选育富含番茄红素兼抗黄化曲叶病毒番茄新品系的方法

技术领域

本发明属于农业育种领域，特别涉及利用分子标记同时转育高番茄红素基因以及抗黄化曲叶病毒基因的番茄育种方法。 

背景技术

番茄是世界上重要且具有高经济价值的农作物之一，是世界上年产量最高的蔬菜作物之一。利用传统育种方法已经培育了许多具有优异性状的栽培品种，如抗多种病害、抗逆性、耐贮运以及营养强化型番茄品种等。在现代社会，一个十分令人感兴趣的性状是研发能够对人类可赋予保健功能的次生代谢物。番茄中含有多种具有抗氧化功效的胡萝卜素类，对人体具有极强的保健作用。流行病学研究表明，番茄红素可以减少一些癌症与心脏病发生的功效。番茄红素作为天然类胡萝卜素家族的一员，不仅使得许多果实呈现红色，而且是一个强抗氧化剂以及自由基清除剂。在所有的植物类胡萝卡素中，番茄红素清除单线态氧的能力最高，是目前常用的抗氧化剂维生素E的100倍。番茄红素集中分布在多种人体组织中，例如肺，肾上腺以及脂肪组织，前列腺等。流行病学研究表明，番茄红素能降低患肺癌、胃癌、前列腺癌的危险性，并能降低胰腺癌、结肠癌、食管癌，口腔癌和子宫癌的危险（Givannucci，1995）。人体血清中番茄红素的浓度与胃肠道癌、前列腺癌、膜腺癌、宫颈癌等的发生率呈负相关。但人体自身不能合成番茄红素，番茄果实及其制品是人类摄取番茄红素的主要来源。但遗憾的是，在普通番茄中类胡萝卜素的含量很低，例如番茄红素在鲜食番茄中的含量一般只有50-70 mg/kg鲜重，最优良的加工番茄品种的番茄红素含量也只达到l50 mg/kg鲜重。由于番茄栽培品种类胡萝卜素含量的变化很有限，而且类胡萝卜素含量与果实鲜重呈负相关，所以过去多年传统育种，尽管果实产量有很大提高，果实大小也加大，但类胡萝卜素含量没有提高，部分品种甚至下降。由于番茄属中95％的遗传变化是在栽培种之外的其他种中发现的。在野生种以及突变体中发现了许多有利的性状，例如，高番茄红素、高可溶性固形物及高硬度等特性。所以利用番茄近缘种以及突变体具有非常大的潜力。 

在番茄中存在着诸如深红色番茄之类的高色素含量的突变体，近几年也分离了一些编码胡萝卜素生物合成相关酶的基因，但由于缺乏植物是如何调控番茄红素生物合成的知识，所以直至今日，对于提高番茄果实的类胡萝卜素含量进展很少。在番茄中存在几个光超敏突变体，其中含有隐性单基因的高色素突变体（Hp-1与Hp-2）以及深绿色突变体（dg）对于光照条件具有非常高的敏感性。这些突变体中果实色素明显增加，据鉴定，果实中类黄酮与类胡萝卜素含量明显提高，而在成熟红色果实中主要为番茄红素。隐性基因hp-l和hp-2分别位于番茄第2条和第1条染色体上，具有调节光合色素信号传递的能力，在纯合状态下分别能使番茄果实的类胡萝卡素总量提高20%-40%左右。但hp-l 和hp-2突变体的形态特征非常相似，而且容易受到显性等位基因的抑制。Dg番茄突变体在表现型上同其它hp突变体相似，但是由于叶绿素含量较高，因而具有更深的绿色果实。通过多代等位基因实验证实，番茄突变体dg与hp-2属于等位基因（Levin et al. TAG, 2003, 106: 454-460），位于番茄染色体1上，是HP-2的一个等位基因，其被鉴定为DET1基因。相对于定位于C-末端的hp-2突变体，dg突变体定位于蛋白质的N-末端，表明该基因的两端对其功能均十分重要。Hp与dg突变体均表现为在幼果期有较高的花青素水平，较短的子叶，同野生型相比成熟果具有明显较高的果实色素。 

具有hp与dg突变体可以直接应用于农业生产中作为鲜食或者富含番茄红素的补助食品。含有dg突变体的材料比含有Hp的材料番茄红素含量更高，因而其更加适合于作为高番茄红素的育种材料。但是，该类型的突变体并没有在生产中广泛应用，原因在于其具有多态性，许多不利的性状同dg突变体连锁。【Sacks and Francis，J Amer Hort Sci, 2001, 126(2): 221-226】。所以培育去除不良累赘的，具有丰富含量的番茄红素番茄新品种具有良好的市场前景。 

另一方面，近10年来，烟粉虱传播的双生病毒已经发展成为我国南方地区番茄生产的限制因子，同样地，在北方，随着设施生产的发展，由双生病毒引起的番茄疾病，尤其是番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）也日益猖獗。通过烟粉虱，TYLCV可以迅速进入番茄中，一旦进入植物体内就会大量复制并传遍整个植物体。该病具有爆发突然、扩展迅速、危害性强、无法治疗的特点，是一种毁灭性的番茄病害，植株一旦发病，尤其是在开花前发病，果实产量及商品价值均大幅度下降，严重时造成的损失可达100%。化学方法控制烟粉虱是一种有效地方法，但是商业上杀虫剂的滥用使得烟粉虱产生抗性，并且诱变出20种不同的番茄侵染性病毒。就像化学杀线虫一样，由于TYLCV对杀虫剂产生抗性以及对过量使用杀虫剂对公众健康的考虑。所以抗性品种的选育依然是控制番茄黄化曲叶病毒病的重要方法。 

Cohen于1964年首次报道了一些抗性基因型，随后鉴定出L. pimpinellifolium 和L. peruvianum 含有对TYLCV具有极高抗性的基因。在1990's，Pilowsky 和Cohen (2000)报道了L. peruvianum的抗性，其具有5个相关的隐性基因。其中Ty-3是最新报道的TYLCV抗性基因。Ji等(2007)将Ty-3基因定位于第6染色体长臂上(cLEG-31-P16(20cM)和T1079(27cM)之间。LA4440是L. Chilense中LA2779的渐渗系，令人感兴趣的是，该品系兼抗TYLCV 和ToMV，抗性区域不仅包括Ty-3还包含Ty-1 (Agrama and Scott, 2006)， 两者间的遗传距离仅30 cM。在一个基因型中同时存在Ty-1 和Ty-3 基因可能提供更高的抗性。这就为我们培育具有多个抗性位点的番茄新种质提供了可能性。 

发明内容

针对市场上缺乏具有TYLCV抗性的高品质番茄品种，而利用传统技术难以对高色素基因dg与抗病基因Ty进行聚合，同时去除不利农艺性状的连锁累赘的问题。 

一种选育富含番茄红素兼抗黄化曲叶病毒番茄品系的方法，聚合了高色素基因dg与TYLCV抗性基因Ty-3。 

包括以下步骤： 

  1）筛选隐性突变基因dg特异性分子标记；

  2）筛选抗黄化曲叶病毒病基因Ty-3的连锁分子标记；

  3）将含有TYLCV抗性基因以及高番茄红素突变体基因dg的番茄材料与普通番茄优良自交系杂交，并通过多代自交，以dg与Ty-3分子标记为依据筛选单株，获得聚合dg与Ty-3基因的番茄自交系。

所述的番茄自交系至少包含一个高色素基因dg并含有一个TYLCV抗性等位基因。 

所述的番茄自交系在于产生的番茄果实番茄红素平均含量至少是目前商业品种的2倍，且该品种适合于大规模商业化生产应用。 

所述的番茄品系为非转基因植株。 

所述产生的番茄自交系，或将其与其它番茄品系杂交获得的杂交种，包括植株，果实、种子以及植株的任何部分。 

本发明的有益效果: 

（1）在近十年中，纯化的番茄红素广泛地作为天然的红色素以及营养补助剂应用，其需求急剧增加。目前发明提供的高番茄红素番茄果实特别适合于满足上述需求。果实平均番茄红素含量至少是目前商业品种的2倍。在我们的发明中，获得的稳定自交系番茄果实番茄红素含量可以达到180 ppm以上，而用其配制的杂交组合番茄果实番茄红素含量至少是160 ppm。先前也有报道将dg基因整合进商业化的品种中，但是据我们所知，这是第一次报道选育利用dg基因纯合的商业化品种，并且能够保持商业化品种相类似的园艺学性状 。

（2）本发明利用等位基因的特异性PCR分子标记技术开展早期筛选，技术简单、快速、重复性好。可以准确地确定杂交后代单株中含有Ty抗性基因和高番茄红素基因的纯合状态，从而筛选出同时含有Ty-3和dg基因纯合的单株，在短时间内实现这两个基因的聚合和纯化，进而选育出番茄红素含量大幅度提高的并且抗TYLCV番茄新品种。 

（3）本发明的另一个优势是利用分子标记技术来整合了Ty抗性基因和高番茄红素基因dg，从而使得选育的富含番茄红素的新品种具有较强的TYLCV抗性，有利于新品种的推广应用。 

具体实施方式

鉴于黄化曲叶病毒病发生的普遍性以及危害的严重性，培育高番茄红素含量的番茄品种，必须兼具TYLCV综合抗性，才有市场推广应用可能。但是采用常规技术很难把它们聚合在同一个基因型中。利用分子标记技术可以有效地鉴别目标基因，实现目标基因的累加和聚合。本方法是以dg与Ty特异性分子标记筛选为核心，以分子标记辅助选择为基础，把dg与Ty聚合在不同的番茄自交系中，培育出番茄红素含量大幅度提高的番茄新品种，且该品种兼抗黄化曲叶病毒病，具有非常广阔的市场前景和巨大的经济效益。 

本发明旨在利用分子标记选育富含番茄红素兼具TYLCV抗性番茄品系，该品系可供鲜食或作加工番茄。该品系聚合了高色素基因dg与TYLCV抗性基因Ty-3，其果实所含的番茄红素含量至少是目前主栽商业品种的两倍。 

本发明涉及可供商业化新品系，以满足市场多方面的需求，包括较好的农艺性状，较高的作物产量，抗TYLCV，较高的营养价值以及良好的商品性等。特别是，本发明涉及产生高番茄红素的番茄品种。这些果实不仅在鲜食市场广泛需求，而且可用于番茄加工工业上或作为高纯度番茄红素来源。 

本发明提供了dg同源纯合突变体类型的番茄品种。正如以上描述，含有dg突变体番茄主要特征在于深绿色的幼果，而对于成熟期果实，由于较高的番茄红素含量，又变为深红色。含有dg突变体的基因番茄植株，甚至dg同源纯合的番茄植株以前均有报道，但是由于其多效性影响，包括了许多不利的农艺性状，阻碍了其在番茄育种上的广泛应用。目前的发明开发了新的硬果型杂交番茄品种，具有dg纯合同源基因，含有非常高的番茄红素含量，并且可以避免不利性状的连锁累赘。 

商业杂种的选育首先需要获得纯合的稳定亲本。在育种项目中，将2个或更多个种质或基因池中存在的多个目标性状聚合到优势育种品种中。需要的自交系或亲本系通过连续的自交与选择最好的育种系，有时会利用分子标记加快选育过程。 

本发明提供了dg同源纯合突变体类型的番茄品种。正如以上描述，含有dg突变体番茄主要特征在于深绿色的幼果，而对于成熟期果实，由于较高的番茄红素含量，又变为深红色。 

本发明提供了番茄种子含有同源的dg突变体，从该种子生长的番茄果实含有的番茄红素含量是目前商业品种的2倍以上，并且去除了同dg突变相关的不利性状。这些不利的性状包括：发芽率低，根系通变浅，茎变脆，叶片变薄或脆；未熟落叶，低产以及小果。 

根据目前发明所指，一个是稳定的亲本材料，另一个包括配制的F1代杂交种。稳定亲本材料是指能够开放授粉的自交系，目标性状通过多轮自交与种植以后还是稳定的。 

本发明包括以下步骤： 

(1) Dg隐性突变纯合基因型的鉴定

本发明提供了一套实验室分子标记鉴定结合田间实验观察方法鉴定Dg隐性突变纯合基因型的方法。利用本发明筛选获得的一对Caps引物分析番茄品系或单株的基因型。用于Dg隐性突变纯合基因筛选的PCR扩增引物对, 正向引物：Det1F: 5'- TTC ACT AAC AAT GTT ACC GC -3'; 与反向引物Det1R: 5' CAC TAA ACC GTC ATC CGT GAA- 3'。回收DNA片段，利用AclI酶切后在1%琼脂糖凝胶上电泳。根据不同的条带结果即可以区分dg/dg纯合还是杂合的基因型。

上述筛选获得的植株种植于人工气候室内用于进一步地鉴定与评价综合性状。人工气候是条件控制在26oC温度，80%湿度，90%光照条件下，尤其重要的是要求光源覆盖以黄色膜，以滤去500 nm以下的光谱。在这样光谱生长的植株可以强化同dg突变相关的光形态建成表现型，包括较短的且深绿色的茎。这样，可以非常容易地选择dg同源的植株。 

（2）利用TYLCV抗性试验筛选抗病资源。TYLCV抗性试验筛选指的是：在自然状态下种植一些植株，在这种环境下黄化曲叶病毒自然进行侵染，使用0-4的侵染指数来对植株的感病情况进行一次或多次评定。 

（3）抗黄化曲叶病毒病基因Ty-3连锁分子标记的筛选 

本发明筛选了一个同Ty-3紧密连锁的CAPs分子标记，可用于早期鉴定具有Ty-3 抗性的番茄种质以及分离单株，而且可以区分Ty-3与Ty-3a两个不同来源的TYLCV抗性基因。Caps引物对为：正向引物Ty3F: 5'- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3'; 与反向引物Ty3R: 5' TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3'。扩增后的DNA通过TaqI酶切后能较好地区分感病类型（ty-3）, 抗病类型Ty-3与Ty-3a等不同类型，并从中筛选出纯合的Ty-3/Ty-3或Ty-3a/Ty-3a植株类型。

（4）用于筛选稳定自交系的杂交组合配置。目前发明中亲本来源于含有dg突变体的普通番茄（S. lycorpericum cv Manapal）自交系以及具有稳定的TYLCV抗性的S. Chilense渐渗系。通过上述杂交获得的F1群体，通过自交获得不同的F2群体。 

F2群体后代在人工气候室26oC，80%湿度，90%光照条件下，在黄色膜下（滤去500 nm以下的光谱）。该光谱可以强化同dg突变相关的光形态建成表现型包括较短的且深绿色的茎。这样，可以非常容易地选择dg同源的单株。 

在该群体中，会出现16种基因型，其中1/4是dg突变体同源的, 1/4是Ty-3/Ty-3类型。分别利用上述高番茄红素基因dg与抗TYLCV病毒的连锁分子标记进行检测，从自交后代中剔除杂合基因型，选择同时出现这2个基因分子标记的个体，即含有纯合的高番茄红素基因dg/dg与抗TYLCV病毒基因Ty-3/Ty-3或Ty-3a/Ty-3a。 

(5) 稳定自交系的培育 

 上述选择的dg/dg秧苗进一步生长在温室中。在生长时期打掉所有侧枝以强化不利连锁影响的表现（包括脆茎，脆薄的叶片，浅根系统，小果以及低产等）。从后代单株中选择具有最少不利连锁影响性状的单株进行自交，获得F3代种子。

在选择单株时，高番茄红素基因dg/dg与抗TYLCV病毒基因Ty-3/Ty-3或Ty-3a/Ty-3a通过特定的PCR分子标记进行证实。同时将F3种子种植在人工气候室内进行dg连锁性状的评价。选择具有较短节间长度且叶色深绿的幼苗，让其自交，果实完全成熟时采收。 对于每个株系主要检测如下项目，包括：叶色，叶绿素含量，根系体积，活力，果实大小以及产量，番茄红素含量，总可溶性固形物。选择具有较高番茄红素含量并兼具其它优良性状的单株选择进行自交授粉，获得F4代种子。 

F4代种子播于人工气候室内。利用上述方法进行苗期鉴定以及优良植株鉴定。基因组DNA从幼苗分离，dg基因和Ty-3/Ty-3或Ty-3a/Ty-3a基因利用特异性的PCR标记进行分析。通过上述筛选的植株所产生的番茄果实具有较高的番茄红素含量，兼抗黄化曲叶病毒，并且表现为较低的dg不利连锁影响。F4代自交后筛选获得稳定的目标自交系 

（6）商业化F1杂种的配制

以上述 dg基因以及Ty-3/Ty-3纯合的稳定株系选择作为亲本材料。这些亲本植株表现为正常的生长模式，有着发达根系以及健康的叶片，产生的果实含有番茄红素含量超过200 ppm。利用这些株系与另外商业化育种产生了200 个F1杂交种。F1杂交种于2006年种植在浙江大学实验农场。植株自我授粉直至成熟，测定其中果实番茄红素含量。8个杂交种被证实含有高番茄红素（大于160 ppm）, 并有正常的生长模式。

配制杂交种的亲本进一步自交，筛选园艺性状优良的单株，再进行杂交配制F1。选择番茄红素含量大于160 ppm，并且没有任何不利连锁性状的F1作为入选组合。鉴定为综合性状优良的植株作为本发明的亲本。对于所有性状亲本是均一的并且稳定的。它们进一步自交然后种植产生足量的下一代，进一步评价其植株类型的均一性和性状稳定性。这些稳定的亲本植株可以被用于产生杂交种。值得说明的是，番茄红素含量高于160 ppm是指某一个作物的平均含量，可能会在不同生长环境、栽培模式以及果实成熟阶段等密切相关。 

由于F1杂交种在植株生长势、生长适应性等方面具有更强的稳定性。目前发明也提供了产生一代F1杂种番茄种子的方法。根据一个实施例，包括杂交一个第一个稳定的亲本与第二个亲本杂交，收获产生的杂交F1代种子。而且这第一个和第二个亲本在dg突变上是同源的，并且避免同dg突变连锁的不利影响。 

根据一个实施例，目前发明也包括上述杂交的F1代杂种植株。杂种植株在不同的地区以及不同的季节种植。在所有实验条件下，高番茄红素的F1代植株至少具备同商业化品种相同的生长势以及果实产量与商品性等，同时其产生果实的番茄红素含量至少是目前商业品种的两倍。 

目前发明包括稳定的亲本材料或杂交种任何部分，包括花粉、子房以及从这些植株中产生的后代。另外方面，本发明提供的高番茄红素番茄果实。果实可以提供给鲜食市场也可以提供加工类型高番茄红素番茄产品高纯度的番茄红素。番茄与番茄制品的消费增加，增加了人们对番茄有益性的认识。 

实施例

发明的原理与过程通过下述实施例详细说明。 

（1）黄化曲叶病毒病(TYLCV)抗性鉴定方法 

该程序介绍一种番茄植株对TYLCV抗性、中抗以及感病的鉴定方法。 

植株生长在田间通过烟粉虱进行天然接种。在天然的高发地块大田种植接种本地病毒鉴定植株抗性是一个优先选择的方法。在田间观察接种后植株的发病症状，统计病情指数。TYLCV病毒病的病症通常分为0-4级。0级：无症状；1级：叶片轻微发黄；2级：叶片明显发黄，并且出现卷叶；3级：植株发育迟缓，叶片严重发黄且卷曲；4级：植株发育严重迟缓，具有发黄的、卷缩的小叶。 

当一个番茄品种或株系平均发病指数在0-1级的，即可鉴定为其对TYLCV具有抗性；中度抗性平均发病指数大约为2；而敏感型的病情指数均在3以上。 

（2）大批量测定番茄红素含量 本发明利用高效液相色谱（HPLC）法分析番茄红素含量。 

番茄红素从新鲜成熟的番茄果实的果皮组织中抽提。果皮组织切碎后打成匀浆。分析时取10 g番茄样品，于研钵中捣碎，磨成糊状匀浆。 准确称取1g匀浆(准确到0.01g), 加入到棕色试剂瓶中, 每瓶加入抽提缓冲液20 ml。抽提缓冲液组成为正己烷：异丙醇：丙酮（体积比2:1:1） 以及 0.05% (W/V)BHT。棕色瓶置于冰上,在摇床上180 rpm×15 min.每瓶再加入3 ml蒸馏水，再置于摇床摇5 min (冰浴)。整个操作保持低温及避光条件。取提取液20 ml，在旋转蒸发仪上蒸干，用1 mL乙酸乙脂溶解，过滤后分析。 

移取等量的样品, 注入HPLC系统.设置初始参数为:色谱柱，RP C18柱; 吸收波长：472 nm; 流动相为：V(乙腈)∶V(二氯甲烷)∶V(甲醇)为7∶2∶7; 体积流量，0.9mL/min; 柱温：室温；进样量: 10 μL。根据472 nm下的吸光度计算番茄红素含量。 

（3）Dg隐性突变纯合基因型的鉴定 

Dg基因定位在第一染色体上，是去黄化基因( DET) 的同源基因。同野生型相比，在DET1基因第二外显子一个单碱基从A变为T碱基。结果使得一个保守的天冬酰胺Asp氨基酸变成了异亮氨酸Iso氨基酸。同时该突变使得dg突变体不能被AclI限制性内切酶不能裂解。根据DET基因突变位点附近的序列设计PCR扩增引物，用于扩增番茄DET1基因同源dg突变位点连锁的DNA片段。正向引物：Det1F: 5'- TTC ACT AAC AAT GTT ACC GC -3'; 与反向引物Det1R: 5' CAC TAA ACC GTC ATC CGT GAA- 3'。

扩增反应体系：25 μl总反应体积，包括10 ng DNA模板, 0.2 mM dNTP, 10 ng引物以及1 U Taq DNA酶。反应程序： 94oC，1 min预变性后, 30次循环反应包括94oC变性1 min, 55oC退火1min, 72oC 延伸1.5 min, 反应结束后72 oC 延伸3 min. 回收DNA片段，利用AclI酶切后在1%琼脂糖凝胶上电泳。     

（4）抗黄化曲叶病毒病基因Ty-3连锁分子标记的筛选

Ty-3是最新报道的TYLCV抗性基因。LA4440是L. Chilense中LA2779的渐渗系，该品系兼抗TYLCV 和ToMoV，抗性区域不仅包括Ty-3还包含Ty-1， 两者间的遗传距离仅30 cM。在一个基因型中同时存在Ty-1 和Ty-3 基因可能提供更高的抗性。这就为我们聚合多个TYLCV不同效应的抗性基因，培育具有多个抗性位点的番茄新种质提供了可能性。其中位于第六染色体上的Ty-3区间可以解释65%的TYLCV抗性变异。通过该25 cM区间序列分析可以发现，有3个Ty-3位点。Ty-3以及Ty-3a均同抗双生病毒的抗性株系连锁，而ty-3同感病植株连锁。进一步分析发现，在Ty-3与Ty-3a植株类型中在BAC clone AY678298从171300-173050的位置存在着多个SNP差异标记。野生型（ty-3）在该区域无Taq I 酶切位点，而抗性突变体Ty-3类型有1个TaqI酶切位点，Ty-3a类型有2个Taq I酶切位点。根据以上序列，成功设计了一对Caps引物，可以清楚地扩增单一条带，通过酶切后能较好地区分以上三种类型，筛选出纯合的Ty-3/Ty-3或Ty-3a/Ty-3a植株类型。正向引物：Ty3F: 5'- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3'; 与反向引物Ty3R: 5' TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3'。反应体系：总体积25 μl,包括2.5μl 2.5mM 5 μl water, 2.5 μl 2.5 mM dNTPs, 5 μl 5× buffer, 2.5 μl 2.5 mM MgCl₂, 0.1 μl (0.5 units) Taq DNA polymerase, 2.5 μl 10 μM正向引物, 2.5 μl 10 μM反向引物以及5 μl DNA 抽提物。PCR 反应程序： 94 oC 变性3 min, 33次循环包括94 oC 变性30 s, 55 oC 退火1 min, 72 oC延伸1.5 min. 最后72 oC保持10 min. PCR扩增产物利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离. 电泳显示利用该对引物在不同基因型中均可扩增800-bp左右的一条清晰条带。 

酶切反应体系：10 μl PCR 反应混合物， 0.25 μl BSA, 1 μl TaqI restriction enzyme, 3 μl buffer, 再加上11 μl ddH₂O, 至25 μl的反应总体积。在65oC水浴锅温浴3 h. 再利用1.8%琼脂糖凝胶电泳。结果显示酶切后野生型植株还是仅有一条800 bp条带，而Ty-3植株类型有两条条带，分别为500 bp与300 bp左右,Ty-3a类型植株可以出现3条电泳带，分别为500 bp，250 bp与60 bp。 

（5）聚合dg和Ty-3基因到同一个基因型中 

利用含有纯合dg基因的高番茄红素自交系例如LA3005（美国番茄种质资源库）为母本，以含有Ty-3抗性基因的野生番茄S. Chilense LA2779的渐渗系LA4440为父本杂交，获得同时具有Ty-3抗性基因以及高番茄红素基因dg的杂合体F1代，通过上述杂交获得的F1群体，通过自交获得不同的F2群体。

F2后代在人工气候室26oC，80%湿度，90%光照条件下，在黄色膜下（滤去500 nm以下的光谱），这些光可以强化同dg突变相关的光形态建成表现型包括较短的且深绿色的茎。这样，可以非常容易地选择dg同源的单株。 

在该群体中，会出现16种基因型，其中1/4是dg突变体同源的, 1/4是Ty-3/Ty-3类型。分别利用上述高番茄红素基因dg与抗TYLCV病毒的连锁分子标记进行检测，从自交后代中剔除杂合基因型，选择同时出现这2个基因分子标记的个体，即含有纯合的高番茄红素基因dg/dg与抗TYLCV病毒基因Ty-3/Ty-3。 

(6) 高番茄红素含量并抗番茄黄化曲叶病毒病优良自交系的选择 

上述选择的dg/dg秧苗进一步生长在温室中。在生长时期打掉所有侧枝以强化多效性影响的表现（包括脆茎，脆薄的叶片，浅根系统，小果以及低产等。选择最小多效性影响的植株进行自交，并留下F3代种子。

通过特定的PCR分子标记，筛选含有番茄红素基因dg/dg与抗TYLCV病毒基因Ty-3/Ty-3的植株。 

上述选择的20个F3种子种植在温室内（90%光密度，并覆以黄色塑料膜，26oC温度，80%湿度）。选择具有较短节间长度且叶色深绿的幼苗，让其自交，果实完全成熟时采收。 对于每个株系主要检测如下项目，包括：叶色，叶绿素含量，根系体积，活力，果实大小以及产量，番茄红素含量，总可溶性固形物。选择具有较高番茄红素含量并兼具其它优良性状的单株选择进行自交授粉，获得F4代种子。 

F4代种子播于人工气候室内。利用上述方法进行苗期鉴定以及优良植株鉴定。基因组DNA从幼苗分离，dg基因以及Ty-3/Ty-3基因利用特异性的PCR标记进行分析。通过上述筛选的植株所产生的番茄果实具有较高的番茄红素含量，抗黄化曲叶病毒病，并且表现为较低的dg不利连锁影响。F4代自交后筛选获得的目标自交系 

（7）商业化F1杂种的配制

为了获得更好的优势商业品种，上述自交系同有价值的商业化育种材料杂交。选择综合性状最好的单株杂交获得F1杂交组合。

以上述 dg基因以及Ty-3/Ty-3纯合的稳定株系选择作为亲本材料。Dg突变体利用dg探针的PCR反应证实以及Dg突变体的表现型进行鉴定。Ty-3/Ty-3基因利用PCR分子标记鉴定。黄化曲叶病毒病抗性鉴定在田间和实验室同时进行。 这些亲本植株表现为正常的生长模式，有着发达根系以及健康的叶片，产生的果实含有番茄红素含量超过200 ppm。利用这些株系与另外商业化育种材料配制200 个F1杂交种。F1杂交种于2006年种植在杭州市农业科学院蔬菜研究所实验农场。植株自我授粉直至成熟，测定其中果实番茄红素含量。8个杂交种被证实含有高番茄红素（大于180 ppm）, 并有正常的生长模式。 

配制该8个组合的亲本材料自交后种植，获得足够数量的后代作为稳定的亲本种子。 8个组合利用稳定的亲本株系杂交产生，并进行田间比较试验。2007年在浙江省的衢州、温州、湖州等3个地区进行区试，8个组合的果实生长动态、果实商品性、产量等性状与商业化品种相近。但是番茄红素含量却大幅度提高，平均为180 ppm。该平均番茄红素含量是从不同地区检测的番茄果实平均含量，其中最高的番茄红素含量达到230 ppm。