADP、AMP和丙二 醛（malondialdehyde，MDA）ELISA试剂盒均购自环亚生物技术公司（北京，中 国）。抑制κB-α（inhibitory kappaB-α，I-κBα）和核因子-kB（nuclear  factor kappa b，NF-kB）p65抗体购自Cell Signaling Technology公司 （Beverly，MA，美国）。ATP5D抗体购自Santa Cruz公司（CA，美国）。髓过氧 化物（myeloperoxidase，MPO）及核浆蛋白提取试剂盒购自Thermo Scientific 公司（CA，美国）。

实验动物

雄性SD大鼠（200-220g，北京大学医学部实验动物中心，北京，中国）饲 养在恒温（20±2°C）环境中，12h循环光照，喂以常规饮食和水。动物饲 养遵照北京大学动物研究委员会所规定之制度，实验过程经北京大学医学部动物 实验伦理委员会批准(LA2010-001)。

手术过程

大鼠术前16h禁食给水。戊巴比妥钠（60mg/kg）腹腔注射麻醉后，右侧 股静脉插管用以注射药物。小肠缺血再灌注模型的建立：大鼠仰卧固定，沿腹中 线开腹，将肠置于身体右侧，分离肠系膜上动脉右结肠动脉分支近端处，并用无 伤动脉夹夹闭90min，手术期间动物置于37°C恒温板上，小肠用温湿棉花覆 盖，缺血期间将小肠还纳回腹腔。缺血期结束，移除动脉夹，小肠血供恢复，以 动脉恢复搏动和肠壁恢复粉红色为标志。再灌60min或72h后取材从回盲部向 近端60cm的空肠组织，用预冷的生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干，储存在-80 °C冰箱留备组织和生物化学检测。另一组研究中，单独取各组大鼠（每组10 只）进行连续72h生存率的测定。

实验分组

大鼠随机分成10组，每组10只，分为以下几组：

假手术组（60min或72h）：股静脉连续滴注与前给药组等量生理盐水，并 接受照处理，包括开腹、分离肠系膜上动脉，但不夹闭。

本底组（60min或72h）：缺血前20min开始由股静脉连续滴注R1(10 mg/kg/h)至再灌60min结束，总共给药170min，除此之外与假手术组处理相 同。

I/R60min组：股静脉连续滴注生理盐水，夹闭肠系膜上动脉90min，再 灌60min。

R1+I/R60min组：大鼠如前述方法造模，缺血前20min开始由股静脉连 续滴注R1(10mg/kg/h)至再灌60min结束，总共给药170min。

I/R60min+R1组：大鼠如前述方法造模，再灌后20min开始由股静脉连 续滴注R1(10mg/kg/h)至再灌60min结束，总共给药40min。

I/R72h组：股静脉连续滴注生理盐水，夹闭肠系膜上动脉90min，再灌 72h。

R1+I/R72h组：手术及给药处理同R1+I/R60min组，此外，手术及给 药完毕缝合腹腔、结扎股静脉。

I/R72h+R1组：手术及给药处理同I/R60min+R1组，此外，手术及给 药完毕缝合腹腔、结扎股静脉。

R1的使用剂量参考以往的在体研究。本研究的药物均用生理盐水溶解，并 且全部大鼠接受液体连续滴注的速度均为2ml/h。

活体显微镜观察

大鼠麻醉后沿右侧股静脉插管（直径0.96mm聚乙烯管），仰卧位开腹，将 小肠取出并用温湿棉花固定，同时将大鼠侧卧位置于观察板上，然后连同观察板 一起将大鼠放在配有37°C恒温箱的倒置显微镜(TE2000-E，Nikon，东京，日本) 的载物台上，各组大鼠均选择回盲近端10-20cm的空肠，直径为35-50μm的 微静脉进行观察和记录。倒置显微镜接有一部彩色摄像机（JK-TU53H，Toshiba， 东京，日本）和高速摄影系统（Fastcam-ultima APX，Photron，东京，日本）， 图像均在20×物镜下记录。录制的小肠的微循环情况通过DVD刻录机（DVR-R25， Malata，厦门，中国）记录在DVD光盘上。肠壁表面用37°C生理盐水始终保持 湿润。在观察开始时，向大鼠股静脉缓慢注入异硫氰酸荧光素标记的白蛋白 （FITC-albumin，50mg/kg；Sigma，St.Louis，MO，美国），在各时间点以455 nm激发光为光源获得荧光图像。我们采用Image-Pro Plus(version6.0;Media  Cybernetics;Rockville,MD,美国)图像分析软件测定毛细血管后微静脉管外 和管内的荧光强度，用管外/管内荧光强度的比来表示白蛋白渗出的量[14]。为 了检测微静脉管径和红细胞流速，我们使用高速摄影机以1000幅/秒的速度记录 下血流情况，以25幅/秒的速度重放，使用Image-ProPlus软件，测量每个血 管在三个不同位置的管径和红细胞流速后取平均值[15]。

小肠血流量检测

大鼠沿腹中线开腹，暴露回盲近端10-20cm的空肠，用激光多普勒血流量 仪(PeriScanPIM3System；PERIMED，斯德哥尔摩，瑞典)分别于缺血前、缺血 末、再灌60min和再灌72h检测大小为2cm×1cm矩形框范围内的肠血流量。 扫描头位于平行于肠表面上方18cm的位置，扫描组织深度均为0.5mm，获得 的彩色图像用LDPIwin3.1软件分析，分析的数值代表测量范围内的平均血流量。

小肠大体和组织学损伤评估

再灌注60min后，用肉眼对各组大鼠的小肠进行损伤评分，评分标准参考 以往发表的文献[16]。相似地，我们制定了一个5分评分规则来评估再灌72h 小肠大体损伤的程度：0肠壁无充血、出血，粘膜无溃疡；1肠壁充血、出血， 粘膜无溃疡；2肠壁充血、出血,粘膜溃疡，面积<10%；3肠壁充血、出血,粘 膜溃疡，面积10-25%；4肠壁充血、出血,粘膜溃疡，面积25-50%；5肠壁充血、 出血,粘膜溃疡，面积>50%。

组织学损伤程度，我们将取下来的空肠展平并浸泡在4%的多聚甲醛中48h 固定，制成5μm厚的石蜡切片后HE染色。在镜下，每个切片取六个视野进行 盲法评分，标准参考Park评分，粘膜损伤程度分为0-8级[17]。相似地，我们 制定了一个8分评分规则来评估再灌72h小肠上皮损伤及再生程度：0正常绒 毛上皮；1绒毛形态正常，中央淋巴管扩张；2绒毛形态正常，毛细血管充血、 中央淋巴管扩张；3绒毛宽大，充血水肿，中央淋巴管扩张，小肠腺增生并沿绒 毛纵轴伸长；4新生的短绒毛，常伴充血水肿，小肠腺增生；5裸露的溃疡面上 单层上皮覆盖，小肠腺增生；6裸露的溃疡面上仅有单层上皮覆盖；7溃疡波及 粘膜下层；8溃疡波及肌层。

免疫组化测MPO和CD68

分别将再灌注60min或72h取材的肠管展平并浸泡在在4%的多聚甲醛中 固定。制备5μm厚的连续石蜡切片，脱蜡，0.3%H₂O₂淬灭内源性过氧化物酶 30min，0.1%TritonX-100浸泡20min增加通透性，5%山羊血清封闭30min 去除非特异性染色，加入一抗MPO抗体（Thermo Scientific，Fremont，CA，美 国）或CD68抗体（Abcam，Cambridge，MA，美国）或PBS（阴性对照）孵育过 夜，然后加入HRP标记的二抗并显色。取×100图像对阳性细胞数进行半定量评 估。

小肠组织MPO活性和MDA水平测定

MPO活性是提示多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils， PMNs）是否聚集的重要标志。我们采用髓过氧化物活性检测试剂盒（Invitrogen， Carlsbad，CA，美国）来测定：各组空肠组织均浆稀释并取50μL加入96孔板， 然后加入工作液室温孵育30min。激发光为485nm，发射光为530nm，用多功 能酶标仪(BIO-TEK，Winooski，VT，美国)读取吸光度。每空数值减去阴性对照 值去除背景荧光。MDA水平反映了组织脂质过氧化的程度[18]。各组组织制备匀 浆，按照MDA ELISA试剂盒（DZE30266；Huanya Biomedicine Technology，北 京，中国）规定步骤测定MDA含量。

小肠粘膜上皮细胞凋亡检测

再灌注60min或72h后，取空肠组织展平并固定于4%多聚甲醛，石蜡包 埋，用TUNEL法检测细胞凋亡[19]。用TUNEL试剂盒（Roche，巴塞尔，瑞士） 染色凋亡细胞，Hoechest33342（Invitrogen，Camarillo，CA，美国）复染细 胞核。在五个视野计数阳性细胞数，然后取平均值。

炎症因子检测

再灌注60min或72h后，从腹主动脉取血，3.8%的柠檬酸钠抗凝，离心机 （AllegraTM64R Centrifuge，Beckman-Coulter，Fullerton，CA，美国）4°C 1300×g10min分离血浆，储存在-80°C冰箱。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）， 白介素（IL）-1β，IL-6和IL-10的浓度分别通过ELISA试剂盒（Diaclone  Research，Cell Sciences，Canton，MA，美国）测定，测定步骤遵照试剂盒说 明书，所有样品均测复孔。

能量代谢的评估

再灌注60min或72h后，麻醉状态下取大鼠小肠，生理盐水洗净并用滤纸 吸干。组织经匀浆后离心，4°C20,000×g10min。上层清液用作ATP、ADP、 AMP测定，步骤遵照ELISA试剂盒说明书进行。

Western检测组织ATP5D、ATP5D、IκBα、NF-κB p65、ZO-1、occludin  and claudin-5表达水平

再灌注60min或72h后，麻醉状态下取大鼠小肠（约60cm），用预冷的 生理盐水灌洗肠腔，冲去内容物并用滤纸吸干，在冰上剪碎组织并加入10倍体 积预冷的蛋白裂解液（Cell Signaling Technology，Beverly，MA，美国），静 置后反复超声10s/次[20]。裂解产物物离心，取上清用BCA蛋白定量液（Thermo  Scientific，Fremont，CA，美国）进行蛋白定量。检测核NF-κB p65水平时， 需用NE-PER核浆蛋白提取试剂盒（Thermo Scientific，Fremont，CA，美国） 提取核蛋白。在每个聚丙烯酰胺凝胶孔里加入等量的各组蛋白，并进行电泳分离， 将分离好的蛋白条带通过电转转移至PVDF膜上（Millipore，Bedford，MA，美 国），200mA60min。膜在5%的脱脂奶中室温封闭1h，以去除非特异性结合位 点，然后加入用TBST+5%脱脂奶粉稀释的一抗（1:1000）4°C孵育过夜。孵育好 的膜用TBST洗三次，每次10min，然后入用TBST+5%脱脂奶粉稀释的二抗 （1:5000）室温孵育1h，滴加发光剂显色。使用图像分析软件Quantity One （Bio-Rad，Richmond CA，美国）来分析条带，其大小量化为光密度值，用平均 区域密度来表示。所有蛋白条带大小均为与内参β-actin或组蛋白H3所比而得 的相对值。每个数据的得出至少使用两个不同的样本进行至少三次独立实验。

数据分析

所有数据皆通过SPSS15.0软件（SPSS Inc，Chicago，IL，美国）进行分 析。生存率结果分析采用Kaplan–Meier对数秩检验。其他结果均以均数±标准 误（X±SEM）表示，各组之间均数比较采用单因素方差分析（Tukey检验）。 涉及免疫组织化学的实验中，数据代表至少三次独立实验结果。因此所有的数据 为三次独立实验各自均值的平均值，P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

三七皂苷R1减少小肠缺血再灌注引起的组织损伤，白细胞浸润和凋亡

本研究发现，静脉给予生理盐水的假手术组大鼠在72h期间全部存活。而 同样给予生理盐水且SAM夹闭90min的大鼠存活率大幅下降至30%，可看到再 灌注12h内（死亡大部分立即发生于再灌注开始后的1-4小时），10只I/R模 型组大鼠死亡了5只，直到再灌注第三天总共死亡了7只。R1前、后给药组的 生存率较模型组要高，分别为80%和50%，但与I/R模型组生存率相比只有前给 药组具有统计学意义（图1B）。

本实验分别于再灌注60min和72h对各组大鼠进行肉眼下的病理学损伤评 分。从肉眼观察，假手术和本底组大鼠的肠壁呈现健康的粉色，无明显内容物（图 1C1），肠管亦无扩张现象。而I/R模型组大鼠的小肠在再灌注60min时有明显 的出血和水肿，肠管内有血状内容物，而再灌注72h时从肠壁上可见肠腔内粘 膜有大量溃疡存在（图1C2，C5）。从肉眼上来看R1前、后给药组在再灌注60min 时与I/R模型组相比有一定改善，而再灌注72h时两者均明显减轻了小肠的溃 疡情况（图1C3，C4，C6，C7；评分见图1D）。

图1R1对小肠I/R后大体损伤情况和72h生存率的影响。（A）R1的化学 结构。（B）各组大鼠小肠I/R后72h内生存率变化，R1前给药能减少I/R引起 的大鼠死亡。（C）各组大鼠空肠肠壁。（D）小肠I/R损伤的大体评分。R1前、 后给药均明显减轻再灌注所引起的肉眼损伤。数据表示为均数±标准误（n=10）。 *表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

从HE染色的组织切片观察，假手术和本底组大鼠的肠粘膜上皮完整，杯状 细胞清晰可见（图2A1）。而再灌注60min时，I/R模型组大鼠的肠粘膜上皮 严重受到破坏，几乎全部脱落并伴有严重的出血（图2A2；评分见图3A）。R1 前、后给药组的小肠绒毛缩短、上皮严重脱落，但仍保留有固有层结构，从肠腔 内脱落坏死物的量来看，后给药组较前给药组绒毛脱落的更加严重（图3，4）。 再灌注72h时，I/R模型组粘膜溃疡形成（图2A5），前、后给药组绒毛结构 均有明显的恢复和再生，后给药组的绒毛中仍有少量充血（图2A6，A7；评分 见图3A）。

MPO是PMNs的标志酶，我们分别检测了它的免疫组织化学定位和活性。从 免疫组化染色切片可见，假手术组小肠组织只含有极少MPO阳性细胞（图2B1）。 再灌60min时，I/R模型组和前、后给药组的小肠组织中PMNs浸润均显著增加 （图2B2-4，图3B）。到了再灌注72h，I/R模型组阳性细胞数较再灌60min 时有所减少，但仍然高于假手术组（图2B5，图3B），而R1前、后给药组的阳 性细胞数明显减少接近正常水平（图2B6，B7，图3B）。并且，从MPO的活性 测定结果来看，各组变化趋势与之相似，这证明三七皂苷R1前、后给药能有效 抑制再灌注72h白细胞的浸润（图3E）。

单核细胞浸润是缺血再灌注损伤发生发展的一个关键步骤。图2C为CD68 的免疫组化染色结果。与MPO染色结果相似，假手术组小肠组织内含有少量的 CD68阳性细胞（图2C1），再灌60min时I/R模型组和前、后给药组的小肠组 织中CD68细胞浸润均显著增加（图2C2-4，图3C）。而再灌注72h后，随着 MPO阳性细胞的减少，I/R模型组和前、后给药组的小肠组织中CD68阳性细胞 量反而增加，但R1前、后给药组升高的趋势没有I/R模型组明显（图2C5-7， 图3C）。

另外，MDA被看作是脂质过氧化的指示剂，我们检测了它在小肠组织中的含 量，其变化趋势与MPO测定结果相类似（图3F）。

本实验采用TUNEL法来评估小肠组织中上皮细胞的凋亡情况。假手术组仅有 少量凋亡细胞（图2D1）。缺血再灌60min，I/R模型组绒毛根部出血大量阳性 细胞，说明缺血再灌后随着坏死组织的不断脱落，细胞仍然向上皮下组织不断凋 亡（图2D2），而前、后给药组的阳性细胞数较少并且大部分集中在绒毛的上皮 组织中（图2D3，4）。再灌注72h，随着炎症的发展，I/R模型组仍有大量凋 亡围绕着溃疡区域细胞产生（图2D5）而给予R1处理后，TUNEL阳性细胞数明 显减少（图2D6，D7，图3D）。

图2R1对小肠I/R组织学损伤、白细胞浸润和凋亡的影响。（A）各组小肠 组织HE染色典型图，Bar=100μm。（B，C）各组小肠组织中MPO和CD68免疫 组织化学定位，箭头所指为阳性细胞，Bar=100μm。（D）TUNEL染色结果。1： 假手术组，2：I/R60min组，3：R1+I/R60min组，4：I/R60min+R1组， 5：I/R72h组，6：R1+I/R72h组，7：I/R72h+R1组。

图3各组小肠组织学损伤评分、白细胞浸润和细胞凋亡情况、组织MPO活 性及MDA含量。（A）小肠缺血再灌注后组织学损伤评分。（B，C）MPO、MDA免疫 组化阳性细胞定量。（D）TUNEL阳性细胞定量。（E）MPO活性测定。（F）小肠组 织中MDA水平测定。数据表示为均数±标准误（n=6）。*表示与假手术组相比P< 0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

三七皂苷R1保护小肠微循环，减低微血管渗透性，增加微循环血流量

本实验用动态可视化技术来检测各组小肠微循环情况。从微静脉白蛋白渗出 情况来看，在再灌0-60min的时程里，I/R模型与假手术组相比微静脉白蛋白 渗出急剧增加，说明微血管的渗透性增高。而R1前、后给药组，在再灌后40-60 min的时程里，白蛋白渗出较I/R模型明显少，说明R1前、后给药能够抑制I/R 引起的微静脉渗透性的持续增高（图4A，B）。本底组与假手术组的白蛋白渗出 情况并无差别。肠壁微静脉FITC-白蛋白渗出定量结果见图4B。I/R模型微静 脉管径在再灌开始便持续收缩，后给药在再灌20min是明显收缩然后渐渐趋于 舒张，前给药组肠壁微静脉在整个过程中无剧烈变化。而红细胞流速的变化在 I/R模型组和R1前、后给药组之间并无明显差异，均是仅在再灌刚开始时有一 瞬间的降低，稍后又迅速恢复正常水平（图4C，D）。

图4E结果显示，激光多普勒血流量仪测定各组小肠壁血流量情况。缺血末 期I/R模型组和R1前、后给药组肠壁表面血流量无差异。而有趣的是，再灌60 min时，给予R1处理的各组血流量有恢复的趋势，尽管从统计角度看并无差异。 再灌72h时，I/R模型组肠壁血流量仍维持在较低水平，灌流量恢复至正常水 平的30%，R1前、后给药组肠壁血流量显著升高，灌流量分别恢复至正常水平的 62%和59%（图4E，F）。

图4R1对I/R后微静脉白蛋白渗出、管径、红细胞流速和血流量的影响。 （A）各组静脉白蛋白渗出典型图，Bar=100μm。（B）白蛋白渗出百分比定量。 （C，D）微静脉管径和红细胞流速变化。（E）小肠表面血流量情况典型图。（F） 小肠表面血流量定量。数据表示为均数±标准误（n=10）。*表示与假手术组相比 P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

三七皂苷R1抑制小肠缺血再灌引起的炎症反应

从Western blot的结果来看，假手术组和本底组小肠组织中均可检测到I κBα的显著表达。而在I/R60min和72h组中IκBα的水平明显减少（图 5A-F）。此外，与假手术组相比，NFκB p65亚单位的核转位也显著增加。而在 R1前、后给药组中，IκBα的降解受到抑制（图5B，E），同时p65的核转位 也被抑制（图5C，F），而前给药的抑制作用比后给药更加显著。

图5三七皂苷R1对缺血再灌后小肠组织中IκBα和核NF-κB p65表达水 平的影响。再灌注60min（A）和再灌注72h（D）R1对IκBα表达量和核NF-κB p65转位影响的Western典型图。B、C、E、F中的光密度值代表四只大鼠的平均 水平。数据表示为均数±标准误（n=4）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表 示与缺血再灌注组相比P<0.05。

缺血再灌引起的肠损伤过程中有大量炎症介质释放。检测血浆中炎症介质的 结果显示，与假手术组相比，缺血再灌注组血浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6 在再灌60min和72h时显著升高，而R1前、后给药能显著改善（图6A-C）。 此外，在再灌60min时，I/R模型组和R1前、后给药组抗炎因子IL-10的含量 均明显高于假手术组，而I/R模型组和R1前、后给药组再灌72h时血中的IL-10 释放量又进一步增强，R1前、后给药组增强的更加显著（图6D）。

图6R1对I/R后血浆中细胞因子的影响。小肠缺血再灌后血浆中TNF-α、 IL-1β、IL-6和IL-10的水平与假手术组相比显著升高（A-D）。R1显著减少TNF- α、IL-1β、IL-6水平（A-C），增加再灌72hIL-10的水平（D）。数据表示 为均数±标准误（n=10）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注 组相比P<0.05。

能量代谢

为了评估不同情况下小肠组织的能量代谢，我们采用ADP/ATP和AMP/ATP 的比值来比较各组之间差异。图7A和B表明，与假手术组相比，I/R60min和 72h组的组织中ADP/ATP和AMP/ATP比值显著增高，说明能量代谢平衡被打破， 反应向ATP分解代谢方向进行。有趣的是R1前、后给药均能在再灌60min和 372h显著抑制反应向ADP生产方向倾斜，而前给药还能抑制反应向AMP生成的 方向进行。而后给药无论在再灌60min还是72h时，AMP/ATP的比值与模型组 均无差异。

我们接着检测了组织中ATP合酶的一个亚单位ATP5D的表达水平。图7C 和D表明，与假手术组相比，I/R60min和72h组的组织中ATP5D表达水平 下降。R1前、后给药均能在再灌72h抑制此过程，而前给药在再灌60min就 能够显著提高ATP5D的表达水平，后给药在再灌60min时对ATP5D的表达无 作用。

图7三七皂苷R1对缺血再灌后小肠组织中能量代谢的影响。（A，B）R1对 小肠缺血再灌后组织中ADP/ATP和AMP/ATP变化比例的影响。（C，D）缺血再灌 后各组小肠中ATP5D表达情况。数据表示为均数±标准误（n=10）。*表示与假手 术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

三七皂苷R1改善缺血再灌注造成的紧密连接损伤

本实验采用Westernblot的方法来检测小肠组织中紧密连接蛋白ZO-1， occludin和claudin-5的表达水平。图8A-D表明，I/R60min时组织中的 ZO-1，occludin和claudin-5表达水平下降，R1前给药能扭转此现象，而后 给药则不能。图8E-H表明，I/R72h时，I/R模型组组织中的ZO-1，occludin 和claudin-5的表达水平同样下降，而R1前、后给药均能扭转此现象。

图8三七皂苷R1对缺血再灌后小肠紧密连接蛋白的影响。再灌注60min（A） 和再灌注72h（E）R1对ZO-1,occludin and claudin-5表达量变化影响的 Western典型图。B、C、D和F、G、H为每种蛋白各自的光密度值分析数据表示 为均数±标准误（n=4）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注 组相比P<0.05。

本研究的主要发现有以下几点：（1）R1能有效缓解大鼠小肠I/R损伤—— 肉眼及组织学损伤的改善和生存率的改善；（2）R1能够改善I/R后微血管的高 渗透性，减少紧密连接的断裂，抑制NF-κB的激活和后续的炎症反应以及凋亡； （3）最重要的，本研究指出缺血再灌减低了小肠中ATP5D的表达，它是ATP 合成酶亚单位之一，提示由于ATP5D低表达导致的能量衰竭参与了I/R引发的 小肠损伤过程。而R1能够抑制ATP5D的减少，因此这是R1作用可能的靶点之 一。本研究指出R1能够通过多种途径减轻由再灌注引起的小肠损伤，这些途径 包括维护小肠屏障系统完整，抑制白细胞侵润和NF-κB激活，维持小肠能量代 谢平衡。而R1是通过调节ATP5D的途径来调节能量代谢的。这些结果为三七皂 苷R1成为临床上治疗小肠I/R损伤的治疗手段提供了新的科学依据。

参考文献

1.Pierro A,Eaton S.Intestinal ischemia reperfusion injury and multisystem organ  failure.Semin Pediatr Surg2004;13:11-7.

2.Cerqueira NF,Hussni CA,Yoshida WB.Pathophysiology of mesenteric  ischemia/reperfusion:a review.Acta Cir Bras2005;20:336-43.

3.Acosta,S.Epidemiology of mesenteric vascular disease:clinical implications. Semin Vasc Surg2010;23:4-8.

4.Vollmar B,Menger MD.Intestinal ischemia/reperfusion:microcirculatory  pathology and functional consequences.Langenbecks Arch Surg2011;396:13-29.

5.Mallick IH,Yang W,Winslet MC,et al.Ischemia-reperfusion injury of the  intestine and protective strategies against injury.Dig Dis Sci2004;49:1359-77.

6.Yasuhara H.Acute mesenteric ischemia:the challenge of gastroenterology.Surg  Today2005;35:185-95.

7.Sato A,Kuwabara Y,Sugiura M,et al.Intestinal energy metabolism during  ischemia and reperfusion.J Surg Res1999;82:261-7.

8.Yamada T, Taguchi T, Suita S. Energy metabolism and tissue blood flow as  parameters for assessment of graft viability in rat small bowel transplantation. J  Pediatr Surg 1996;31:1475-81.

9.Sun B, Xiao J, Sun XB, et al. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction  in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt  signaling. Br J Pharmacol 2013;168:1758-70.

10.Liu WJ, Tang HT, Jia YT, et al. Notoginsenoside R1 attenuates renal  ischemia-reperfusion injury in rats. Shock 2010;34:314-20.

11.Zhang HS, Wang SQ. Notoginsenoside R1 inhibits TNF-alpha-induced  fibronectin production in smooth muscle cells via the ROS/ERK pathway. Free  Radic Biol Med 2006;40:1664-74.

12.Zhang WJ, Wojta J, Binder BR. Notoginsenoside R1 counteracts  endotoxin-induced activation of endothelial cells in vitro and endotoxin-induced  lethality in mice in vivo. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:465-74.

13.Chen WX, Wang F, Liu YY, et al. Effect of notoginsenoside R1 on hepatic  microcirculation disturbance induced by gut ischemia and reperfusion. World J  Gastroenterol 2008;14:29-37.

14.Alfieri A, Watson JJ, Kammerer RA, et al. Angiopoietin-1 variant reduces  LPS-induced microvascular dysfunction in a murine model of sepsis. Crit Care  2012;16:R182 [Epub ahead of print].

15.Zhao N, Liu YY, Wang F, et al. Cardiotonic pills, a compound Chinese medicine, protects ischemia-reperfusion-induced microcirculatory disturbance and  myocardial damage in rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;298:H1166-76.

16.Zhao X, Town JR, Yang A, et al. A novel ELR-CXC chemokine antagonist  reduces intestinal ischemia reperfusion-induced mortality, and local and remote  organ injury. J Surg Res 2010;162:264-73.

17.Salehi P, Madsen K, Zhu J, et al. Alleviating Ischemia-Reperfusion Injury in  Small Bowel. Am J Transplant 2004;4:728-37.

18.Campolo M, Di Paola R, Impellizzeri D, et al. Effects of a polyphenol present in  olive oil,oleuropein aglycone,in a murine model of intestinal  ischemia/reperfusion injury.J Leukoc Biol2013;93:277-87.

19.Liu KX,Chen SQ,Huang WQ,et al.Propofol Pretreatment Reduces Ceramide  Production and Attenuates Intestinal Mucosal Apoptosis Induced by Intestinal  Ischemia/Reperfusion in Rats.Anesth Analg2008;107:1884-91.

20.Grootjans J,Lenaerts K,Derikx JP,et al.Human intestinal  ischemia-reperfusion-induced inflammation characterized:experiences from a  new translational model.Am J Pathol2010;176:2283-91.

21.Olanders K,Sun Z, A,et al.The effect of intestinal ischemia and  reperfusion injury on ICAM-1expression,endothelial barrier function,neutrophil  tissue influx,and protease inhibitor levels in rats.Shock2002;18:86-92.

22.Sun Z,Wang X,Deng X,et al.Beneficial effects of lexipafant,a PAF antagonist  on gut barrier dysfunction caused by intestinal ischemia and reperfusion in rats. Dig Surg2000;17:57-65.

23.Turner JR.Intestinal mucosal barrier function in health and disease.Nat Rev  Immunol2009;9:799-809.

24.Suzuki T.Regulation of intestinal epithelial permeability by tight junctions.Cell  Mol Life Sci2013;70:631-59.

25.Unno N,Menconi MJ,Salzman AL,et al.Hyperpemeability and ATP depletion  induced by chronic hypoxia or glycolytic inhibition in Caco-2BBe monolayers. Am J Physiol1996;270:G1010-21.

26.Menconi MJ,Salzman AL,Unno N,et al.Acidosis induces hyperpermeability in  Caco-2BBe cultured intestinal epithelial monolayers.Am J Physiol 1997;272:G1007-21.

27.Wattanasirichaigoon S,Menconi MJ,Delude RL,et al.Effect of mesenteric  ischemia and reperfusion or hemorrhagic shock on intestinal mucosal  permeability and ATP content in rats.Shock1999;12:127-33.

28.Lin SQ,Wei XH,Huang P,et al.QiShenYiQiprevents cardiac  ischemia-reperfusion injury via energy modulation.Int J Cardiol2012;pii: S0167-5273(12)01417-9.doi:10.1016/j.ijcard.2012.10.042[Epub ahead of print].

29.Schoenberg MH,Poch B,Younes M,et al.Involvement of neutrophils in  postischaemic damage to the small intestine.Gut1991;32:905-12.

30.Spehlmann ME,Eckmann L.Nuclear factor-kappa B in intestinal protection and  destruction.Curr Opin Gastroenterol2009;25:92-9.

31.Liu KX,Li YS,Huang WQ,et al.Immediate but not delayed postconditioning  during reperfusion attenuates acute lung injury induced by intestinal  ischemia/reperfusion in rats:comparison with ischemic preconditioning.J Surg  Res2009;157:e55-62.

32.Liu KX,Li YS,Huang WQ,et al.Immediate postconditioning during reperfusion  attenuates intestinal injury.Intensive Care Med2009;35:933-42.

附图说明

图1R1对小肠I/R后大体损伤情况和72h生存率的影响。（A）R1的化学 结构。（B）各组大鼠小肠I/R后72h内生存率变化，R1前给药能减少I/R引起 的大鼠死亡。（C）各组大鼠空肠肠壁。（D）小肠I/R损伤的大体评分。R1前、 后给药均明显减轻再灌注所引起的肉眼损伤。数据表示为均数±标准误（n=10）。 *表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

图2R1对小肠I/R组织学损伤、白细胞浸润和凋亡的影响。（A）各组小肠 组织HE染色典型图，Bar=100μm。（B，C）各组小肠组织中MPO和CD68免疫 组织化学定位，箭头所指为阳性细胞，Bar=100μm。（D）TUNEL染色结果。1： 假手术组，2：I/R60min组，3：R1+I/R60min组，4：I/R60min+R1组， 5：I/R72h组，6：R1+I/R72h组，7：I/R72h+R1组。

图3各组小肠组织学损伤评分、白细胞浸润和细胞凋亡情况、组织MPO活 性及MDA含量。（A）小肠缺血再灌注后组织学损伤评分。（B，C）MPO、MDA免疫 组化阳性细胞定量。（D）TUNEL阳性细胞定量。（E）MPO活性测定。（F）小肠组 织中MDA水平测定。数据表示为均数±标准误（n=6）。*表示与假手术组相比P< 0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

图4R1对I/R后微静脉白蛋白渗出、管径、红细胞流速和血流量的影响。 （A）各组静脉白蛋白渗出典型图，Bar=100μm。（B）白蛋白渗出百分比定量。 （C，D）微静脉管径和红细胞流速变化。（E）小肠表面血流量情况典型图。（F） 小肠表面血流量定量。数据表示为均数±标准误（n=10）。*表示与假手术组相比 P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

图5三七皂苷R1对缺血再灌后小肠组织中IκBα和核NF-κB p65表达水 平的影响。再灌注60min（A）和再灌注72h（D）R1对IκBα表达量和核NF-κB p65转位影响的Western典型图。B、C、E、F中的光密度值代表四只大鼠的平均 水平。数据表示为均数±标准误（n=4）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表 示与缺血再灌注组相比P<0.05。

图6R1对I/R后血浆中细胞因子的影响。小肠缺血再灌后血浆中TNF-α、 IL-1β、IL-6和IL-10的水平与假手术组相比显著升高（A-D）。R1显著减少TNF- α、IL-1β、IL-6水平（A-C），增加再灌72hIL-10的水平（D）。数据表示 为均数±标准误（n=10）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注 组相比P<0.05。

图7三七皂苷R1对缺血再灌后小肠组织中能量代谢的影响。（A，B）R1对 小肠缺血再灌后组织中ADP/ATP和AMP/ATP变化比例的影响。（C，D）缺血再灌 后各组小肠中ATP5D表达情况。数据表示为均数±标准误（n=10）。*表示与假手 术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注组相比P<0.05。

图8三七皂苷R1对缺血再灌后小肠紧密连接蛋白的影响。再灌注60min（A） 和再灌注72h（E）R1对ZO-1,occludin and claudin-5表达量变化影响的 Western典型图。B、C、D和F、G、H为每种蛋白各自的光密度值分析数据表示 为均数±标准误（n=4）。*表示与假手术组相比P<0.05；#表示与缺血再灌注 组相比P<0.05。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

片剂

【处方】

三七皂苷R1 100g

微晶纤维素50g

微粉硅胶3g

硬脂酸镁1.5g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取三七皂苷R1、微晶纤维素，混 匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥， 取出，过30目筛整粒，加入微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000 片，即得。

实施例2

【处方】

三七皂苷R1 75g

微晶纤维素37g

微粉硅胶2.3g

硬脂酸镁1.1g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取三七皂苷R1、微晶纤维素，混 匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥， 取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制 成1000片，即得。

实施例3

【处方】

三七皂苷R1 133g

微晶纤维素66g

微粉硅胶4g

硬脂酸镁2g

【制法】取原、辅料分别过100目筛；取三七皂苷R1、微晶纤维素，混 匀，用60％乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，60℃干燥， 取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制 成1000片，即得。

实施例4

胶囊，取三七皂苷R1100mg，加入适量淀粉，硬脂酸镁等辅料，制粒，整 粒，装入1号胶囊，即得。

实施例5

口服液，取三七皂苷R1100mg，加入适量蔗糖，防腐剂，加水到1000ml，分 装成10ml一支，即得口服液。

实施例6

颗粒剂，取三七皂苷R1100mg，加入适量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒， 分装，即得。

实施例7

注射剂，三七皂苷R1150g加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸乙酯加热水 溶解，混匀，调pH值5-7。注射用水稀释至1000ml,用中空纤维膜滤过，灌装， 灭菌，即得。