克伦巴胺适配体与检测克伦巴胺的适配体电化学生物传感器

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及一种克伦巴胺适配体以及检测克伦巴胺的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。 

背景技术

克伦巴胺(Phenylethanolamine，PHL)，化学命名为2-[4-(4-硝基苯基)丁基-2-氨基]-1-(4-甲氧基苯基)乙醇，又名苯乙醇胺A，分子量为344.17，分子式C₁₉H₂₄N₂O₄，是一种人工合成的化学物质，化学结构式如下： 

克伦巴胺是福莫特罗的同分异构体，具有同瘦肉精和莱克多巴胺相同的作用和效果，属于β-激动剂的一种，具有营养再分配作用。2010年12月，我国农业部将克伦巴胺列入禁止在饲料和动物饮用水中使用的物质名单，因此，建立饲料中克伦巴胺的快速检测技术十分重要。由于克伦巴胺是在我国首先发现的一种新“瘦肉精”，目前国外尚无关于克伦巴胺检测方法的报道。国内也只有少数研究报道了应用液相色谱-串联质谱法检测饲料和猪肉中克伦巴胺，超高效液相色谱法测定饲料中克伦巴胺，我国2010年底颁布的检测标准《饲料中苯乙醇胺A的测定》(农业部1486号公告-1-2010)也采用了高效液相色谱-串联质谱法β-激动剂类残留检测方法的研究。由于液相色谱-串联质谱仪价格昂贵，在一般的检测机构普及率不高。因此，建立一种快速、灵敏、低成本的克伦巴胺检测技术具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于克伦巴胺含量快速检测的生物传感器及其组装方法。该生物传感器灵敏度更高，响应时间更快，并且可快速用于克伦巴胺检测。 

本发明的第一个目的是提供一种克伦巴胺适配体。 

本发明所述的克伦巴胺适配体为含有GCGTAGCTACTCATAT序列、长度为20-25个碱基的单链DNA探针，且3’端修饰了3’-NH₂-(CH₂)₇-。 

本发明的第二个目的是提供一种检测克伦巴胺的适配体电化学生物传感器。 

本发明所述的检测克伦巴胺的适配体电化学生物传感器，含有本发明所述的克伦巴胺适配体。 

本发明的第三个目的是提供一种适配体电化学生物传感器的制备方法。 

本发明所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤： 

(1)裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极； 

(2)活化电极的适配体修饰：合成如本发明所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤(1)所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。 

本发明的第四个目的是提供一种本发明所述的适配体电化学生物传感器的用途，即将本发明所述的适配体电化学生物传感器用于克伦巴胺的检测。 

本发明的第五个目的是提供一种检测克伦巴胺的方法，该方法是基于本发明所述的适配体电化学生物传感器的检测方法。 

本发明所述的适配体电化学生物传感器的检测克伦巴胺的方法，包括以下步骤： 

(1)对克伦巴胺标准溶液进行检测，建立标准曲线： 

将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极； 

将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然 后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的含0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0； 

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0pg/mL的克伦巴胺水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的克伦巴胺，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的含0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到浓度为1.0pg/mL的克伦巴胺标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1； 

同理，将上述修饰电极依次放入浓度5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克伦巴胺标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn(n＝2,3…7)，并计算各标准液相对初始的适配体电化学生物传感器的阻抗变化值△Ret，△Ret为各标准液对应的阻抗值Retn(n＝1,2,3…7)减去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0； 

以浓度为1.0pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克伦巴胺标准液浓度的对数为横坐标，以这7种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图，建立标准曲线； 

(2)对含克伦巴胺的样品溶液进行定量检测： 

根据农业部1486号公告-1-2010所述方法对样品中的克伦巴胺进行提取纯化；将得到的克伦巴胺干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测； 

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从样品溶液中提取纯化得到的克伦巴胺水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到样品中克伦巴胺溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets； 

通过步骤(1)建立的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的克伦巴胺浓度，即为样品中克伦巴胺的浓度。 

本发明的有益效果在于： 

(1)提供了一种对目标克伦巴胺非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。 

(2)基于该适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将克伦巴胺目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰。 

(3)本发明利用电化学传感技术构建了一种新型的快速检测克伦巴胺的技术，该技术是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。本发明采用可特异性识别克伦巴胺的核酸适配体应用于电化学传感器，大大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性。 

附图说明

图1为本发明所述的克伦巴胺适配体修饰电极在不同浓度克伦巴胺标准溶液中检测的交流阻抗图谱。 

图2为本发明所述的克伦巴胺适配体修饰电极在不同浓度克伦巴胺标准溶液中检测的信号变化趋势图。 

图3为本发明所述的克伦巴胺适配体修饰电极在克伦巴胺标准品溶液检测得到的标准曲线图。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步地描述。 

实施例一：适配体电化学生物传感器的构建 

(1)裸金电极表面的抛光及活化处理 

将裸金电极用0.3μm的氧化铝粉末打磨10分钟，再用0.05μm的氧化铝粉末打磨20分钟，然后用超纯水超声清洗2次，每次5分钟，彻底去除非特异性吸附在裸金电极表面的氧化铝粉末。将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液(浓硫酸:30％H₂O₂＝7:3，V:V)于室温下活化10分钟，得到活化的裸金电极。然后分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次，每次5分钟。 

(2)适配体电化学传感器的修饰 

取2μL浓度100μmol/L的克伦巴胺适配体溶液加入到98μL浓度1mol/L的NaCl溶液中，配制成2μmol/L适配体组装液，转入50mL离心管中；将步骤(1)抛光活化处理后的裸金电极放入50mL离心管并浸入适配体组装液中，密封后，4℃下组装24小时，即得到克伦巴胺核酸适配体修饰的电极。 

克伦巴胺核酸适配体序列从5’端到3’端的核酸序列如：GGCGTAGCTACTCATATCTT(SEQ ID NO.1)，3’端修饰了3’-NH₂-(CH₂)₇-。 

浓度100μmol/L的克伦巴胺适配体溶液是3’端修饰了3’-NH₂-(CH₂)₇-的DNA适配体探针溶液。 

实施例二：克伦巴胺适配体电化学生物传感器对克伦巴胺标准溶液的电化学响应 

(1)将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极。将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率：0.1-1.0×10⁵Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0。 

(2)将步骤(1)所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0pg/mL的克伦巴胺水溶液中，室温孵育反应15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的克伦巴胺，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中。交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率：0.1-1.0×10⁵Hz，得到浓度1.0pg/mL的克伦巴胺标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1。 

(3)同理，将步骤(2)所述的适配体电极依次放入浓度5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克伦巴胺标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn(n＝2,3…7)。 

(4)计算步骤(2)与步骤(3)中各标准液相对步骤(1)中适配体电化学生物传感器的阻抗变化值△Ret，△Ret为各标准液对应的阻抗值Retn(n＝1,2,3…7)减去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0。 

以浓度为1.0pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克伦巴胺标准液浓度的对数为横坐标，以这7种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图，建立标准曲线(见图1)。如图2所示，随着克伦巴胺浓度的增加，响应信号Ret呈现出先增后降的趋势。在1.0pg/mL-5.0×10²pg/mL浓度范围内，阻抗随克伦巴胺浓度增加而降低，△Ret与克伦巴胺浓度的对数呈现很好的线性关系(R²＝0.9924)，线性方程为△Ret(Ω)＝-4.6×10²lgC(pg/mL)–3.4×10²(见图3)，检测限为1.0pg/mL。 

实施例三：对饲料进行测定及回收率实验： 

饲料样品的处理：取2.00g饲料样品，加入不同浓度的克伦巴胺，根据农业部1486号公告-1-2010所述方法对样品中的克伦巴胺进行提取纯化。将得到的克伦巴胺干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测。 

将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆](1：1)电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，交流阻抗分析，初始电位0.22V，频率：0.1-1.0×10⁵Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0。 

将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从饲料样品溶液中提取纯化得到的克伦巴胺水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]为1：1的，含浓度0.1mol/L KCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×10⁵Hz，得到饲料样品中克伦巴胺溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets。通过实施例二建立的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的克伦巴胺浓度即为实际样品中克伦巴胺的浓度。测试结果如表一所示。所测得样品的相对标准偏差在3.4％～5.9％之间，加标回收率在92.0％～95.3％之间，平均回收率为93.9％。 

表一：饲料中克伦巴胺含量的测定结果 

实施例四：基于不同的适配体构建的电化学生物传感器 

在上述实施例一至四中，通过实验验证了基于序列为SEQ ID NO.1的克伦巴胺核酸适配体构建的电化学生物传感器在检测克伦巴胺样品的效果。 

进一步的实验表明，在SEQ ID NO.1即GGCGTAGCTACTCATATCTT中，核心序列是GCGTAGCTACTCATAT，而其他碱基可以任意搭配，只要符合长度为20-25个碱基的要求。表2是实验中设计的一系列适配体及其实验结果： 

表2：克伦巴胺适配体 

注：上述SEQ ID NO.2至10是专门设计的极端序列，在序列GCGTAGCTACTCATAT的两端加上连续的A或G或C或T碱基，通过实验表明这些序列的检测灵敏度与随机设计的SEQ ID NO.1的相当，证明以序列GCGTAGCTACTCATAT是关键序列，可以其他碱基可以任意搭配为克伦巴胺适配体，序列长度符合20-25个碱基即可。